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神经科学杂志。2009年5月27日；29(21): 7003–7014.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.1110-09.2009
预防性维修识别码：PMC2712132型
NIHMSID公司：NIHMS117800
PMID：19474327

STAT3对小鼠脑缺血后Mn-超氧化物歧化酶活性的调节及神经保护作用

朱恩贞（Joo Eun Jung）,1,2,三，* Gab Seok Kim先生,1,2,三，* Purnima Narasimhan公司,1,2,三 尹世松（Yun Seon Song）,1,2,三和Pak H.Chan先生通讯作者1,2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

脑缺血和再灌注增加了超氧阴离子（O2·−)脑线粒体中的锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD；SOD2）是一种主要的线粒体抗氧化酶，可清除超氧化物自由基，其过表达可提供神经保护。然而，Mn-SOD在脑缺血再灌注过程中的表达调控机制尚不清楚。在本研究中，我们鉴定了信号转导子和转录激活子3（STAT3）作为小鼠Mn-SOD基因的转录因子，并阐明了O2·负极短暂性局灶性脑缺血（tFCI）后的过度生产。我们发现，脑缺血再灌注可显著降低Mn-SOD的表达。我们还发现，活化的STAT3通常被招募到小鼠Mn-SOD启动子中，并上调正常大脑中小鼠Mn-SUD基因的转录。然而，在tFCI后再灌注早期，STAT3迅速下调，其向Mn-SOD启动子的募集被完全阻断。此外，小鼠Mn-SOD基因的转录活性因STAT3抑制初级皮层神经元而显著降低。此外，我们发现STAT3因再灌注而失活，导致O的蓄积2·−STAT3活性的丧失通过减少Mn-SOD的表达而导致神经细胞死亡。使用SOD2−/+杂合敲除小鼠，我们发现Mn-SOD是STAT3在再灌注诱导的神经元细胞死亡中的直接靶点。我们的研究表明，STAT3是小鼠Mn-SOD基因的一种新型转录因子，在调节小鼠脑内活性氧水平方面发挥着重要的神经保护作用。

介绍

脑损伤（如缺血、再灌注和中风）增加了超氧阴离子（O2·−)和线粒体中的活性氧（ROS）。这些ROS是线粒体依赖性凋亡途径的关键介质(Chan等人，1996年;格林和里德出版社，1998年;Sugawara等人，1999年;Chan，2004年,2005). 含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD或SOD2）是一种特异的超氧化物抗氧化酶，是一种主要的细胞防御酶，参与保护细胞免受氧化应激(陈，1996). 在我们之前的报告中，Mn-SOD缺乏小鼠（SOD2−/+）在脑缺血后表现出梗死体积增加和细胞凋亡(村上等人，1998年;Fujimura等人，1999年;Kim等人，2002年). Mn-SOD过度表达对脑缺血再灌注后的神经保护作用(Maier等人，2006年).

Mn-SOD基因在许多物种中高度保守(马林斯等人，1985年)与组成性表达的铜/锌-SOD相比，其表达在各种细胞和组织中受到大量刺激的高度调节和诱导(Wong和Goeddel，1988年;Visner等人，1990年;Dougall和Nick，1991年). Mn-SOD基因的近端启动子区域具有多个CG基序（无TATA或CAAT盒）和特异性蛋白1（SP-1）的结合位点，特异性蛋白是SOD2基因组成表达中的转录激活物(Wan等人，1994年;Yeh等人，1998年;Xu等人，2002年). 此外，NF-κB激活的内含子增强子负责细胞因子诱导的转录(Xu等人，1999年;Dhar等人，2004年). 然而，在脑损伤（如缺血再灌注和中风）中，Mn-SOD转录的调控尚未完全阐明，尽管其表达水平对神经保护至关重要。有趣的是，我们的启动子分析揭示了小鼠Mn-SOD基因启动子区中信号转导子和转录激活子3（STAT3）结合潜力最丰富的位点。

STAT3是一种转录因子，也是一种细胞内信号转导因子，由细胞因子、生长因子和受体或非受体酪氨酸激酶激活(达内尔，1997;利维和李，2002年). Y705处STAT3的酪氨酸磷酸化对STAT3激活是必要的。磷酸化STAT3形成二聚体，转位到细胞核，与靶基因的特异启动子结合，并诱导基因表达(Bromberg和Darnell，2000年).

迄今为止已确定六个STAT(利维和达内尔，2002年)，但只有STAT3参与神经保护以对抗各种类型的脑损伤，包括脑缺血。STAT3激活导致分泌素(Shyu等人，2008年)，雌二醇(Dziennis等人，2007年)和白细胞介素-6（IL-6）(Yamashita等人，2005年)促进脑缺血损伤的神经保护和IGF-1拯救神经元(Yadav等人，2005年). 相反，STAT1的磷酸化有助于缺血性脑损伤(Takagi等人，2002年). STAT3激活和Mn-SOD表达参与缺血的神经保护，但它们之间的关系尚不清楚。在这项研究中，我们检测了STAT3作为神经保护剂的作用，重点是Mn-SOD表达和O2·−小鼠脑缺血再灌注损伤后的产生。

材料和方法

动物。

动物实验按照美国国立卫生研究院指南进行，并得到斯坦福大学实验动物护理管理委员会的批准。CD1雄性小鼠（30–35克，2个月龄）购自Charles River Laboratories。具有CD1背景的SOD2基因敲除突变体（杂合子）与CD1小鼠回交至少10代，基因型测定如前所述(Li等人，1998年). 在每个实验中使用具有相同遗传背景的小型野生型（WT）小鼠。

初级皮层神经元培养。

遵循的方案是根据前面描述的程序改编的(Copin等人，1996年)稍作修改。从16天大的小鼠胚胎大脑中制备皮层神经元，将其镀在涂有聚乙烯的盘子上-d日-赖氨酸，并在含有葡萄糖、5%马血清、谷氨酰胺（2 m米)青霉素（50 U/ml）和链霉素（50μg/ml）。两三天后，用含有B-27的神经基底细胞培养基改变培养基。神经元在37°C、湿度为5%CO的环境中培养27–10天后使用在体外.

局灶性脑缺血。

雄性小鼠（30–35 g）经受45分钟的短暂局灶性脑缺血和再灌注。将一条11.0 mm 6–0的外科单丝尼龙缝合线，在尖端钝化，通过颈外动脉残端引入左颈内动脉。在30%氧气和70%氧化亚氮中使用2.0%异氟醚和面罩对小鼠进行麻醉。直肠温度用恒温毯控制在37°C。大脑中动脉闭塞（MCAO）45分钟后，通过拔出尼龙缝合线恢复血流。暴露左侧颈总动脉，电凝左侧颈外动脉及其分支。假手术小鼠没有接受手术。在整个研究过程中监测生理参数，数值与之前报告的相同(Fujimura等人，1999年).

氧-葡萄糖剥夺和复氧。

通过将培养基替换为无葡萄糖的缓冲盐溶液，将原代神经元细胞板置于37°C的气密性湿化缺氧室（PlasLabs）中150分钟，进行氧-葡萄糖剥夺（OGD）。在这些条件下，PO210分钟后室中为零，PO2在培养基中为～15–20 mmHg。OGD后，将细胞培养基改为含有葡萄糖的神经元培养基，并再复氧24小时。

STAT3抑制剂处理。

为了从药理学上抑制STAT3的磷酸化，我们使用了从EMD Biosciences购买的STAT3抑制剂AG490。低浓度（50μ米在二甲基亚砜中[DMSO]在PBS中）在体外初级皮层神经元研究，而不是以前研究中使用的浓度（100μ米在DMSO中，在PBS中）(Wang等人，2007年;Shyu等人，2008年). 侧脑室注射较低浓度的AG490（5 nmol、10 nmol和20 nmol，在PBS中的2μl 50%二甲基亚砜中）（前角：侧1.0 mm，后0.2 mm，深3.1 mm），而不是之前研究中使用的浓度（50 nmol，存在于PBS中5μl 50%DMSO中）(千叶等人，2009年). 该车辆由PBS中50%的二甲基亚砜组成。

IL-6治疗。

为了通过药理学方法激活STAT3，我们使用了从Sigma-Aldrich购买的小鼠重组IL-6。由于IL-6在大脑中的半衰期较短，因此在MCAO前30分钟和MCAO后15分钟分别注射两次IL-6（2μl PBS中50 ng）(Loddick等人，1998年).

小干扰RNA转染。

为了实现STAT3敲除分子方法，我们购买了靶向小鼠STAT3和非靶向siRNA的小干扰RNA（siRNA）探针作为对照（Qiagen）。小鼠特异性STAT3 siRNA混合物的靶序列如下：TTGGGTGAAATTGACCAGCAA（SI01435301）、CAGAGGTTCCTTTAAATTA（SI014308）、CAAGGGTTCGGAAAATTAA（SI0435287）和CAGGCTGATCATATAA（SI001435294）。在所有siRNA转染实验中使用非靶向siRNA（SI03650318）作为对照。根据制造商的说明，用HiPerFect转染试剂（Qiagen）转染初级皮层神经元。在24孔板（1×10）上生长的初级皮层神经元5细胞/孔）或6mm培养皿（1×106电池/板）之前涂有聚乙烯-d日-赖氨酸用10n处理米每孔的siRNA，以及培养48小时后，对其进行各种实验分析。

蛋白质印迹分析。

样本取自大脑皮层和尾状壳核（海马除外）。简单地说，在SDS凝胶上进行全细胞蛋白质提取，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在4°C下与一级抗体孵育24小时，然后在室温下与二级抗体孵出1小时。使用的主要抗体是针对p-STAT3（Y705）、p-STAT3（Ser-727）、p-STA1（Y701）、p-TAT2（Y689）和STAT3的单克隆或多克隆抗体（1:1000；Santa Cruz Biotechnology）、3-硝基酪氨酸（1:1000，Exalpha Biologicals）、β-肌动蛋白（1:5000；Sigma-Aldrich）和Mn-SOD（1:5000，Stressgen）。然后使用化学发光试剂盒（Amersham Biosciences）用辣根过氧化物酶偶联IgG检测信号。

RT-PCR分析。

使用Micro-to-Midi总RNA纯化系统（Invitrogen）提供的方案，从注射AG490或载体的每只小鼠的同侧半球制备总RNA。用于RT-PCR分析的SuperScript一步法RT-PCR试剂盒，含铂金塔克使用（Invitrogen）。以下引物序列（5′–3′）是根据GenBank登录号设计的L35525型：Mn-SOD、ATGTTGTCGGGCGGCG和AGGTAGTGGCCCACACG。作为对照，使用以下引物序列（5′–3′）扩增β-actin：ACCCACTCGTGCCCATCTAA和GCCACAGGATTCCATCCAA。混合物在热循环器上进行RT-PCR（主循环梯度；Eppendorf）。Mn-SOD的RT-PCR条件为：55°C 30 min，94°C 2 min，94℃35次循环15 s，60°C 30 s，68°C 1 min，然后68°C 5 min。

染色质免疫沉淀分析。

染色质分离和染色质免疫沉淀（ChIP）分析是根据制造商的协议，使用商用试剂盒（EZ-Zyme染色质制备试剂盒，EZ-ChIP；Millipore）进行的。简单地说，用1%甲醛固定脑组织后，用EZ-Zyme裂解缓冲液和EZ-Zyme酶混合物（4×10）消化并分离每个可溶染色质6从切碎的小鼠脑组织中分离出的细胞。用ChIP稀释缓冲液将染色质溶液稀释10倍，并用蛋白G琼脂糖/鲑鱼精子DNA/免疫前血清进行预处理。分离预分离的染色质溶液，并使用磷酸-STAT3抗体进行免疫沉淀分析。在多次洗涤后，从珠子中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物。反向交联培养后，蛋白质和RNA被蛋白酶K和RNase A去除。纯化的DNA经过PCR，引物针对转录起始位点上游的几个假定STAT3结合位点。所用PCR引物序列如下：F1正向，5′-GAAGACCGCTTACATCAGCCAT-3′，R1反向，5′-AATGCTATGTGGTGGTGGTGCACAT-3′；F2正向，5′-ATGTGCCACACACCATAGCATT-3′，R2反向，5′-ATGGCAGCATACAGGC-3′；F3正向，5′-GCCTGCCTG-GATACTGCCAT-3′，R3反向，5′-GCAGAGGCAGTTGGCTG-3′；F4正向，5′-ACTCAGCACTGCTTCTGC-3′，R4反向，5′-TGAGACTGGTTGGCGGACT-3′；F5正向，5′-AGTCGCAACCCAGTCTCCA-3′，R5反向，5′-AAATTGGTGAGGCGC-TT-3′；F6向前，5′-AAGCACGCGCTT-ACCAATTTT-3′，R6反向，5′-ATTGAGTTT-ACACGACCTGCT-3′。

小鼠Mn-SOD启动子的克隆和构建。

小鼠Mn-SOD基因第1–2外显子和第5′外显子侧翼的小鼠Mn-SDO启动子区域长度为1779 bp（GenBank登录号：L35525型)用从脑组织中分离的小鼠基因组DNA通过PCR产生。用于小鼠Mn-SOD基因5′侧翼（−1779至−1bp）区域的PCR引物为5′-GAGACCGCTTACATCAGCCAT-3′（正向）和5′-ATTGACGTTTACACGACCGCTGCT-3′（反向）。使用TOPO TA克隆工具包（Invitrogen），生态在PCR产物的两端添加RI限制性内切酶位点。pGLu-Basic载体（新英格兰生物实验室）用生态RI（新英格兰生物实验室）并通过T4 DNA连接酶（发酵剂）与PCR产物连接。最终构建物通过使用pGLu-Basic测序引物（新英格兰生物实验室）进行DNA测序进行确认。所有质粒均采用Qiagen-Midiprep试剂盒制备，DNA质量和数量通过分光光度法和琼脂糖凝胶目视检查进行测定。

瞬时转染和荧光素酶活性测定。

HEK293T细胞或初级皮层神经元培养在24孔板或之前涂有聚乳酸的24孔板中-d日-赖氨酸，并使用Lipofectamine LTX（Invitrogen）转染。HEK293T细胞在培养物达到60-70%融合时被转染，而初级神经元以1×10的密度被转染5/好吧。每个孔使用250毫微克的pGLu–Mn-SOD启动子报告基因。在现有培养基中进行转染（对于神经元，使用含B27的神经基底细胞培养基；对于HEK293T细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM）。培养24小时后，清洗DNA和脂质体LTX，并使用新鲜培养基。然后，用50μ米AG490或10 n米每孔STAT3或非靶向siRNA的siRNA。细胞在siRNA转染后再培养2天，然后分析荧光素酶活性。根据制造商通过Lmax微孔板发光仪（分子器件）提供的协议，使用Gaussia荧光素酶检测试剂盒（新英格兰生物实验室）检测细胞培养上清液中的Gaussia-荧光素酶活性。所有实验均一式四份，并至少重复五次。

核蛋白提取和电泳迁移率变化分析。

根据制造商的协议，使用商用试剂盒（Nuclear Extraction试剂盒；BIOSOURCE International；EMSA试剂盒；Invitrogen）进行核提取分离和电泳迁移率变化分析（EMSA）。简言之，5×106用低渗细胞裂解缓冲液对从小鼠脑组织或初级皮层神经元中分离的细胞进行裂解。在用完整的核洗涤缓冲液洗涤和离心后，用提取缓冲液提取细胞核。使用5×结合缓冲液将含有～5μg蛋白质的标准化核提取物与双链寡核苷酸探针孵育。小鼠Mn-SOD启动子中含有假定STAT3结合位点的寡核苷酸如下：1-up，5′-CTGCCTTTGCTTAGTTT-3′，1-down，5′-AAAACACTAAGAGAGCAG-3′；2向上，5′-CCCCATTAAGAGAGAGAAAGCT-3′，2向下，5′-AGCTTTCCTTCTACTATAAGGT-3′；3-向上，5′-GCTGTTATAATTATTGTTATGGAAAACAT-3′，3-向下，5′-ATGTTCCATAACATATACAGC-3′；4向上，5′-GATAGCACTGCTTCTTAGACTAA-3′，4向下，5′-TTAGTCTAAGAGCTATC-3′；5-上，5′-CATTTGGTCGAGTGTGT-3′，5-下，5′-ACCAACCACACTCGACCAAATG-3′；6向上，5′-CACTGAATGTTGCAGATTA-3′，6向下，5′-TAAACTCTGGCAACATTCAGTG-3′；7向上，5′-GCAGAGTTTAATCAAGAAAGATGA-3′，7向下，5′-TCATCTTTTGATTAAACTGC-3′；8-向上，5′-TAGTTAACTGGCAGCTGCACCCG-3′，8-向下，5′-CGGTGCACTCTCGCAGTAACTA-3′；9向上，5′-CCATAATTCTGACCAGCAGCAGAG-3′，9向下，5′-CTCTGCTGGTCAGAATTATGG-3′；10-向上，5′-CCTTGCTTTCCGGAGAAAGTCT-3′，10-向下，5′-AGACTTTCCTCCGGAAAGCCAAGG-3′；11向上，5′-CAGGGTTCCCAGAGAGAGGAGTA-3′，11向下，5′-TACTCCTGCTTCTGGGAAACCTG-3′；12向上，5′-GGACCGGTTCCCCGAGGCGGGC-3′，12向下，5′-GCCCCGCCTCGGGGAACCCCGGTCC-3′。在培养期结束时，将2μl 6×EMSA凝胶负载溶液添加到每10μl反应混合物中。使用非变性聚丙烯酰胺凝胶通过电泳分离DNA-蛋白质复合物。用SYBR Green EMSA染色后，使用发射滤光片对凝胶进行成像：526 SP荧光，Cy 2，Alexa Fluor 488；激光：绿色532，并记录在案。清洗两次后，用SYPRO Ruby EMSA再次对凝胶进行染色，然后使用发射过滤器对凝胶进行成像：670 BP 30 Cy 5；激光：红色633。

梗死判定。

再灌注后24小时，每隔1毫米对大脑进行冠状切片。然后将单个切片在2%2,3,5-三苯基四唑氯化物和0.1 mol/L PBS（pH调节至7.4）中培养，并加热至37°C，然后加入3.7%福尔马林。根据之前的报告进行了一般处理和总梗死体积的计算(Swanson等人，1990年). 通过图像分析系统（Bio-Read Laboratories）量化梗死面积。

细胞死亡分析。

使用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（BioVision）通过乳酸脱氢酶释放的标准测量来量化细胞活力。细胞外LDH的量是在细胞上覆盖的一份培养基中测量的，并遵循制造商的指南进行一般程序。根据制造商的指南，使用WST-1检测试剂盒（罗氏诊断）在含有细胞增殖试剂的培养基中评估细胞活力。

现场O的检测2·−生产。

O的早期生产2·−如前所述，使用氢乙硫胺（HEt）对脑缺血进行研究(村上等人，1998年). 如前所述，在诱导缺血前15分钟静脉注射HEt溶液（200 ml；PBS中的1 mg/ml）。HEt检测在激发=355 nm和发射>415 nm时，或乙炔检测在激发=510–550 nm和发射>580 nm时，通过显微镜评估荧光。

统计分析。

所有结果均来自3-5个独立实验，以平均值±SEM表示。数据使用Student’st吨测试。在第页值<0.05。

结果

小鼠MCAO模型中Mn-SOD表达被缺血再灌注下调

为了研究缺血再灌注后Mn-SOD表达的变化，我们使用Western blot分析法用抗Mn-SOD抗体检测了Mn-SODs的蛋白水平(图1A类). 小鼠接受短暂MCAO 45分钟，然后再灌注1、3、6和12小时(n个=4个），然后从大脑皮层和尾状壳核（海马除外）获取样本。我们发现，在再灌注后1-3小时内，大脑缺血皮层中Mn-SOD的蛋白质水平迅速下降(图1A类,B类)Mn-SOD mRNA表达水平在缺血再灌注早期也迅速下降(图1C类,D类). 我们还发现，OGD 2.5小时后，原代皮层神经元经3小时复氧后，Mn-SOD的蛋白水平显著降低(图1E类). 再灌注引起的Mn-SOD mRNA表达和蛋白质水平的降低表明，在缺血再灌注条件下，Mn-SOD基因的转录可能受到因素的下调。

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在小鼠MCAO模型中，缺血再灌注显著降低了Mn-SOD的表达。A类用抗Mn-SOD抗体对MCAO后再灌注1小时和3小时小鼠脑内Mn-SOD蛋白水平进行Western blot分析。从大脑皮层和尾壳核（海马体除外）获得全细胞蛋白质提取物。B类，总结图描述了Mn-SOD蛋白水平相对于β-肌动蛋白的变化*第页< 0.05 (n个=每组4人）。C类用针对小鼠Mn-SOD基因的特异性引物，通过RT-PCR测定MCAO再灌注1和3 h后小鼠脑中Mn-SODmRNA水平。从大脑皮层和尾状壳核（海马除外）制备总RNA，并使用小鼠β-肌动蛋白特异性引物证实RNA负载量相等。D类，总结图描述了Mn-SOD mRNA水平相对于β-肌动蛋白的变化*第页< 0.05 (n个=每组4人）。E类Western blot分析OGD后3 h复氧2.5 h的初级皮层神经元Mn-SOD蛋白水平；IR，缺血再灌注；S、 假；外径、光密度；OR，氧-葡萄糖剥夺/复氧；C、 控件。

STAT3在小鼠MCAO模型中通过再灌注显著下调，并参与Mn-SOD的表达

为了研究哪种介质在小鼠脑缺血再灌注期间调节Mn-SOD基因的转录，我们探索了小鼠Mn-SOD基因的启动子区域。有趣的是，我们在基因的启动子区域（−1779到−1 bp）发现了许多假定的STAT3结合位点（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。众所周知，STAT3在各种基因的表达中起转录调节器的作用，以及在应对各种细胞应激时起信号转导器的作用。为了测试STAT3对Mn-SOD基因转录调控的可能性，我们首先研究了脑缺血小鼠脑再灌注后STAT3的活性。众所周知，在STAT3的二聚化和移位及其作为转录因子的作用方面，Tyr-705处STAT3磷酸化比Ser-727处STAT3磷酸化更重要。我们发现，脑缺血再灌注1h后，Tyr-705处STAT3的磷酸化显著降低(图2A类,B类). 然而，再灌注后Ser-727处STAT3的磷酸化没有改变(图2A类). 此外，我们还发现，与正常情况下大脑皮层细胞核中的STAT3相比，在缺血再灌注条件下，STAT3定位于细胞质而不是皮层神经元的细胞核中(图2C类). 与STAT3不同，脑缺血再灌注后STAT1（Y701）的磷酸化增加而不是减少(图2A类). 我们还发现，STAT2（Y689）的磷酸化随着再灌注而增加（数据未显示）。接下来，为了阐明Mn-SOD表达减少与缺血再灌注早期STAT3失活之间的关系，我们直接向小鼠脑内注射（静脉注射）5 nmol、10 nmol和20 nmol的AG490（一种STAT3抑制剂），并检查Mn-SOD表达水平。因为STAT3基因敲除对小鼠胚胎是致命的(武田等人，1997年)，我们使用AG490的药理方法抑制STAT3，或使用siRNA转染的分子方法敲除STAT3。如所示图3,A类和B类脑皮质注射AG490后3h，Mn-SOD蛋白水平和Mn-SODmRNA表达水平迅速下降，呈剂量依赖性。此外，转染STAT3特异性siRNA或经AG490处理的初级皮层神经元Mn-SOD蛋白水平显著降低(图3C类). 这些结果表明，STAT3活性参与了脑缺血后Mn-SOD的表达。

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在小鼠MCAO模型中，STAT3被缺血再灌注显著下调。在MCAO后再灌注1、3、6和12 h后，从雄性小鼠大脑的大脑皮层和尾状壳核（海马除外）中获得全细胞蛋白提取物。用抗磷酸化-STAT3（Y705）、磷酸化-STAT3（Ser-727）、磷酸化-STAT1（Y701）和总STAT3的抗体进行蛋白质印迹。A类、具有代表性的磷酸-STAT3（Y705）、磷酸-STAT3（Ser-727）、磷酸-STAT1（Y701）和总STAT3印迹和β-肌动蛋白印迹显示蛋白质负载相等。B类，描述磷酸化-STAT3相对于总蛋白质负载量的变化的汇总图*第页< 0.05 (n个=每组4人）。C类免疫组织化学分析显示，STAT3的磷酸化状态（红色）和来自对侧和同侧缺血区域（皮层）的神经元标记NeuN（绿色）的显示。比例尺，20μm。IR、缺血再灌注；S、 假；外径、光密度；神经，神经元特异性核蛋白。

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抑制STAT3可降低小鼠大脑和皮层神经元中Mn-SOD的表达。A类雄性小鼠大脑大脑皮层和尾状壳核（海马除外）中Mn-SOD、总STAT3和磷酸-STAT3（Y705）的蛋白质水平，用载体（V）（PBS中50%二甲基亚砜）或AG490（PBS的50%二甲基亚砜中5 nmol、10 nmol和20 nmol）在侧脑室注射用抗Mn-SOD、抗STAT3和抗磷酸-STAT3（Y705）抗体通过Western blot检测。B类使用针对小鼠Mn-SOD基因的特异性引物，通过RT-PCR测定侧脑室注射载体（PBS中50%二甲基亚砜）或AG490（PBS的50%二甲基亚砜中5 nmol、10 nmol和20 nmol）的小鼠大脑中Mn-SODmRNA水平。从大脑皮层和尾状壳核（海马除外）制备总RNA，并使用小鼠β-肌动蛋白特异性引物确认RNA负载量相等。C类、Western blot分析转染STAT3特异性siRNA 24小时或经50μg米AG490持续3小时。

缺血再灌注可减少STAT3进入小鼠Mn-SOD基因启动子的募集

我们测试了STAT3是否在脑缺血中作为Mn-SOD基因表达的转录调节器发挥作用。首先，我们使用ChIP分析法检测了小鼠Mn-SOD启动子中STAT3的招募情况，该方法使用跨越Mn-SOD启动子中的STAT3结合位点的特定对引物，对来自错误操作小鼠或接受MCAO和再灌注的小鼠大脑皮层的染色质样本进行检测。该启动子（−1779至−1 bp）被分为六个部分（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）：I（−1779至−1420 bp）、II（−1419至−1122 bp）、III（−1121至−831 bp）、IV（−830至−557 bp）、V（−556至−213 bp）和VI（−212至−1 bp）。我们发现，在错误操作的小鼠大脑皮层的染色质中，STAT3被强烈招募到Mn-SOD启动子的区域IV（−830到−557 bp）和区域V（−556到−213 bp）。然而，在MCAO/再灌注皮质的染色质中，STAT3的募集被完全阻断(图4). 根据许多报道，区域IV（−830到−557 bp）和区域V（−556到−213 bp）是小鼠Mn-SOD基因的关键启动子区域，因为这些区域包含SP-1和NF-κB的结合位点，它们是Mn-SOD基因表达的转录因子(图5A类). 我们的结果表明，在正常情况下，磷酸化STAT3通常被招募到小鼠Mn-SOD的启动子中。然而，脑缺血损伤的再灌注阻止了这种募集。

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缺血再灌注可减少STAT3向小鼠Mn-SOD基因启动子的募集。A类,B类，使用跨越STAT3结合位点的小鼠Mn-SOD启动子特异性引物对进行ChIP分析，确定STAT3从混乱操作的小鼠皮层或MCAO后再灌注3h的小鼠皮层的染色质中招募到小鼠Mn-SDD基因启动子中。免疫沉淀；S、 虚假；IR，缺血再灌注。

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STAT3是小鼠Mn-SOD基因启动子中潜在的转录调节因子。A类，小鼠Mn-SOD基因启动子中假定STAT3结合位点示意图。B类，通过萤光素酶测定法测定小鼠Mn-SOD基因的转录活性。用50μ米AG490和50μ米JSI-124持续24小时，并通过荧光素酶活性进行评估。数据为平均值±SEM*第页< 0.001,#第页与对照组相比<0.05。C类，小鼠Mn-SOD基因对STAT3活性变化的转录活性由转染STAT3特异性siRNA的HEK293T细胞中的荧光素酶分析测定。数据为平均值±SEM*第页< 0.001,#第页与对照组相比<0.05。D类，小鼠Mn-SOD基因对STAT3活性变化的转录活性是通过荧光素酶分析在转染STAT3特异性siRNA或用50μ米AG490。数据为平均值±SEM*第页< 0.001,#第页与对照组相比<0.05。E类Western blot分析转染STAT3特异性siRNA的HEK293T细胞中总STAT3的蛋白水平。F类Western blot分析转染STAT3特异性siRNA的初级皮质神经元中总STAT3的蛋白水平。

STAT3是小鼠Mn-SOD基因的潜在转录因子

为了阐明被招募到小鼠Mn-SOD启动子中的STAT3是否调节Mn-SOD基因的转录活性，我们使用荧光素酶分析检查了Mn-SO德启动子的转录活性。首先，利用从小鼠脑组织中分离的小鼠基因组DNA，通过PCR产生小鼠Mn-SOD基因启动子区1779 bp的长度。使用TOPO TA克隆工具包，生态在两端添加RI限制性内切酶位点，并通过T4 DNA连接酶与pGLu-Basic载体连接。使用上述小鼠pGLu–Mn-SOD荧光素酶构建物，我们评估了小鼠Mn-SOD启动子的转录活性。我们将小鼠pGLu–Mn-SOD荧光素酶构建物转染到HEK293T细胞中，该细胞具有较高的转染效率。培养24小时后，用50μ米AG490和另一种STAT3抑制剂JSI-124（50μ米)为了证实STAT3抑制的更直接作用，我们使用了JSI-124，这是一种新型的Jak2/STAT3信号选择性抑制剂。如所示图5B类，经两种STAT3抑制剂处理的细胞中pGLu–Mn-SOD的荧光素酶活性显著降低。此外，通过转染STAT3特异性siRNA抑制STAT3，转染pGLu–Mn-SOD的HEK293T细胞的荧光素酶活性也显著降低(图5C类). 所有以小鼠基因为靶点的STAT3特异性siRNA序列与人类基因的同源性均大于80%，其中两个序列与人类基因组的同源性分别为91%和81%。在我们对STAT3特异性siRNA序列对小鼠神经元和人类HEK293T细胞的效力进行初步筛选时，我们选择了两个STAT3特异性siRNA序列，它们对两种细胞中的STAT3基因敲除都具有高效性。通过Western blot分析中使用抗STAT3抗体量化STAT3的总蛋白水平，确认每个细胞中STAT3特异性siRNA的转染效率(图5E类). 为了确认STAT3是否也调节皮层神经元中Mn-SOD启动子的转录活性，我们将STAT3特异性siRNA转染到先前转染pGLu–Mn-SOD的初级皮层神经元中，并评估荧光素酶活性。如所示图5D类STAT3抑制显著降低荧光素酶活性，即使初级皮质神经元的降低水平低于HEK293T细胞。初级皮质神经元和HEK293T细胞之间的差异是初级皮质神经元转染效率低的结果。通过Western blot分析中使用抗STAT3抗体定量STAT3的总蛋白水平，确认每个细胞中STAT3特异性siRNA的转染效率(图5F类). 这些结果表明STAT3调节Mn-SOD启动子的转录活性。

小鼠Mn-SOD基因启动子中STAT3的推测结合位点

为了鉴定小鼠Mn-SOD启动子的真正STAT3结合位点，我们使用来自假手术小鼠大脑皮层和接受45分钟MCAO/3小时再灌注的小鼠皮层的核提取物进行了EMSA。我们对小鼠Mn-SOD启动子IV和V区STAT3推测结合的寡核苷酸探针进行了编号和设计(图5A类). 在错位操作的皮层中，检测到Mn-SOD启动子#3、7、10和12基序上的STAT3-DNA结合，并通过抗磷酸-STAT3（Y705）抗体进行超移位(图6A类). 然而，在接受3小时再灌注/MCAO的小鼠的皮层中，这些结合显著减少。在初级皮层神经元中，还检测到#3、7、10和12基序上的STAT3-DNA结合，并被抗磷酸化-STAT3（Y705）抗体超转移，并被50μ米AG490型(图6C类).

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活性STAT3结合Mn-SOD启动子中的假定基序，其结合被缺血再灌注阻断。A类用EMSA分析法测定Mn-SOD启动子中STAT3与DNA结合的活性，EMSA分析使用的是从错误操作的小鼠大脑皮层或MCAO后再灌注3h的小鼠皮层的核提取物。使用12对假定的STAT3结合探针，选择并鉴定假定的STAT3结合位点。使用磷酸化STAT3（Y705）抗体，确认STAT3-DNA结合复合物的超位移（SS）。B类，定量图描述了缺血再灌注后相对于shams的STAT3/DNA结合水平的变化*第页< 0.05 (n个=每组3人）。C类在初级皮层神经元中，Mn-SOD启动子中STAT3与DNA结合的活性是通过EMSA分析，使用载体或50μ米AG490作用3小时。使用磷酸化-STAT3（Y705）抗体，确认STAT3-DNA结合复合物的超位移。D类，定量图，描述STAT3抑制后相对于对照组STAT3/DNA结合水平的变化*第页< 0.05 (n个=每组3人）。S、 假；IR，缺血再灌注。

缺血再灌注抑制STAT3增加O的生成2·−

我们的结果证实，脑缺血再灌注后，Mn-SOD的表达受到STAT3抑制的下调，这增加了O2·−线粒体中(陈，1996). 因此，我们研究了Mn-SOD表达的减少是否会增强缺血再灌注后超氧自由基生成的增加。如所示图7A类，短暂MCAO 45分钟后再灌注3小时，在小鼠缺血皮层强烈观察到氧化HEt信号。在我们的结果中，STAT3在缺血再灌注早期显著下调(图2). 因此，我们首先检查了STAT3失活与O之间的关系2·−脑缺血再灌注后生成。我们用AG490直接处理皮层初级神经元，并测定O2·−使用HEt染色进行生产。如所示图7B类在AG490作用3h的神经元中强烈观察到氧化的HEt信号。这表明STAT3抑制可诱导O2·−形成。接下来，澄清O的增加是否2·−在缺血再灌注后的线粒体中，由于STAT3失活导致Mn-SOD表达减少，我们在STAT3抑制后使用3-硝基酪氨酸抗体定量了蛋白质亚硝基化的水平，亚硝基化是过氧亚硝酸盐的反应产物。如所示图7,C类和D类注射AG490后，小鼠大脑皮层蛋白质亚硝化水平显著升高，且呈剂量依赖性。此外，在用STAT3特异性siRNA转染的原代皮层神经元中，蛋白质亚硝基化水平显著升高(图7E类,F类). 这些结果表明O的增加2·−缺血再灌注时的生成是由于再灌注诱导STAT3失活导致Mn-SOD表达减少所致。

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缺血再灌注抑制STAT3增加O的生成2·−.A类HEt（红色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）染色显示对侧和同侧缺血区域（皮层）的ROS生成。比例尺，20μm。B类50μ米AG490用于3小时。标尺，20μm。C类，使用3-硝基酪氨酸抗体从蛋白质印迹定量蛋白质亚硝化。从雄性小鼠大脑的大脑皮层和尾状壳核（海马除外）中获得全细胞蛋白提取物（30μg），将载体（V）（PBS中的50%二甲基亚砜）或AG490（PBS的50%二甲亚砜中的5 nmol、10 nmol和20 nmol）注入脑室。D类，描绘3-硝基酪氨酸相对于总蛋白负荷的变化的总结图*第页< 0.05 (n个=每组4人）。E类，使用3-硝基酪氨酸抗体从蛋白质印迹定量蛋白质亚硝化。将来自初级皮层神经元的全细胞蛋白提取物（30μg）转染STAT3特异性siRNA 24 h。使用总STAT3抗体通过Western blot分析测定STAT3特异性siRNA的转染效率。F类，描绘3-硝基酪氨酸相对于总蛋白质负荷的变化的总结图*第页< 0.05 (n个=每组4人）。外径、光密度。

Mn-SOD是一种重要的神经保护剂，是STAT3在脑缺血损伤引起的细胞死亡中的直接靶点

众所周知，过多的活性氧与脑损伤有关，是可能导致脑缺血后细胞凋亡的信号介质(陈，2001;Dröge，2002年). 在我们的研究中，Mn-SOD表达的减少导致了脑缺血再灌注期间超氧自由基的过度生成。为了通过STAT3抑制与超氧物过度产生相关的再灌注诱导细胞死亡，确认Mn-SOD表达的减少有多关键，我们使用SOD2−/+小鼠初级皮层神经元测量了与Mn-SOD水平和超氧物产生变化相关的细胞存活率。

在注射10 nmol AG490的SOD2 WT小鼠的大脑皮层中，Mn-SOD显著下调(图8A类,B类). 然而，在注射10 nmol AG490的SOD2−/+杂合敲除小鼠的大脑皮层中，Mn-SOD水平没有改变。我们还比较了蛋白质亚硝基化的变化水平，以检测对STAT3抑制的超氧化物自由基生成。与SOD2 WT小鼠大脑皮层显著增加相比，注射10 nmol AG490的SOD2−/+小鼠皮层中的STAT3抑制未改变蛋白质亚硝化作用(图8A类,C类). 我们还发现，即使没有注射AG490，SOD2−/+小鼠的控制皮层中蛋白质亚硝化的基础水平仍然很高(图8A类,C类). 这是由于SOD2−/+小鼠中Mn-SOD表达不足所致。有趣的是，我们没有发现SOD2−/+组中用载体处理的初级皮层神经元和用AG490处理24小时的初级皮层神经元之间LDH释放的显著差异，而SOD2 WT组中用AG490处理的神经元LDH释放的显著增加(图8D类). 由于SOD2−/+小鼠的皮层神经元对STAT3抑制反应中Mn-SOD表达水平和蛋白质亚硝化水平没有显著变化，因此未检测到对照组和STAT3抑制剂组之间的细胞死亡率差异。此外，在SOD2−/+组中，在OGD 2.5小时后再复氧24小时的初级皮质神经元中，我们未检测到载体和AG490治疗之间LDH释放的任何显著差异，与用AG490处理并在OGD 2.5小时后接受24小时复氧的SOD2 WT皮层神经元中LDH释放的显著增加相比(图8E类). 我们还发现，SOD2−/+组的控制皮层神经元中LDH释放的基础水平很高，即使他们没有接受AG490治疗(图8D类,E类). 这也是由这些小鼠中Mn-SOD表达不足和高水平的蛋白质亚硝基化引起的。我们的结果表明，由于STAT3抑制，Mn-SOD表达减少，在与超氧化物产生相关的神经元细胞死亡中起着关键作用，Mn-SUD是STAT3在缺血小鼠脑中再灌注诱导神经元细胞死亡的直接靶点。

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STAT3是小鼠脑内Mn-SOD的上游调节器，Mn-SOD是STAT3在再灌注诱导细胞死亡中的直接靶点。A类，使用3-硝基酪氨酸抗体从蛋白质印迹定量蛋白质亚硝化。使用抗Mn-SOD抗体和抗磷蛋白（Y705）或总STAT3抗体，通过Western blots测定Mn-SOD的蛋白质水平和磷酸化-（Y706）或总TAT3的水平。3小时后，从WT或SOD2−/+（KO）雄性小鼠大脑的大脑皮层和尾状壳核（海马除外）中获得全细胞蛋白提取物（30μg），用载体（PBS中的50%二甲基亚砜）或AG490（PBS的50%二甲亚砜中的10 nmol）脑室注射。B类，总图描述了Mn-SOD相对于总蛋白质负荷的变化*第页< 0.05 (n个=每组4人）。C类，描绘3-硝基酪氨酸相对于总蛋白负荷的变化的总结图*第页< 0.05 (n个=每组4人）。D类，通过用50μ米从WT或KO小鼠大脑中取出AG490 24小时。数据为平均值±SEM*第页与对照组相比<0.05。E类WT或KO小鼠大脑初级皮质神经元培养基中LDH活性（含或不含50μ米AG490暴露于OGD 2.5 h和复氧24 h前。数据为平均值±SEM*第页与对照组相比<0.05。NS，不显著。

缺血再灌注抑制STAT3增加脑损伤和神经细胞死亡

为了研究STAT3去磷酸化对脑缺血脑损伤的影响，我们在MCAO前向小鼠脑内注射10 nmol（i.c.v.）的STAT3抑制剂AG490，并测量MCAO 45分钟后再灌注24小时后的脑梗死体积。我们发现AG490治疗小鼠MCA区域的缺血性损伤(n个=11）大于车辆处理小鼠（梗死体积[单位：mm三]; 车辆对AG490:36.6±3.1对64.6±10.07，n个=9），使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色(图9A类). 此外，我们评估了OGD加或不加AG490 2.5小时后，经过24小时复氧处理的初级皮层神经元释放的LDH。用50μ米AG490和OGD后24小时复氧2.5小时，LDH释放显著增加，约为用载体预处理和OGD/复氧皮质神经元的两倍(图9B类). 此外，我们将STAT3特异性siRNA转染到初级皮层神经元，并在培养24小时后评估LDH的释放。如所示图9C类，转染STAT3特异性siRNA或用50μ米AG490与转染干扰siRNA或用载体处理的神经元进行比较。在使用WST-1试剂进行细胞活性测定时，用50μ米AG490和OGD后24小时复氧2.5小时的神经元也显著减少了用载体预处理和OGD/复氧的神经元的约一半时间(图9D类). 转染STAT3特异性siRNA或用50μ米AG490与转染干扰siRNA或用载体处理的神经元相比(图9E类).

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缺血再灌注对STAT3的抑制增强了脑损伤和神经元细胞死亡。A类在MCAO发病前1 h，侧脑室注射溶媒（PBS中50%二甲基亚砜）和AG490（PBS内50%二甲基亚砜中10 nmol）。24小时后处死动物，用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色法分析单个脑片以确定梗死。B类，通过含或不含50μ米AG490暴露于OGD 2.5 h和复氧24 h前。数据为平均值±SEM*第页与对照组相比<0.01，#第页<0.05与无AG490相比。C类转染STAT3特异性siRNA或经50μ米AG490持续24小时。数据为平均值±SEM**第页与对照组相比<0.05。D类，用WST-1试剂在含有或不含50μl原代皮层神经元的培养基中评估细胞活力米AG490暴露于OGD 2.5 h和复氧24 h前。数据为平均值±SEM*第页与对照组相比<0.01，#第页<0.05与无AG490相比。E类，用WST-1试剂在转染STAT3特异性siRNA或用50μ米AG490持续24小时。数据为平均值±SEM**第页与对照组相比<0.05。IR、缺血再灌注；或者，氧-葡萄糖剥夺/复氧。

缺血再灌注抑制STAT3诱导小鼠脑线粒体依赖性凋亡

为了阐明缺血再灌注后STAT3抑制导致神经元死亡的信号通路，我们检测了OGD后24小时复氧2.5小时的初级皮质神经元中的信号级联，包括AG490和AG490。众所周知，脑缺血损伤中氧化应激诱导线粒体依赖性神经元死亡。首先，我们检查STAT3失活是否影响细胞色素c（c）OGD/复氧条件下线粒体释放。用50μ米AG490，OGD后24小时复氧2.5小时，细胞色素c（c）经载体预处理和OGD/复氧处理的神经元释放显著增加(图10A类). 检测STAT3失活对细胞色素的影响c（c）释放后，我们用50μ米AG490的时间依赖性和细胞色素评估c（c）每个时间段孵化后释放。如所示图10B类在AG490处理的神经元中，细胞色素c（c）与对照细胞相比，孵育12h后释放量显著增加。接下来，我们研究了缺血再灌注后STAT3失活是否诱导线粒体依赖性凋亡途径。如所示图10C类经OGD处理2.5小时后，经12小时复氧处理的皮层神经元中STAT3磷酸化水平降低，经AG490预处理和OGD/复氧处理后的初级皮层神经元中磷酸化水平下降更为显著。通过在OGD/复氧系统下用AG490增强STAT3失活，凋亡信号通路，如Bax的诱导和spectrin的裂解，得到了更强烈的增强(图10C类). 为了证实STAT3失活对线粒体依赖性凋亡途径的影响，我们用50μ米AG490浓度随时间变化。被AG490失活的STAT3也以时间依赖的方式诱导Bax和spectrin(图10D类).

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通过缺血再灌注抑制STAT3诱导小鼠脑线粒体依赖性凋亡。A类，细胞色素释放量的评估c（c）（细胞。c（c）)来自含有或不含有50μl的初级皮层神经元胞质部分的线粒体米AG490暴露于OGD 2.5 h和复氧24 h前。数据为平均值±SEM*第页与对照组相比<0.01，#第页<0.05与无AG490相比。B类，细胞色素c（c）50μl处理的初级皮层神经元培养液中线粒体的释放米AG490用于1、3、6和12 h。数据为平均值±SEM**第页与对照组相比<0.05。C类Western blot分析含或不含50μ米AG490暴露于OGD前2.5小时，再复氧12小时。D类Western blot分析50μ米AG490持续1、3、6和12小时。或者，氧-葡萄糖剥夺/复氧。

讨论

本研究证明了STAT3作为Mn-SOD基因表达的转录调节器和神经保护剂的作用，并通过STAT3抑制引起的Mn-SOD减少阐明了脑缺血损伤后ROS过度生成的分子机制。虽然已经研究了STAT3的神经保护特性，但这是第一份报告，它显示了STAT3如何调节神经元细胞中的连续Mn-SOD表达，以及STAT3活性对于维持细胞防御系统（如调节细胞ROS水平）的重要性。

我们的结果表明，在小鼠脑缺血再灌注早期，STAT3和Mn-SOD显著下调(图1,​,2).2). STAT3失活导致Mn-SOD mRNA水平和Mn-SOD蛋白水平下降(图3). 有趣的是，即使在正常生理条件下，小鼠大脑皮层和初级皮层神经元中STAT3（Y705）的磷酸化水平也很高(图2,​,3三A类,C类). 这意味着STAT3活性作为神经保护剂在神经元细胞存活中起着关键作用。事实上，我们发现STAT3特异性siRNA或AG490治疗对STAT3的抑制可诱导神经细胞死亡(图9C类,E类). 此外，正常神经元细胞中STAT3的高磷酸化表明STAT3可能调节一个像看家基因一样表达的基本基因。Mn-SOD在神经元细胞中像看家基因一样高表达，尽管它是一种表达酶，可被各种细胞刺激高度诱导。这意味着Mn-SOD的持续功能对于维持神经元细胞的防御系统抵抗氧化应激至关重要。众所周知，Mn-SOD的过度表达具有神经保护作用，Mn-SDD表达的变化会导致神经元细胞在氧化应激反应中死亡(村上等人，1998年;Fujimura等人，1999年;Kim等人，2002年). 然而，脑缺血损伤过程中Mn-SOD表达调控的详细机制尚未完全阐明。事实上，本研究清楚地揭示了持续激活的STAT3与小鼠大脑中高表达的Mn-SOD之间的关系。

我们发现小鼠初级皮层神经元中Mn-SOD的转录被STAT3抑制显著下调(图5D类). 在对小鼠Mn-SOD启动子的分析中，我们发现了STAT3最丰富的推定结合基序（−1779至−1bp），其包含许多SP-1基序（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们发现磷酸化的STAT3通常被募集到小鼠Mn-SOD启动子的区域（−828至−210bp），并在正常生理条件下上调Mn-SOD基因的转录(图4​4–6). 然而，脑缺血损伤后再灌注失活的STAT3不能被招募到Mn-SOD基因的启动子中，也不能维持Mn-SOD转录的上调(图4​4–6). 这些现象导致脑缺血再灌注期间Mn-SOD表达降低。我们的研究结果强烈表明，STAT3是Mn-SOD组成表达中的一种新型转录激活剂，作为一种神经保护剂，其活性影响缺血再灌注损伤期间Mn-SOD表达的动态变化。SP-1和STAT3在Mn-SOD转录调控中的关系将在未来的研究中阐明。最近，有报道称STAT3激活导致其与SP-1/SP-3相互作用，并且其向近端钠氢交换器3启动子的募集增加了转录(Su等人，2009年). 我们的初步研究表明，磷酸化STAT3与正常小鼠大脑皮层中的SP-1相互作用。然而，脑缺血再灌注后，这种相互作用完全减弱（数据未显示）。这一发现使我们假设，在正常条件下，STAT3磷酸化可能维持SP-1向Mn-SOD基因启动子区域的募集，与SP-1相互作用，形成类似SP-1/STAT3的转录单位，然后激活Mn-SOD基因转录。在我们的EMSA和ChIP分析中，一个真正的STAT3结合位点（−285到−277 bp）存在于小鼠Mn-SOD启动子中SP-1结合基序的下一个位点（-275到−266 bp）附近。因此，在Mn-SOD转录调控中，SP-1和STAT3之间存在一种似是而非的相互作用。

有趣的是，在我们的研究中，再灌注后通过STAT3抑制Mn-SOD表达的动态变化导致O的过度生成2·−脑缺血损伤。我们发现O的生成2·−]再灌注后小鼠脑缺血损伤明显加重(图7A类)STAT3抑制增加了初级皮层神经元中的超氧化物水平(图7B类). 超氧化物能与一氧化氮迅速反应，该反应的副产物是在蛋白质或游离酪氨酸的酪氨酸残基上形成3-硝基酪氨酸(Ischiropoulos，1998年). 我们发现，通过STAT3抑制，初级皮层神经元和大脑皮层中的蛋白质亚硝化反应强烈增加(图7C类,E类). 此外，我们发现超氧化物的过度生产(图7B类)通过STAT3失活抑制Mn-SOD表达导致3-硝基酪氨酸增加(图3A类,C类,​,77C类,E类). 这些发现在SOD2−/+缺陷小鼠中得到证实，通过STAT3抑制定量3-硝基酪氨酸(图8A–C). 与SOD2−/+杂合基因敲除小鼠大脑皮层中的STAT3抑制相比，我们无法检测到3-硝基酪氨酸水平的任何显著变化(图8C类). 这些结果强烈表明O的过度生产2·−缺血再灌注损伤是由于STAT3失活导致Mn-SOD减少所致。

众所周知，线粒体产生的活性氧是氧化应激诱导神经细胞死亡的关键中介体(Chan，2001年). 我们发现SOD2 WT小鼠初级皮层神经元中的细胞死亡以及STAT3抑制引起的蛋白质亚硝化显著增加。然而，在SOD2−/+小鼠初级皮层神经元中，我们在载体处理组和STAT3抑制组之间的细胞死亡和3-硝基酪氨酸方面没有发现任何显著差异(图8D类,E类). 这些结果有力地表明，Mn-SOD是STAT3在再灌注诱导的与O相关的神经元细胞死亡中的靶点2·−STAT3活性参与ROS水平的调节，ROS水平在缺血再灌注下触发神经元细胞死亡。通过抑制STAT3，我们还观察到短暂局灶性脑缺血导致的梗死体积增加(图9A类)OGD/复氧导致的神经元死亡增加(图9B类,D类). 此外，STAT3特异性siRNA单独引起的STAT3抑制显著增加了神经细胞死亡(图9C类,E类). 我们发现STAT3抑制增加了细胞色素的释放c（c）初级皮层神经元(图10B类)并诱导Bax和裂解Specrin(图10D类). 此外，Bax的诱导作用更强，细胞色素的释放c（c）当我们用药物抑制STAT3时，观察到OGD/复氧引起的裂解光谱蛋白(图10A类,C类). 这些结果表明，失活的STAT3在缺血再灌注时触发线粒体依赖性神经元死亡，也表明STAT3可以作为脑损伤（如缺血再灌注和中风）的临床治疗靶点。事实上，许多最近的报告支持STAT3激活在中风中的神经保护作用。注射IL-6受体抗体引起的STAT3去磷酸化增加了MCAO后小鼠的凋亡和梗死面积(Yamashita等人，2005年). 雌二醇诱导的STAT3磷酸化降低MCAO后大鼠梗死面积(Dziennis等人，2007年). 分泌尿素通过STAT3诱导的抗凋亡蛋白表达促进初级皮质细胞对OGD的神经保护，并通过激活STAT3减少MCAO后大鼠的梗死面积，促进神经元可塑性(Shyu等人，2008年). 然而，一些研究报告称，STAT3在缺血后24小时甚至几天的时间点被激活(Dziennis和Alkayed，2008年)与我们的研究相反，我们的研究显示STAT3在缺血后1-3小时内立即失活。STAT3对刺激的早期反应可以解释为典型的转录因子反应。STAT3在缺血再灌注早期和晚期的反应可能具有不同的作用。在我们的研究中，脑缺血再灌注后通过STAT3抑制Mn-SOD表达的减少对再灌注诱导的神经细胞死亡至关重要。然而，我们发现使用IL-6恢复STAT3活性可以在小鼠脑缺血再灌注后挽救Mn-SOD的表达（补充图2，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这一结果表明，STAT3的恢复可以挽救脑缺血损伤后的神经细胞。

总之，我们首次证明了STAT3是一种新型转录调节剂，在正常条件下可以上调Mn-SOD基因在小鼠脑中的表达，作为一种神经保护剂，并且STAT3在脑缺血再灌注条件下失去活性，无法维持Mn-SOD的表达。此外，本研究通过STAT3失活导致Mn-SOD表达减少，清楚地阐明了脑缺血损伤后ROS过度生成的机制，并为脑缺血损伤后因STAT3失去活性而导致神经元细胞死亡的模型提供了解释。因此，我们的研究表明，脑缺血损伤后再灌注后早期恢复STAT3活性是一种潜在的新的分子靶向治疗各种类型的缺血性脑损伤（包括中风）的方法。

脚注

这项工作得到了P.H.C.国家神经疾病和中风研究所的Grants P50 NS014543、R01 NS025372、R01 NS 036147和R01 NS038653的支持。内容完全由作者负责，不一定代表国家神经疾病和中风研究所或国家卫生研究所的官方观点。我们感谢Liza Reola和Bernard Calagui的技术支持，感谢Cheryl Christensen的编辑支持，感谢Elizabeth Hoyte的数字准备。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会