T-bet在1型炎症期间控制调节性T细胞内稳态和功能

T型_规则细胞在1型炎症中上调T-bet

CXCR3的频率⁺T型_规则胸腺中的细胞明显低于脾脏，脾脏T细胞的百分比_规则表达CXCR3的细胞随年龄增长而增加(补充图3在线）。这表明T_规则细胞上调T-bet以响应特定的外周线索，可能与诱导1型炎症有关。确定T-bet⁺T型_规则细胞在强T期间分化和/或膨胀_H（H）1-提升条件体内，我们向野生型小鼠注射激动性CD40特异性抗体。这种治疗会诱发强烈的T_H（H）1条回复体内，并保护Balb/c小鼠感染大型利什曼原虫通过转换其特征T_H（H）2对保护性T的响应_H（H）1个响应³¹事实上，T-bet的频率和绝对数量⁺CXCR3型⁺T型_规则与给予大鼠IgG的对照小鼠相比，抗CD40处理的小鼠脾脏和淋巴结中的细胞显著增加(图2a和数据未显示）。T-bet的增加⁺T型_规则抗CD40治疗动物的细胞不仅仅是增强增殖的副产品，因为IL-2免疫复合物（IL-2C）诱导的强劲增殖并没有增加CXCR3的比例⁺T型_规则单元格(补充图4在线）³².确定T-bet⁺T型_规则细胞来源于T-bet^-Foxp3系列⁺前体，我们对CD4进行分类⁺Foxp3系列⁺CXCR3型^-cd62升⁺用GFP盒敲入报告小鼠脾脏和外周淋巴结的细胞Foxp3系列轨迹（Foxp3^{绿色荧光粉}然后将这些细胞转移到缺乏内源性T细胞的小鼠（TCRβδ-KO小鼠）中(图2b). 与大鼠IgG治疗不同，抗CD40治疗导致大多数转移的T细胞中T-bet和CXCR3表达上调_规则单元格(图2c). 值得注意的是，抗CD40治疗并未诱导转移的CD4中Foxp3的表达⁺Foxp3系列^-CXCR3型^-cd62升⁺T细胞。因此，T_H（H）1-诱导条件促进从头开始Foxp3中T-bet表达的诱导⁺T型赌注^-T型_规则细胞，在这个实验系统中T-bet⁺T型_规则细胞不是由原始CD4外周诱导的⁺Foxp3系列^-细胞。

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图2

T型赌注⁺T型_规则细胞上调T-bet体内抗CD40治疗后

（a）用抗CD40（顶部）或大鼠IgG（底部）处理的小鼠脾细胞中T-bet和Foxp3表达的分析。CD4门控图⁺细胞。图中的数字表示所示标记阳性细胞的百分比。数据是三个独立实验的代表。(b）（顶部）通过流式细胞术分析来自指定细胞的TCRβδ-KO受体和接受指定处理的脾细胞。淋巴细胞上的点图是门控的。直方图显示CD4中CXCR3和T-bet的表达⁺Foxp3系列⁺从抗CD40（开放直方图）或大鼠IgG（阴影直方图。点图中的数字表示Foxp3的百分比⁺CD4细胞⁺淋巴细胞总数的细胞。数据代表了每组三只小鼠的两个独立实验。

T-bet首先表示为发展T_H（H）1 T细胞受体结扎后的细胞通过其相关的信号适配器STAT1通过IFN-γ受体（IFN-γR）进行信号传递³³此外，稳定的T-bet表达和对T的全面承诺_H（H）1血统依赖于通过同源受体的IL-12信号³⁴.确定T中的T-bet感应_规则细胞通过类似的机制发生，我们分析了CD4⁺Foxp3系列⁺从缺乏IFN-γR1、STAT1和IL-12p40的小鼠分离的细胞。有趣的是，CXCR3的发病率显著降低⁺T型赌注⁺T型_规则缺乏STAT1或IFN-γR1的小鼠细胞(图3a). 相反，与年龄匹配的对照组相比，CXCR3的比例没有下降⁺T型_规则IL-12p40缺乏小鼠的细胞（数据未显示）。此外，缺乏IL-4或STAT6（两种对T细胞至关重要的分子）的小鼠_H（H）2细胞分化——也包含CXCR3的正常频率⁺T型_规则单元格(补充图5在线）。总之，这些发现表明T-bet在T细胞中的表达_规则细胞在T期诱导_H（H）1通过IFN-γ依赖、IL-12非依赖信号通路的应答。确定T细胞中IFN-γR的表达_规则细胞是T-bet和CXCR3最佳表达所必需的，我们使用野生型和Ifngr1号机组^-/-供体，并确定每个供体对不同淋巴细胞群的贡献。鉴于野生型和Ifngr1号机组^–/–BM对B细胞和CXCR3的产生有同等的贡献^-T型_规则电池，CXCR3⁺T型_规则细胞主要来源于野生型供体(图3b，c)，证明IFN-γ反应性是T-bet和CXCR3的最佳表达所必需的_规则细胞。总之，这些数据提供了强1型炎症反应期间产生的IFN-γ与T_规则细胞，支持T-bet在T细胞中选择性诱导的假设_规则T期间的细胞_H（H）1介导的炎症。

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图3

IFN-γR和STAT1通过T_规则细胞

（a）WT脾细胞CXCR3表达，Ifngr1号机组^–/–，或状态1^–/–小鼠（每个基因型n≥3只）。直方图在CD4上选通⁺Foxp3系列⁺细胞。数字表示CXCR3的百分比⁺CD4细胞总数⁺Foxp3系列⁺. (b）图中描述了WT:Ifngr1号机组^–/–-CXCR3中的衍生淋巴细胞⁺CD4细胞⁺Foxp3系列⁺、CXCR3^-CD4细胞⁺Foxp3系列⁺或CD4^-B220型⁺11个混合BM嵌合体的外周血淋巴细胞。每个点代表一个单独的鼠标。使用双向重复测量方差分析确定统计显著性。Bonferroni后测试用于获得P（P）-所示成对比较的值。（c）CXCR3和T-bet在从WT分离的脾细胞上的表达：Ifngr1号机组^–/–BM嵌合体。CD4门控图⁺Foxp3系列⁺WT衍生的细胞（CD45.1⁺)或Ifngr1号机组^–/–-衍生（CD45.2⁺)BM如图所示。点图中的数字表示CXCR3阳性细胞的百分比。数据是以这种方式分析的四只小鼠的代表性数据。

T-bet的功能表征⁺T型_规则细胞

CD4内⁺T细胞、T-bet和Foxp3指导不同的转录程序，可能导致相反的功能结果。T-bet绑定并激活Ifng公司并且是CD4产生IFN-γ所必需的⁺T细胞³⁵然而，Foxp3可以抑制IFN-γ的表达_规则细胞通常不产生促炎细胞因子。因此，我们检测了从Foxp3分离的脾细胞产生IFN-γ的情况^{绿色荧光粉}老鼠跟随在体外佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）和离子霉素刺激(图4a). 如预期，Foxp3中IFN-γ的产生^-细胞主要局限于T-bet⁺人口。然而，很少有Foxp3⁺T型赌注⁺细胞产生IFN-γ。此外，CXCR3⁺T型_规则从抗CD40治疗的Foxp3中分选的细胞^{绿色荧光粉}小鼠有效抑制CD4的增殖⁺CD25型^-T细胞在体外证明了它们的抑制能力(图4b).

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图4

T-bet的功能表征⁺Foxp3系列⁺T型_规则细胞

（a）通过T-bet表达IFN-γ和Foxp3⁺CD4细胞⁺（右上角）和T-bet^-CD4细胞⁺（右下）用PMA和离子霉素刺激后从WT小鼠分离的淋巴细胞。左直方图在总CD4上选通⁺单元格，并指示用于定义点图中描述的人口的门。图中的数字表示所示标记阳性细胞的百分比。数据代表了以这种方式分析的五只以上的老鼠。（b）CFSE标记CD4的增殖⁺CD25型^-与辐照脾细胞、抗CD3和抗CD28孵育的T细胞，有或没有不同浓度的CXCR3⁺T型_规则细胞。直方图上方的数字表示T_规则：T_效率每个培养物中的细胞比率。无刺激，对照无辐射脾细胞和刺激性抗体。数字表示T的百分比_效率CFSE单元格^-.（c）门控CD4上指示标记的表达⁺CXCR3型⁺（顶部）或CD4⁺CXCR3型^-（底部）WT小鼠的脾细胞。数字表示每个标记物阳性细胞的频率，作为CD4总量的一部分⁺Foxp3系列⁺细胞。数据是以这种方式分析的三只老鼠的代表性数据。

CXCR3型⁺T型_规则细胞高表达GITR、CTLA-4和CD103，低表达CD25，与“效应/记忆样”T的表型一致_规则单元格(图4c)²⁰相应地，CXCR3⁺T型_规则细胞中含有丰富的T细胞mRNA_规则细胞相关效应分子IL-10、TGF-β和颗粒酶B(补充图6在线）。此外，对Foxp3进行了排序⁺CXCR3型⁺在过继转移到充满淋巴的宿主中后，细胞保持CXCR3和T-bet的表达至少两周，这表明T-bet的表达是这种T细胞的稳定特征_规则单元子集(补充图7在线和未显示的数据）。

T-bet调节T_规则细胞内稳态

T-bet控制发育中T细胞的增殖和选择_H（H）1个单元格体内^1,34因此，我们假设T-bet可能对T很重要_规则T细胞增殖和/或存活_H（H）1-通过抗CD40治疗诱导的促进条件。为了测试这一点，我们联合注射纯化的CD45.2⁺T-bet缺陷和CD45.1⁺野生型T_规则细胞注入TCRβδ-KO小鼠，用抗CD40、IL-2C或大鼠IgG治疗受体动物，并在一周后检查受体动物脾脏中每个群体的频率和绝对数量(图5a). 与T-bet在调节T中的作用一致_规则细胞内稳态_规则抗CD40治疗后，细胞被野生型细胞竞争(图5b). 实际上，T-bet-deficient T的绝对数_规则从抗CD40治疗的小鼠中回收的细胞低于大鼠IgG治疗的对照组，这表明T-bet可以促进T细胞的存活和/或增殖_规则1型炎症状态下的细胞(图5b). 此外，野生型和Tβ缺陷型T_规则在给予IL-2C的动物中，细胞进行了强有力的扩增，表明T-β缺陷型T细胞的失败_规则抗CD40治疗小鼠的细胞膨胀并不是因为普遍无法存活和增殖体内试验。

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图5

T-β缺陷型T细胞增殖减少_规则抗CD40治疗后的细胞

（a）显示细胞转移和处理时间表的实验设计。简单地说，CD45.1的混合物⁺WT和CD45.2⁺Tbx21塔布^–/–T型_规则将细胞注射到TCRβδ-KO小鼠体内，然后用指定的抗体进行治疗。指示时，将溴化铀添加到饮用水中。（b）用流式细胞术分析受体小鼠脾细胞CD45.1的表达。直方图在Foxp3上选通⁺CD4细胞⁺TCRβ⁺B220型^-细胞和数字表示CD45.1阳性和阴性细胞的百分比。图中显示了WT和Tbx21塔布^–/–-导出T_规则从受体小鼠的脾脏中回收细胞。每个点代表一只单独治疗的小鼠。（c）用流式细胞术分析受体小鼠脾细胞的BrdU掺入。Foxp3上的点图是选通的⁺CD4细胞⁺TCRβ⁺B220型^-脾细胞。图中的数字表示BrdU的百分比⁺总WT-（CD45.1）中的细胞⁺)或Tbx21塔布^–/–-衍生（CD45.1^-)T型_规则细胞。图中描述了BrdU的频率⁺WT和Tbx21塔布^–/–-导出T_规则细胞群体。对于b条和c（c），使用双向重复测量方差分析确定统计显著性。Bonferroni后测试用于获得P（P）-所示成对比较的值。数据代表三个独立实验，每组三只或更多只小鼠

直接比较野生型和T-β缺陷型T细胞的增殖_规则在抗CD40、IL-2C或大鼠IgG治疗的最后48小时内，我们在受体小鼠的饮用水中给药核苷酸类似物5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）(图5c). 由于TCRβδ-KO动物体内存在淋巴细胞减少环境，大多数野生型和Tβ缺陷型T_规则在大鼠IgG处理的小鼠中，细胞合并了BrdU。IL-2C治疗进一步增强了这两种人群的增殖，这与它们在这些条件下的类似积累相一致。相反，T-β缺陷型T细胞的增殖反应_规则抗CD40治疗后的细胞明显减弱。T-bet靶基因CXCR3和IL-12Rβ2与T_H（H）1细胞分化和选择^34,36,37然而，CXCR3-和IL-12Rβ2-缺陷T的增殖_规则抗CD40治疗后细胞相当于野生型(补充图8在线）。

因为T-bet是在T中诱导的_规则在抗CD40治疗后，我们推断T-bet对T细胞也很重要_规则以T为主的持续感染期间的细胞适应度_H（H）1免疫反应。气溶胶感染后百万吨，两个T_H（H）1个效应细胞和T_规则细胞在引流的纵隔淋巴结（dLN）中增殖，并与肺部肉芽肿（IFN-γ介导的炎症病灶）平行流动^17,38T的“平衡”反应_H（H）1个细胞和T_规则在肺部肉芽肿内建立的细胞可以控制结核杆菌，但不能根除。在百万吨-感染小鼠，T-bet⁺T型_规则细胞在微生物复制的三个主要部位高度富集：肺、dLN和脾脏(图6a). 相比之下，很少有T-bet⁺T型_规则在未累及的肠系膜淋巴结（mLN）中发现细胞，在慢性T淋巴细胞增多症小鼠的肺部也未发现细胞积聚_H（H）过敏原细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素过度表达引起的2介导的肺部炎症(SPC-Tslp公司老鼠，补充图9在线）³⁹.

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图6

T-β缺陷型T的体内平衡受损_规则细胞持续存在期间百万吨感染

（a）T-bet和Foxp3在从指定组织分离的细胞上的表达百万吨-感染小鼠（左）或未感染年龄匹配的对照组（右）。CD4门控图⁺T细胞。数字显示每个指示象限中的单元格百分比。数据是五个独立实验的代表。（b）（左）WT（CD45.1）混合物的接受者⁺)和Tbx21塔布^–/–（第45.2页⁺)BM感染了百万吨持续105天。用流式细胞术分析从指定器官中分离的细胞。等高线图描述了选通策略，数字表示标记阳性细胞的百分比。图中描述了WT和Tbx21塔布^–/–-门控CD4中的衍生细胞^-CD8（CD8）^-DN，CD4细胞⁺Foxp3系列⁺T型_规则和CD4⁺Foxp3系列^-CD44细胞^你好T型_效率人口。每个点代表单个感染BM嵌合体的值。数据代表了两个独立的实验（每个实验n=3）。

通过T确定T-bet表达式_规则细胞在持续感染期间对其竞争适合性很重要，我们使用野生型和T-β缺陷供体构建了混合BM嵌合体，并计算了野生型与T-β缺乏供体的比率_规则肺、dLN和脾脏中的细胞百万吨感染(图6b). 作为对照人群，我们检测了野生型：Tβ缺陷型CD4的比率⁺CD44细胞^你好Foxp3系列^-效应T细胞（T_效率)和CD4^-CD8（CD8）^-（DN）细胞，主要是B细胞。与T-bet-deficient T相比，野生型T的富集倍数为3-5倍_规则感染动物组织中的细胞，表明T-β缺乏T_规则细胞在百万吨感染(图6b). Tβ缺陷型CD4⁺Foxp3系列^-CD44细胞^你好效应T细胞也被野生型效应T细胞竞争，这与T-bet在导向T细胞中的专属性作用一致_H（H）1细胞分化和积累³⁴相反，野生型和Tβ缺陷型DN细胞在每个组织中以1:1的比例存在，表明造血前体细胞的植入相等。这些数据证实了我们在抗CD40治疗小鼠中的结果，并证明T-bet调节T细胞的内稳态_规则强T细胞_H（H）1个答案由百万吨感染。

我们感谢L.Thompson和K.Smigiel提供的技术援助，G.Debes（宾夕法尼亚大学）、K.Konowski（佐治亚大学）和J.Hamerman对手稿的评论，以及M.Warren提供的行政援助。这项工作得到了NIH（DK072295、AI067750和AI069889）和国防部（USAMRAA W81XWH-07-0246）向D.J.C.提供的资助，以及Burroughs-Wellcome基金生物科学职业奖向K.B.U.提供的资助。M.A.K.是华盛顿大学医学院免疫学系（T32-CA009537）的培训补助金获得者。

骨髓嵌合体与新生儿移植

来自WT股骨的BM细胞，Tbx21塔布^-/-和Ifngr1号机组^-/-获得小鼠并耗尽CD4⁺使用抗CD4微球的细胞（Miltenyi Biotech）。8×10⁶WT（CD45.1）和Tbx21塔布^-/-（CD45.2）或Ifngr1号机组^-/-（CD45.2）BM逆行注射到RAG1^-/-1000拉德致死照射后的小鼠。对于新生儿过继移植，CD4⁺CD25型⁺从WT或Tbx21塔布^-/-小鼠通过使用CD4 T细胞分离试剂盒（Invitrogen）进行磁性分离，然后使用CD25阳性分离试剂盒进行磁性分离（Miltenyi Biotech）。1×10⁶CD4细胞⁺CD25型⁺将细胞（纯度>90%）重新悬浮在25ul PBS中，然后腹腔注射到1-2天大的小鼠体内平方英尺新生儿。监测小鼠的疾病外部症状，并在25-60天后处死小鼠进行分析。

流式细胞术和细胞分选

按说明进行细胞分离²¹流式细胞术中，用以下鼠蛋白特异性直接结合抗体对细胞进行表面染色：抗CD4（GK1.5）、抗CD62L（MEL-14来自eBioscience，抗CXCR3（220803）和抗CCR6（140706）来自研发系统。为了评估功能性P-选择素配体的表达，首先用P-选择素人IgM融合蛋白孵育细胞，然后用生物素化的山羊抗人类IgM（Jackson Immunoresearch）和链霉亲和素PE（eBioscience）孵育。数据通过FACsCalibur或LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）获得，并使用FlowJo软件（Treestar）进行分析。对于细胞分类实验，CD4⁺使用Dynal CD4 T细胞阴性分离试剂盒（Invitrogen）富集细胞，对所需细胞表面标记物进行染色，并使用FACS Vantage（BD Biosciences）进行分离。

胞内染色

对于IFN-γIL-4、IL-17、Foxp3和/或T-bet的细胞内染色，淋巴细胞表面染色，然后用eBioscience FixPerm缓冲液渗透。然后用抗IFN-γ（XMG1，eBioscience）、抗IL-4（11B11，eBioscience，）、抗IL-17（TC11-18H10.1，Biolegend）、抗Foxp3（FKJ-16s；eBioschience）和/或纯化的抗T-bet（4B10；Santa Cruz Biotech）或mIgG1同型（P3，eBioscience）在含有HBSS、1%BSA、10mM Hepes和0.5%皂苷的染色介质中洗涤和染色30分钟。为了检测T-bet，用抗mIgG1-APC或-PE（A85-1；BD Pharmingen）进行二次染色。对于BrdU掺入，在处死前连续2天在饮用水中以0.8mg/mL的浓度施用BrdU。对于细胞内Foxp3和BrdU染色，使用改良的BrdU着色方案。分离淋巴细胞并进行表面染色，然后在eBioscience FixPerm中固定30分钟。然后按照BrdU Flow Kit制造商的说明（BD Pharmingen）对细胞进行BrdU染色。

体外抑制试验

从抗CD40处理的Foxp3的脾脏中分离淋巴细胞^{绿色荧光粉}小鼠，富含CD4⁺使用Dynal CD4 T细胞阴性分离试剂盒（Invitrogen）和Foxp3的细胞⁺CXCR3型⁺对细胞进行FAC分选。CD4细胞⁺CD25型^-使用Dynal CD4 T细胞阴性分离试剂盒从同源标记的B6.SJL小鼠的脾脏和淋巴结中分离出效应淋巴细胞。CD25型^-通过抗CD25-PE染色分离细胞，然后使用抗PE微球进行磁性分离（Miltenyi Biotech）。CD4的最终悬浮液⁺CXCR3型⁺GFP公司⁺细胞和CD4⁺CD25型^-细胞纯度>95%。CD4细胞⁺CD25型^-细胞在37°C水浴中与0.8μM羧基荧光素黄瓜酰酯（CFSE）在PBS中孵育9分钟，用100%小牛血清洗涤并在完全培养基中重新悬浮。在每个培养皿中，CFSE标记的CD4⁺CD25型^-T细胞与T细胞耗竭、辐射（2500 Rad）的脾细胞孵育，添加或不添加分选的T细胞_规则细胞。所有受刺激培养物均接受5μg/mL的抗CD3（2C11）和2μg/mL抗CD28（37.51）。CD45.1的增殖⁺CD4细胞⁺CD25型^-与不同比例的T细胞共同孵育期间的T细胞_规则通过评估培养110小时后CFSE的相对稀释度来测量细胞。

趋化性测定

所有重组小鼠趋化因子均购自Peprotech。从WT、，Tbx21塔布^-/-和Cxcr3号机组^-/-小鼠在37°C，5%CO下孵育₂在2×10的全培养基中培养1h⁶/毫升。然后洗涤细胞并在10×10下重悬⁶/mL和1×10⁶将细胞加入到5μM孔transwell（Costar）的顶部腔室中。在完全培养基中稀释趋化因子，并将其添加到培养箱底部，最终浓度为100nM。将完整的培养基单独添加到控制室的底部。对每种趋化因子或培养基对照的趋化性进行三次测量。在37°C、5%C0下孵育90分钟后₂从每个孔的底部采集100μl，并添加到固定数量的15μm乳胶珠（Polysciences，Inc）中，以计算向每个趋化因子或介质的总迁移量。然后合并复制孔并对其进行CD4和Foxp3染色。通过归一化迁移CD4的频率来计算%的特异性迁移⁺Foxp3系列⁺T型_规则细胞到输入群体。

体外T细胞刺激和细胞因子分析

6×10⁶用50ng/mL PMA和1μg/mL离子霉素在1ml完全培养基中的10μg/mL莫能菌素刺激红细胞缺失的野生型脾细胞4小时，37°C，5%CO₂刺激后，收获细胞，表面染色，用eBioscience FixPerm透化，并用抗细胞因子和转录因子的抗体染色。

结核分枝杆菌感染

老鼠被声波感染百万吨菌株H37Rv使用气溶胶感染室（Glas Col）。感染后1天处死一组野生型小鼠以确定感染剂量。在每个实验中，50-100个菌落形成单位（CFU）沉积在每只小鼠的肺部。

抗CD40和IL-2C给药

在第0天、第2天和第4天，将25μg抗CD40抗体（克隆IC10，eBioscience）或25μg大鼠IgG（Sigma）注入小鼠腹腔（i.p）。对于IL-2C治疗，将50μg抗IL-2（JES6）与1.5μg重组小鼠IL-2（无载体，eBioscience）在4°C的PBS中培养过夜。在第0天和第2天，小鼠腹腔注射IL-2C。第6天处死所有小鼠。在竞争实验中，细胞在第1天通过逆转录注射进行过继转移。

定量聚合酶链反应

根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy柱进行RNA提取，并使用Omniscript RT Kit（Qiangen）生成cDNA。预合成Taqman基因表达分析（应用生物系统）用于扩增Tbx21塔布（Mm00450960_ml），Il10号机组（Mm99999052_m1），Gzmb公司（Mm00442834_m1），以及Tgfb1型（Mm01178820_m1）mRNA转录本。Actb公司与感测引物TGACAGGATGAGAGAGAGGAGAT、反感测引子GCGCTCAGGAGAAT和探针FAM-ACTGCTGCTCCTAGCACATAMRA一起用作内部对照。目标基因值相对于Actb公司.