CCR3是新生血管年龄相关性黄斑变性的治疗和诊断靶点

摘要

AMD影响全球3000万至5000万人，约90%的严重视力损失归因于CNV¹由于人口老龄化，预计未来十年全球CNV流行率将翻一番。靶向促血管生成细胞因子血管内皮生长因子（VEGF）-A已在CNV患者中得到验证^2-4然而，只有三分之一的VEGF-A拮抗剂治疗的患者视力显著改善，六分之一的治疗患者仍进展为合法失明。此外，持续阻断VEGF-A的安全性令人担忧，VEGF-A在正常成人视网膜中组成性表达⁵，正在兴起^6,7因此，基于更具体针对CNV的治疗策略是可取的。然而，还没有人CNV特异性分子标记的报道。

CCR3在人眼中的表达仅限于CNV

在我们研究趋化因子在血管生成中的作用时，我们发现CCR3（也称为CD193）是一种趋化因子受体，以其在促进嗜酸性粒细胞和肥大细胞贩运中的作用而闻名⁸，仅在AMD导致的CNV中表达于人类脉络膜内皮细胞（CECs），而在其他非增殖或增殖的脉络膜血管中不表达(图1). 免疫定位研究表明，CCR3在所有经手术切除的AMD患者（18/18）CNV组织的CEC中表达，这些患者之前未接受AMD治疗(图1a、b;补充图S1). 相反，CCR3在任何早期（萎缩性）AMD患者（0/10）或年龄匹配的非AMD患者的脉络膜CECs中均不表达(图1c，d). CCR3在视网膜前纤维膜患者手术切除的组织（0/6）或脉络膜黑色素瘤患者的CECs中也没有免疫定位（0/8）(图1e、f). 总的来说，这些数据表明CCR3的一种高度特异的表达模式(P（P）= 7×10⁻¹⁴，精确列联表测试）。此外，我们确定了CCR3配体eotaxin-1（CCL11）、-2（CCL24）和-3（CCL26）在AMD患者手术切除CNV组织的所有检测标本中的表达，这些患者之前未接受AMD治疗(图1g-j)表明eotaxin-CR3轴可能在这种疾病状态中发挥作用。有趣的是，尽管嗜酸性粒细胞趋化因子丰富，但在人类CNV中还没有发现嗜酸性细胞和肥大细胞(补充图S2)与早期发现一致⁹.

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图1

CCR3和eotaxins在脉络膜新生血管中表达。a、 b、，免疫荧光显示CCR3（绿色）受体表达与CD31共定位⁺手术切除的人类年龄相关性黄斑变性（AMD）脉络膜新生血管（CNV）组织中表达（红色）的血管。DAPI染色细胞核呈蓝色。b中，CCR3染色的特异性通过没有用同型对照IgG染色来证实(一). 单个红色和绿色荧光通道如所示补充图S1.c、 日期：，CCR3在CD31中没有免疫定位⁺无CNV的萎缩性AMD患者脉络膜中的（红色）血管（白色箭头）(c（c）)或无AMD的老年患者(d日). 可见视网膜色素上皮（白色箭头）和覆盖在脉络膜上的布鲁赫膜（星号）的自体荧光(c、 d日).e、 f中，手术切除的无血管视网膜纤维化组织中不表达CCR3(e（电子）)或脉络膜黑色素瘤血管内(（f）).g-j，免疫组织化学（金棕色反应产物）显示CCL11的表达(克)，CCL24(小时)和CCL26(我)在手术切除的AMD CNV组织中，主要在基质（红色箭头）中，也在血管中（黄色箭头）。染色的特异性通过没有用同型对照IgG染色来确认(j个). 比例尺，10μm。

CCR3刺激促进CEC迁移和增殖

迄今为止，CCR3最清楚的病理功能是其在哮喘等过敏性疾病中的作用^10-14和嗜酸性食管炎¹⁵。关于其在血管生成中的直接作用只有一份报告¹⁶虽然据报道嗜酸性粒细胞和肥大细胞参与血管生成^17,18，此类操作被视为次要或孤立的。因此，我们研究了CCR3调节对血管生成的影响在体外和体内中和抗CCR3抗体抑制在Matrigel中培养的原代人CEC的试管形成在体外(图2a). 在野生型小鼠激光损伤CNV的实验模型中^19-24，中和抗CCR3抗体降低了CEC的比例体内处于细胞周期的增殖状态(图2b). 与这一发现一致，三种嗜酸性粒细胞趋化因子均刺激人类CEC增殖(图2c). 通过单体肌动蛋白聚合成微丝F-actin而进行的细胞骨架重排对嗜酸性粒细胞趋化性是必不可少的，也是内皮细胞血管生成迁移的关键。用三种嗜酸性粒细胞趋化因子中的任何一种刺激人CECs可诱导肌动蛋白分子的快速聚合(图2d，e). 所有三种嗜酸性粒细胞趋化因子也激活了Rac-1(补充图S3)，一种小GTPase，在调节内皮细胞扩散和迁移中起关键作用，并以剂量依赖的方式促进人类CEC迁移(图2f). 总的来说，这些数据表明CCR3激活可以促进血管生成的多个步骤。CCR3在CECs上的表达体内仅限于CNV组织；然而，在体外，人CEC对CCR3配体有反应。这可能是由于培养基中存在多种CNV促进生长因子所致。

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图2

CCR3激活促进血管生成。a、，Matrigel中原代人脉络膜内皮细胞（CECs）的管形成在体外与同型IgG相比，通过中和抗人CCR3抗体（Ab）而减少。n＝6*P（P）与同型IgG相比<0.05。b中，CD31的分数⁺血管内皮生长因子2⁺门控鼠标CEC体内与对照组（未受伤的眼睛）相比，野生型小鼠眼睛在激光损伤后5天的增殖状态（S期）增加，并且与同种型IgG相比，通过眼内给予中和抗小鼠CCR3-Ab而减少。n=6–10*P（P）与IgG治疗相比<0.05。c、，用eotaxins刺激24小时可诱导人CEC增殖。n=4*P（P）与牛血清白蛋白（BSA）治疗相比，<0.05。d、 e、，用嗜酸性粒细胞趋化因子（而非PBS）刺激可诱导人CEC中的肌动蛋白聚合。F-actin的相对含量表示为嗜酸性粒细胞趋化蛋白和介质单独刺激细胞之间的平均通道荧光比率(d日). 罗丹明-球蛋白染色（红色）显示嗜酸性粒细胞趋化因子刺激细胞中F-actin纤维的形成(e（电子）). DAPI染色细胞核呈蓝色。显示了3-4个独立实验的代表性数据。c、 e、，CCL11（10 ng/ml）、CCL24（100 ng/ml。f、，用嗜酸性粒细胞趋化因子刺激16小时可诱导人CEC在8μm孔径Transwell上的剂量依赖性迁移。n=5-10*P（P）与BSA处理相比<0.05。(a–c，f)Mann-Whitney U检验的显著性。误差条描述s.e.m。

CCR3受体或配体拮抗抑制CNV

我们研究了体内CCR3靶向对激光损伤CNV小鼠模型的影响²²这是这种疾病应用最广泛的动物模型。单次眼内注射CCR3中和抗体或小分子CCR3受体拮抗剂（（S）-甲基-2-萘甲酰胺-3-（4-硝基苯基）丙酸）均能剂量依赖性抑制野生型小鼠中激光损伤诱导的CNV(图3a-c). CNV在抄送人3^−/−老鼠²⁵与野生型小鼠相比(图3d). 通过证明CNV在抄送人3^−/−使用CCR3中和抗体或CCR3受体拮抗剂的小鼠（分别为对照组的116±7%和109±16%；n=5；P（P）> 0.1). CCL-11和CCL-24是CCR3的主要小鼠配体，在激光损伤后很快显著增加，免疫定位于靠近CEC的视网膜色素上皮（RPE）(图3e、f). 此外，人类RPE细胞合成了所有三种嗜酸性粒细胞趋化因子(补充图S4)这些细胞大量散布在CNV中⁹，作为CNV中CCR3配体的来源。两者的基因消融第11类(^参考26)或第24条(^{参考文献12})CNV降低，而新生血管反应第11类^−/−×第24条^−/−老鼠¹²比任何一只“单敲除”小鼠受到更大程度的抑制，表明这两种配体在这个系统中相互合作(图3g). 单次眼内注射抗CCL-11或CCL-24的中和抗体也能抑制野生型小鼠的CNV(图3h，i)验证这些CCR3配体作为抗血管生成靶点。总之，这些数据表明CCR3激活对于体内新生血管性AMD临床前模型中最广泛使用的血管生成。

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图3

通过CCR3或eotaxin消融或不依赖白细胞调节的阻断降低CNV。a、 b、，与同型IgG相比，通过中和抗鼠CCR3 Ab可减少野生型小鼠中激光诱导的CNV(一)与载体（PBS/DMSO）相比，CCR3受体拮抗剂（RA）SB328437（（S）-甲基-2-萘酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸）(b条)以剂量依赖的方式。n=8-12*P（P）与无抗体或受体拮抗剂相比，<0.05。c、，药物治疗小鼠中CNV的典型示例。日期：，激光诱导的CNV在抄送人3^−/−小鼠与野生型小鼠的比较。n＝9*P（P）与野生型小鼠相比，<0.05。e、，激光损伤野生型小鼠后，ELISA测定的环氧合酶-1（Ccl-11）和环氧合酶-2（Ccl-24）蛋白水平升高。n＝6*P（P）< 0.05, #P（P）与0 h基线相比，<0.01。f、，野生型小鼠激光损伤后第1天，Ccl-11和Ccl-24免疫荧光（绿色）定位于CD31+（红色）脉络膜内皮细胞（箭头）附近的视网膜色素上皮细胞层（箭头）。DAPI染色细胞核呈蓝色。同型对照IgG未检测到特异性免疫荧光。显示了代表3个独立实验的图像。g中，激光诱导的CNV在第11类^−/−和中第24条^−/−小鼠与野生型小鼠的比较。n=8-10*P（P）与野生型小鼠相比，<0.05。年CNV进一步降低第11类^−/−×第24条^−/−小鼠与单个无效小鼠相比#P（P）与单个空白小鼠相比，<0.05。小时，与同种型IgG相比，通过中和针对小鼠CCL11或CCL24的抗体降低了野生型小鼠中激光诱导的CNV。n=7–10*P（P）与不注射（对照）或IgG相比，<0.05。我，嗜酸性粒细胞趋化蛋白中和小鼠中CNV的典型例子。j、，中和抗CCR3抗体（Ab）减少了嗜酸性粒细胞（Δdbl GATA）或肥大细胞缺陷小鼠中激光诱导的CNV(配套元件^w-v型). n=6–9*P（P）与IgG相比<0.05。比例尺(c、 我)，100微米；（f），20微米。误差条描述s.e.m。

CCR3驱动的血管生成与炎症脱钩

我们试图确定CCR3靶向性是否仅通过抗血管生成机制降低CNV，或者是否也涉及抗炎机制。嗜酸性粒细胞和肥大细胞（定义为CCR3^你好CD3（CD3）⁻CD117号^整数CD49天⁺和CCR3^整数CD3（CD3）⁻CD117号^你好CD49天⁺流式细胞术监测激光损伤后脉络膜(补充图S5). 此外，嗜酸性粒细胞缺陷型Δ的CNV反应数据库链接GATA小鼠¹¹和肥大细胞缺乏配套元件^W-v型/配套元件^W-v型老鼠²⁷与野生型小鼠没有区别(图3j). 此外，眼内注射中和性抗CCR3抗体可降低Δdbl GATA或配套元件^W-v型/配套元件^W-v型小鼠达到与野生型小鼠相同的程度。因此，尽管有报道称嗜酸性粒细胞和肥大细胞能够在其他系统中驱动血管生成^17,18，这两种细胞类型在实验性CNV的发展中是不可或缺的。虽然中性粒细胞和巨噬细胞浸润对实验性CNV的形成至关重要^23,28，CCR3受体靶向并不影响任何一种炎症细胞类型（定义为Gr-1⁺80层/四层⁻和F4/80⁺CD11c公司⁻单元格）(补充图S5). 因此，该模型中CCR3阻断的血管抑制作用是一种直接的抗血管作用，似乎不涉及细胞炎症的调节。CNV中嗜酸性粒细胞和肥大细胞缺乏的机制尚不明确。一个可能的解释是CXCL9的表达，它阻止了eotaxin诱导的CCR3介导的嗜酸性粒细胞募集^29,30，单位：CNV(补充图S6). 影响这些白细胞粘附或动员的其他机制也可能起作用。

CCR3靶向CNV生物成像

由于CNV侵入视网膜会导致视网膜的形态和功能破坏，因此需要尽早检测CNV；事实上，在视网膜侵犯之前检测CNV是理想的。穿透视网膜的CNV可以通过荧光素血管造影检测出来。然而，这种诊断方法在CNV侵入视网膜之前，即当CNV仍局限于脉络膜时，无法检测到CNV。然而，尸检组织病理学研究表明，荧光素血管造影未显示CNV存在的患者中，有大量患者的CNV尚未侵入视网膜³¹因此，我们探讨了是否使用抗CCR3 Fab抗体片段对CCR3靶向生物成像(补充图S7)结合到量子点（QDot-CCR3-Fab）可以在临床表现出来之前检测到CNV。

我们之前描述了单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL-2）或其CCR2受体缺失的衰老小鼠中CNV的自发发展³²类似的病理学发生在年轻时Ccl2公司^−/−×抄送2^−/−小鼠（未发表的数据）。这些小鼠也会迅速发生视网膜外变性(补充图S8). 我们测试了静脉注射QDot-CCR3 Fab后的眼底血管造影是否可以检测到这些小鼠的视网膜下CNV。QDot-CCR3 Fab血管造影显示，这些小鼠眼底区域的荧光信号在荧光素血管造影上无反应(图4a、b). CCR3靶向性的特异性通过在Ccl2公司^−/−×抄送2^−/−注射QDot-isotype Fab的小鼠和注射QDot-CCR3 Fab的野生型小鼠(图4b;补充图S9). 这些区域的组织学检查显示增殖（Ki67⁺)资本充足率3⁺脉络膜中尚未侵入视网膜的血管，以及QDot-CCR3 Fab在这些血管中的积聚(图4c-e). 这些数据证明了CCR3靶向生物成像能够在亚临床CNV破坏视网膜并导致视力下降之前检测到CNV的原理。

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图4

CCR3靶向量子点检测视网膜下脉络膜新生血管（CNV）。a、，静脉注射野生型和野生型荧光素钠后拍摄的眼底图像Ccl2公司^−/−×抄送2^−/−小鼠的视网膜血管充盈正常，但没有显示CNV的高荧光区域。b中，在同一体内静脉注射QDot-CCR3 Fab后Ccl2公司^−/−×抄送2^−/−中显示的鼠标(一)，1小时时，在荧光素血管造影中未出现荧光的同一区域出现了局灶分支脉络膜高荧光（箭头）一). 这种高荧光的强度（如插图中的红色伪彩色所示）增加，在4小时达到峰值，然后强度下降，但在12小时仍然持续。相应的QDot同种型Fab血管造影术图像显示没有高荧光。c–e，与QDot-CCR3 Fab血管造影中高荧光区域相对应的区域(b条)包含多个CD31⁺脉络膜（Ch）中增殖的血管（Ki67⁺; 箭头所示），且未侵犯视网膜（Ret）。单个红色（CD31⁺,c（c）)和绿色（Ki67⁺,d日)、和已合并(e（电子）)显示了荧光通道图像。箭头指向增殖的内皮细胞。插图显示Ki67⁺CD31型⁺放大倍率更高的细胞。f、，QDot-CCR3 Fab高荧光区定位于CCR3的视网膜下CNV区域⁺内皮细胞。g中，CD31中显示了QDot标签⁺视网膜下CNV病变的血管系统。代表6个独立实验的图像。比例尺(c–e类)，10微米。

CCR3靶向性优于VEGF-A靶向性

在比较CCR3靶向和VEGF-A靶向（已批准的最有效的人类CNV治疗方法）时，我们发现CCR3中和抗体在抑制小鼠激光诱导的CNV方面比VEGF-A中和抗体更有效（68±3%对57±4%）(补充图S10). 在激光损伤模型中，CCR3中和不会改变视网膜色素上皮/脉络膜中的VEGF-A水平，VEGF-A阻断也不会改变CEC上CCR3的表达(补充图S11)：这两条路径似乎没有直接耦合。反复玻璃体内注射抗VEGF-A抗体导致野生型小鼠视网膜的解剖和功能损伤(补充图S12)与早期报道一致，抗VEGF-A治疗会导致小鼠视网膜内外部的功能障碍和损伤^6,7。在抑制小鼠CNV的抗VEGF-a抗体剂量下，这些效果是中等的，但在与人类使用的剂量相当的较高剂量下，效果更为明显。值得注意的是，抗VEGF-A药物治疗与人类深层视网膜损伤风险增加无关³³，但观察到细微异常^34,35一些不良反应可能被错误地归因于疾病进展。与VEGF-A阻断剂相反，CCR3 Ab和CCR3受体拮抗剂均未在野生型小鼠中诱导视网膜毒性，眼底成像和电生理功能证实了这一点(补充图S12).素食主义者缺失在胚胎上是致命的^36,37和有条件消融素食主义者RPE导致严重视网膜变性和视觉功能障碍³⁸相反抄送人3^−/−小鼠视网膜外观和电生理功能正常(补充图S13).

讨论

我们的研究结果表明，CCR3靶向可能是早期检测（使用生物相容性量子点或其他生物成像荧光色素，如近红外染料）和治疗CNV（通过受体或配体靶向）的一种安全可行的策略，可能优于当前的护理标准。CCR3生物成像可能对患有RPE色素障碍和多发性视网膜下脂蛋白沉积（称为红肿）的个体最有用，也可能对患有临床明显CNV的同眼患者最有用，因为众所周知，他们具有发展CNV的高风险^39,40类似的技术可能有助于非侵入性生物成像其他代谢或分子标记物，以提供有关疾病发病机制或活动的信息。

一些策略已经产生了优先在增殖的内皮细胞上表达的分子标记，如肿瘤血管中的内皮细胞^41,42; 然而，这些报告中均未发现CCR3。因此，我们的研究确定CCR3是病理性血管生成的新标记物，也是新生血管性AMD的功能靶点。这些发现还应促进对AMD患者eotaxin-CCR3轴基因多态性的研究，以及对其他血管生成模型中CCR3功能的研究。此外，很容易推测以CCR3为靶点可能对哮喘有双重益处，哮喘涉及不同程度的嗜酸性粒细胞炎症以及血管生成性气道重塑⁴³.

方法总结

方法

补充材料

鸣谢

脚注

工具书类