结果
生长和分支输尿管周围间充质细胞中整合素α8的表达
为了确定小鼠发育过程中整合素α8亚基的表达模式，我们克隆了小鼠α8cDNA，并在兔子体内培养了一种针对包含α8胞质结构域的肽的抗体。针对COS细胞中以可溶性分泌蛋白形式表达的α8亚单位的胞外区，产生了第二种抗体。这两种抗体都经过亲和纯化，显示出相同的α8亚单位表达模式，并且在用不同小鼠组织提取物进行的Western blot中没有与其他整合素发生交叉反应（数据未显示）。与早期在鸡身上的观察结果一致(Bossy等人，1991年)使用不同小鼠组织提取物进行的免疫沉淀分析表明，α8亚单位仅与整合素β1亚单位相关（数据未显示）。在所分析的所有发育阶段，整合素α8亚单位反映了α8β1受体的存在，在发育器官（如肠道、肺、性腺和肾原索）的间充质细胞中高度表达，但在上皮细胞中不表达(和和数据未显示）。
发育中肾脏整合素α8亚单位的免疫组织化学定位野生型胚胎切片用整合素α8亚单位胞外区抗体染色。中的缩写.
（A和B）在E11，α8亚单位在Wolffian导管周围的间充质细胞中表达明显，在导管上皮和周围间充质上皮细胞（箭头）之间的界面处高浓度。α8亚单位也表达于生长中的输尿管芽顶端上方和输尿管芽周围的间充质细胞中（A，宽箭头）。（C–G）在E13.5，α8亚单位在分支输尿管尖端周围的凝聚间质（C和E）和管前聚集物（F）中表达，但不在逗号形小体（G）或S形小体中表达。α8亚单位在与输尿管上皮交界的间充质细胞中高水平表达，如穿过输尿管的横切面（D，箭头）和纵切面（E，箭头）所示。
（H） 在E16.5，α8亚单位的表达见于浓缩间充质细胞的肾脏外层，但在分化结构（如肾小球（gl））的内部表达不多。
比例尺，100μm（C和H）和10μm（A、B和D–G）。
α8位点的靶向（A） α8蛋白示意图和基因组α8克隆的限制性图谱。指出了靶向结构的配置、靶向等位基因、用于筛选的探针和预期的Southern印迹片段。E、 EcoRI；H、 HindIII；D、 DpnI；B、 巴米。对于DpnI，只显示了许多限制位点中的一个。
（B） 用EcoRI消化杂合小鼠杂交后代的小鼠尾部DNA，并用探针2进行Southern印迹分析。8.0kb的条带反映了野生型α8等位基因，5.8kb条带反映靶向α8轨迹。在两种基因型中均检测到2.4kb的条带。
（C） 从新生野生型或纯合突变小鼠的肺组织中制备提取物。用α8胞外区特异性抗血清免疫沉淀α8蛋白，然后用第二种胞外区抗血清免疫印迹。蛋白质通过化学发光显示。指出了α8蛋白和免疫球蛋白G重链的位置。
（D） 用整合素α8的细胞质（cyt）或胞外（ex）结构域抗体对野生型和纯合突变P0动物的肺切片进行染色。比例尺，50μm。
对发育中肾脏整合素α8亚基的时空表达模式进行了详细研究。总结了后肾发育的不同阶段，以及显示了整合素α8亚单位的相应表达模式。在E11，整合素α8亚单位在肾原性索的整个间质中表达。在Wolffian导管周围的间充质细胞中观察到非常高的表达(). 在输尿管芽形成之前，分离泌尿生殖嵴和后肾间质的间质内以及后肾间充质内均未发现α8表达。当输尿管芽从Wolffian管分支时，在生长的输尿管上皮周围的细胞中，当其向后肾间质延伸时，整合素α8亚单位的表达被诱导(). 在E13.5，α8亚单位在输尿管分支尖端周围的间充质浓缩物中的后肾间质中表达()以及管前骨料()但不是在逗号形状的身体上()或S形车身(). 因此，α8亚单位的表达首先在与输尿管接触的间充质细胞中诱导，但随后在这些细胞的上皮化后下调。这在E16.5动物的切片中尤为明显()其中，α8在肾脏外边缘区的浓缩间充质细胞中表达，但在含有更多分化结构的更多内部部分中不表达。
与分化为上皮的间充质细胞中α8亚单位的瞬时表达相反，在与输尿管上皮交界的间充质细胞中，α8的表达仍然很高(). α8亚单位在面向输尿管上皮的间充质细胞表面上的强极化和连续表达表明，α8β1异二聚体可能由输尿管上皮上表达的配体定位。
整合素α8缺乏小鼠在出生时出现肾发育不全或发育不良
为了确定整合素α8β1受体的基本功能，我们在小鼠中通过基因靶向使编码α8亚基的基因失活(). 携带一个突变α的杂合动物8该位点无明显异常表型。纯合子突变动物出生时的发育频率约为预期的孟德尔频率（163只动物中的33只），但大多数纯合子突变体在出生后的第一天或第二天死亡。Western blot分析和免疫组织化学证实我们产生了一个空等位基因，因为两种技术都无法在纯合突变体中检测到α8蛋白().
对出生时纯合突变动物的分析显示严重的肾脏异常(和). 与野生动物相比()，54%的突变动物出生时没有输尿管或肾脏(). 在40%的动物中，输尿管单侧形成并侵入后肾间质(). 一旦输尿管侵入间质，要么没有分支，也没有明显的肾单位（14%的突变），要么出现更大的分支，排泄肾单位明显（26%的突变；). 事实上，后者的结构形状相似，但通常比野生型肾脏小（数据未显示）。在少数突变动物（6%）中，形成了两条输尿管，侵入后肾间质，并有不同程度的分支。在初步分析中，我们没有观察到肾脏以外的其他器官出现重大异常。
P0时α8-缺乏小鼠的肾脏表型从野生型（A）或α8-缺乏型（B–D）小鼠上解剖泌尿生殖道。
（A） 在野生型小鼠中，肾上腺（ad）、肾脏（k）、输尿管（u）、膀胱（b）和睾丸（t）发育良好。
（B） 受影响最严重的突变株没有输尿管和肾脏，但膀胱和肾上腺未受影响。请注意，本次解剖未切除背主动脉（da）和子宫角（uh）。
（C） 一个小肾脏和一个突变动物的胚胎（盒装）。
（D） 雏形的高倍视图（C框中）。星号表示肾上腺和输尿管之间未分化的间质。比例尺，100μm。
表1
| 基因型 | +/+ | +/− | −/− |
|---|
| 0肾脏 | 0 | 0 | 31 |
| 1入门 | 0 | 0 | 8 |
| 1肾脏 | 0 | 0 | 15一 |
| 肾脏+雏形 | 0 | 0 | 2一 |
| 2肾脏 | 30 | 105 | 1一 |
一些纯合子突变动物出生后存活了数周或数月。所有存活的动物都有一个肾脏，这表明突变动物的死亡原因是肾发育不全或发育不全。单肾动物的存在表明，随机因素有助于表型的变异。为了测试潜在的遗传贡献，我们杂交了存活数月的纯合子突变体。97个杂交后代中有65个（67%）存活下来，有一个或两个小肾脏。由于原始杂合子创始者是129和C57Bl/6小鼠的遗传混合物，数据表明，存在于一个或两个遗传背景中的遗传修饰位点（或多个位点）调节α8依赖表型的外显率（见讨论）。
整合素α8β1是输尿管生长和分支以及上皮特化发育所必需的
如上所述，我们发现，在生长和分支的输尿管芽周围的间充质细胞和后肾间充质中浓缩的间质细胞中，整合素α8亚单位的表达受到诱导。表达模式提示整合素α8β1可能是输尿管形成、生长和分支所必需的；从间充质细胞形成上皮结构；或两者兼而有之。为了区分这些可能性，我们用标准组织学技术分析了α8缺陷胚胎肾脏的进行性发育(和). 我们重点关注E11.5，即当输尿管芽侵入后肾间质时，以及E13.5和E16.5，即当野生型动物的输尿管在间质内分支且可见上皮分化迹象时。
E11.5和E13.5α8-缺乏小鼠的肾脏表型切片用苏木精和伊红染色。
（A和B）E11.5野生型和突变型肾脏区域的切片。箭头划分了后肾间质。在野生型动物（A）中，输尿管芽（ubt）侵犯了后肾间质。在α8缺乏小鼠（B）中，输尿管芽已经发育，但尚未侵入后肾间质。
（C） E13.5处野生型后肾剖面。
（D–F）显示α8缺乏动物E13.5后肾发育程度的切片。在一些动物中，输尿管在间质内有分支（D）；在某些情况下，它侵入了间质（宽箭头），但没有分支（E）；而在其他情况下，它还没有到达处于退化过程中的间质（宽箭头）（F）。
k、 肾脏；ad，肾上腺。比例尺，100μm。
表2
| 发育年龄 | 图11.5 | 图13.5 | P0（P0） |
|---|
| 野生型 | n=10 | n=10 | n=60 |
| 输尿管，分支 | 100% | 100% | 100% |
| α8突变体 | n=8 | n=28 | n=114 |
| 没有输尿管 | 0% | 29% | 75% |
| 输尿管，不在间质中 | 100% | 25% | 0% |
| 输尿管，间质内 | 0% | 29% | 9% |
| 输尿管，分支 | 0% | 18% | 17% |
在所有野生型和杂合子动物中，输尿管芽在E11.5侵犯了后肾间质(). 相反，在所有α8缺乏小鼠中，输尿管芽已经形成，但尚未侵入后肾间质(). 在中肾或Wolffian管的发育过程中未观察到任何缺陷（数据未显示）。野生型动物E13.5时，输尿管分叉，间充质细胞上皮化正在进行(); 在纯合子突变动物中，肾脏发育受到不同程度的影响(和). 在54%发育中的肾系统中，后肾间质退化，没有或只有短输尿管可见(). 在其余的病例中，输尿管侵犯了后肾间质，但只有18%的病例出现了分支和上皮特化的形成(). 分枝和上皮化程度低于野生型或杂合同卵双胞胎（比较).
我们的结论是，在缺乏整合素α8β1的情况下，输尿管芽可以正常形成，但输尿管芽向后肾间质的生长以及后肾间充质内输尿管上皮的生长和分支是有缺陷的。此外，间充质细胞向上皮结构的募集受到损害。
p75和Pax-2在突变动物中的诱导表达
突变动物的后肾间质向上皮结构的转化受到损害。一种解释可能是，当输尿管失去对感应信号的反应能力或信号不再存在时，输尿管生长延迟导致间质延迟侵入。另外，整合素α8β1可能在间充质细胞接受诱导刺激后，直接调节其从输尿管上皮细胞的迁移。最后，α8β1可能在上皮化过程中起作用。为了区分这些可能性，我们分析了突变间质中早期诱导事件标记的表达(). 我们重点关注转录因子Pax-2和低亲和力神经营养素受体p75NTR公司它们都是在凝聚的间质中诱导的。Pax-2也在输尿管上皮和p75中表达NTR公司鉴别肾小泡(;Dressler等人，1990年;Sariola等人，1991年).
p75的分析NTR公司和Pax-2在E13.5和E15.5的表达（A和B）E13.5野生型（A）和突变型（B）动物的切片用p75抗体染色NTR公司受体。野生型和突变型动物在输尿管分支周围的浓缩间充质细胞（cm）中有明显表达。在野生型动物中，p75NTR公司在肾小泡中也观察到表达（A，宽箭头）。用Pax-2抗体对E15.5野生型（C）和突变型（D）动物的（C和D）切片进行染色，Pax-2在输尿管上皮和冷凝间质中诱导表达。只显示了野生型肾脏切片的一小部分，而可以看到α8缺乏动物的整个雏形。注意，在突变动物中，输尿管形成了很少的分支，但诱导了Pax-2的表达。比例尺，50μm。
在E13.5和E15.5之间的14个突变间质中进行了诱导评估。5例输尿管芽侵犯间质。在被输尿管侵犯的所有5个间质中都诱导了标志物的表达，并且在不与输尿管直接接触的细胞中也很明显(). 我们的结论是，突变的后肾间充质能够响应输尿管诱导信号，并且间充质细胞在诱导后正在迁移。间充质浓缩物的形成也很明显，但肾原基似乎没有野生型肾组织结构良好，几乎看不到逗号形和S形小体（相比之下). 而在E13.5，输尿管侵犯了47%的突变间质并诱导了Pax-2和p75NTR公司在所有被输尿管侵犯的间质中都很明显，只有17%的动物出生时出现后肾间质细胞上皮化的迹象(和). 因此，我们得出结论，在α8缺乏的动物中，间充质细胞的上皮化是有缺陷的。
发育中的肾脏含有整合素α8β1的新配体
整合素α8β1是FN、VN和TN-C的受体，但这些配体均未以正确的模式表达，无法解释α8缺陷小鼠的肾脏表型（见讨论）。为了表征潜在α8β1配体的分布，我们用碱性磷酸酶（α8β1-AP）标记的截短重组整合素α8β1-异二聚体对整个肾脏和肾脏切片进行染色。已经用受体酪氨酸激酶产生了类似的嵌合体，以识别其配体(Cheng和Flanagan，1994年). 为了获得这种异二聚体，将整合素β1亚单位的胞外结构域融合到碱性磷酸酶标签上，以取代跨膜和细胞质结构域。为了便于纯化，α8亚单位的胞外结构域用C末端多组氨酸myc标记表达。将含有这些嵌合体的表达载体共转染到COS细胞中，并从上清液中纯化分泌的α8β1-AP异二聚体。在酶联免疫吸附分析中，α8β1-AP异二聚体特异性结合到FN、VN和TN-C，这三种已知的整合素α8β1配体（S.D.等人，未发表的数据）。
用整合素α8亚单位抗体或α8β1-AP对整个肾脏进行染色。正如预测的那样，肾脏外侧输尿管分支周围的α8抗体染色的浓缩间充质细胞(). 可溶性重组α8β1-AP异二聚体显示互补模式()染色分支输尿管的尖端。在长时间染色反应中，在大多数肾间充质细胞上观察到额外的弥散染色（数据未显示）。扩散染色很可能是由于α8β1-AP与其配体FN和TN-C的相互作用。这些配体的不太明显的染色可能反映了它们的扩散分布，可能表明低表达水平，或者可能是染色过程中严格固定和洗涤条件的结果，这可能会破坏一些但不是所有的受体-配体相互作用。在肾切片中，整合素α8β1与一种新配体的结肠化也很明显，其中α8β1-AP染色于分支输尿管上皮的表面()与使用整合素α8亚单位抗体相比，以重叠但更局限的模式(). α8β1-AP染色具有特异性，因为它被β1链抗体阻断，而不是被对照抗体阻断（数据未显示）。与我们之前的观察一致，整合素α8β1以阳离子依赖性的方式与其配体内的RGD基序结合(缪勒等人，1995年)，染色也依赖于二价阳离子，完全被RGD阻断，但不被RGE肽阻断().
新型整合素α8β1配体在肾脏中的表达（A和B）用整合素α8（A）胞外结构域或α8β1-AP（B）特异性抗体对整个肾脏进行染色。用对照AP融合蛋白（C）、α8抗体（E和G）或α8β1-AP（D、F、H、I和K）对E13.5肾脏的（C–I和K）切片进行染色。在RGD（I）或RGE（K）肽存在的情况下进行染色。箭头表示α8β1与其新配体之间存在明显共定位的区域。（D）中的星号表示逗号形状的主体。（五十） 提取自胚胎和成人肾脏。蛋白质在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素中，并用α8β1-AP或FN抗体进行探测。箭头表示以RGD依赖性方式与α8β1-AP相互作用的新蛋白质。
比例尺，50μm（A和B）和10μm（C–K）。
为了进一步证明新的α8β1配体，我们使用α8β1-AP作为探针，通过Far-Western blot分析了胚胎和成人肾脏的提取物(). 在胚胎肾脏的提取物中检测到分子量约为220、150、110和60-90 kDa的蛋白质。成人肾脏中也存在极少量的60-90kDa物种。RGD可消除α8β1-AP与这些蛋白质的相互作用，但RGE肽不能消除这种相互作用（数据未显示）。Western blot分析表明220kDa物种最有可能是FN(). 然而，150和110 kDa蛋白质以及至少一些60–90 kDa蛋白与FN、VN或TN-C不相容(和数据未显示）。我们得出结论，胚胎肾脏含有整合素α8β1的新配体。由于其中一些蛋白在胚胎而非成人肾脏中表达，因此它们是肾脏发育过程中整合素α8β1功能的重要候选介质。
讨论
整合素α8β1对肾脏形态发生过程中上皮-间质相互作用至关重要
我们在此证明，整合素α8β1在肾脏形态发生过程中的上皮-间充质相互作用中起着关键作用。与生长和分支的输尿管上皮相邻的间充质细胞中诱导整合素α8β1的表达。小鼠α8β1受体失活导致输尿管芽向后肾间充质延伸时生长不足，并导致后肾间质内输尿管上皮分支减少。此外，后肾间质上皮化受损。通过使用α8β1-AP嵌合体，我们提供了在上皮细胞和间充质细胞之间的边界与α8β1共存的新配体的证据。该配体是间质表达整合素α8β1对输尿管发育和肾脏形态发生影响的一个强有力的候选介体。
缺乏整合素α8β1的动物天生具有不同的肾脏表型：一些动物缺乏肾脏和输尿管；有些输尿管附着在肾原基上；其他的则有一条或两条输尿管与功能正常的小肾脏相连。后者可以活到成年。对发育过程中表型建立的分析为这种变异性提供了解释。在E11.5，当输尿管芽形成并开始侵入野生型胚胎中的后肾间质时，输尿管芽和后肾间充质都存在，但突变体中尚未开始侵入。在一些突变体中，入侵从未成功启动，导致肾脏发育不全和输尿管芽退化；在其他情况下，侵入开始于晚期，但输尿管的分支形态发生和后肾间质的上皮化严重受损。因此，在许多突变体中，出生时只有肾原基，由附着在输尿管上的未分化间充质组成；在其他情况下，形态发生速度减慢会产生小肾脏。
表型表现的可变性可能部分是所分析动物遗传背景差异的结果。单个α8缺陷小鼠包含129和C57Bl/6近交系小鼠的不同染色体贡献。输尿管生长的一些参数，如上皮细胞的复制率，可能因遗传背景不同而不同。为了支持遗传贡献，纯合子突变幸存者杂交后代中67%的后代发育出一个或两个肾脏（相比之下，杂合子动物杂交后代中18%）。未来，有必要将α8等位基因杂交到不同的遗传背景中，以绘制潜在的修饰基因座。
整合素α8β1参与诱导相互作用
在介导肾脏形态发生的相互作用的最简单模型中，后肾的形成涉及两个信号，一个来自后肾间充质，诱导输尿管的生长和分支，另一个来自输尿管，诱导间充质的上皮化。整合素通过配体结合激活细胞信号转导机制，并调节肌动蛋白细胞骨架的组织和动力学（综述于克拉克和布鲁格，1995年;Schwartz等人，1995年). 因此，整合素α8β1很可能在协调上皮细胞和间充质细胞发育的信号系统中发挥直接作用。在以下各节中，我们根据α8β1缺陷动物中可能被破坏的信号系统，讨论了整合素α8βl在上皮-间充质相互作用中的作用。
后肾间充质酶衍生感应信号的干扰
在α8β1缺陷小鼠中观察到的最早异常是输尿管芽生长减慢，这表明后肾间质信号转导缺陷。最近对携带靶向突变的小鼠进行的器官培养和分析实验表明，GDNF是输尿管生长和分支所需的间质衍生分泌信号之一。输尿管上皮细胞c-ret受体酪氨酸激酶的激活介导这些细胞对GDNF的反应(Moore等人，1996年;Pichel等人，1996年;Sanchez等人，1996年;Schuchardt等人，1996年;Vega等人，1996年). 这显然不是唯一诱导输尿管芽生长的信号系统，因为缺乏c-ret的小鼠亚群仍能形成输尿管(Schuchardt等人，1996年). 令人惊讶的是，在α8-和c-ret缺陷小鼠中，类似的表型变异很明显，从缺肾到小肾不等。目前尚不清楚α8β1缺陷小鼠的输尿管芽生长缺陷是否反映了GDNF/c-ret信号级联的中断、对该级联的输尿管芽反应性的抑制，或导致c-ret突变体残余肾形态发生的另一个信号级联的破坏。
未预料到间充质细胞表达的整合素α8β1受体参与了从间充质到输尿管芽的信号传递。最近在肾器官培养中获得的结果可能提供了一种解释。针对c-ret的反义寡核苷酸不仅降低输尿管中c-ret表达水平，而且破坏分支形态发生；它们还导致大量ECM分子的表达急剧减少，如层粘连蛋白、IV型胶原和珍珠糖(Liu等人，1996年). 作为一种可能的情况，在c-ret缺乏的动物中，α8β1配体的表达可能缺失；在α8突变体中，配体可能无法正确组装成基底膜。由于ECM已被证明通过固定化或呈递这些因子或通过激活协同共信号通路来提高生长因子信号通路的效率（综述于克拉克和布鲁格，1995年;Schwartz等人，1995年)α8β1突变动物的ECM紊乱可能会干扰诱导信号的传递，干扰输尿管芽上皮细胞的增殖或迁移反应。
尿路感应信号的中断
α8突变体中后肾间质上皮化受损表明，α8β1也可能调节从输尿管芽到后肾间充质的信号传递。虽然对涉及的信号分子知之甚少，但很明显，诱导需要输尿管上皮和后肾间质之间的紧密联系（综述于萨克森，1987年). 随后，接收到诱导信号的细胞从输尿管上皮迁移，导致信号在数个细胞直径上传播(萨克森，1987年). 诱导信号的潜在候选基因包括wnt和TGF-β超家族的成员（参见帕尔和麦克马洪，1994年;Roelink，1996年). wnt-11和BMP7都在发育中的肾脏中表达，wnt-11集中在输尿管芽的顶端(Lyons等人，1995年;Kispert等人，1996年). BMP7和wnt-4靶向突变的小鼠显示肾脏发育缺陷(Stark等人，1994年;Dudley等人，1995年;Luo等人，1995年). 整合素α8β1不太可能介导初始诱导事件，因为这种整合素在间质内的表达是对输尿管源性诱导物的早期反应。事实上，我们有强有力的证据表明一些初始信号被传输，因为Pax-2和p75NTR公司在突变的间充质细胞中诱导。整合素α8β1对随后间充质细胞的迁移也不是必需的，因为Pax-2和p75的表达NTR公司在距离输尿管几倍直径的间充质细胞中观察到。
然而，在整合素α8β1缺陷小鼠中，诱导后的形态发生事件是有缺陷的。最引人注目的是，在一些突变动物中，出生时或出生数月后，可以看到未分化间充质上附着着未分支的输尿管。整合素在ECM组装中起着核心作用，这些基质对于产生上皮细胞和内皮细胞的极性至关重要（参见Ekblom，1996年). 器官培养实验表明，肾间质极化上皮的形成依赖于适当的基底膜组装，这一过程依赖于新生成的上皮细胞中表达的整合素α6β1（综述于Ekblom，1996年). 可以想象，整合素α8β1在基质组装的早期步骤中发挥作用，它可能通过帮助组织定位短程信号分子（如wnts和BMP）的基质，对上皮形成产生影响。
输尿管激活间质中α8的表达可能是在转录水平上引起的。与输尿管接触后，后肾间质中也会诱导转录因子Pax-2(Dressler等人，1990年)，Pax-2是肾脏发育所必需的(Torres等人，1995年). 这增加了Pax-2可能调节α8表达的可能性。未来对导致间充质细胞内α8诱导的机制的分析应有助于识别诱导信号及其作用模式。
整合素在上皮-间质相互作用中的一般作用
这里的数据有力地支持了整合素α8β1在上皮-间充质相互作用中发挥关键作用的可能性。众所周知，上皮小管的生长和形成器官中上皮细胞片的分支形态发生依赖于上皮-间充质的相互作用。在胚胎发生过程中，整合素α8β1在许多导管形成器官的间质中表达。然而，除肾脏外，α8β1缺陷小鼠在其他组织中未观察到重大缺陷。可以想象，其他组织中的α8β1功能被整合素家族的其他成员所掩盖，这些成员也可能调节上皮-间充质相互作用。事实上，在器官培养中，含α6整合素调节颌下腺的分支形态发生(Kadoya等人，1995年). 携带整合素α3基因靶向突变的小鼠改变了肾小球毛细血管环和支气管的分支(Kreidberg等人，1996年). 在秀丽隐杆线虫（Caenor-habditis elegan）中，整合素β链基因的突变导致远端尖端细胞和卵巢片细胞的上皮化明显缺陷(Gettner，1994年). 未来对携带多个整合素α基因靶向突变的小鼠进行分析，对于直接研究上皮-间充质相互作用中潜在的多余整合素功能至关重要。
实验程序
DNA构建
分离出一个编码小鼠α8蛋白的cDNA（S.D.等人，未发表的数据）并测序。一个α8用小鼠α8 cDNA探针筛选129SVJ基因组文库（Stratagene），获得基因组克隆。通过DNA测序鉴定含有α8外显子的DNA片段。编码氨基酸362–424的外显子被PGK-neo公司可选择标记(). 分离出一个从SacI位点延伸到DpnI位点的基因组α8 DNA片段，并将其从Sac1位点缩短200 bp，Bal31，Klenow片段被钝化，并在年融合到Klenow-blunted HindIII位点PGK-neo公司生成PGK-neo公司-1.2. 将α8外显子的3.1kb HindIII基因组DNA片段3′插入PGK-tk公司和一个XhoI片段，包含HindIII片段和PGK-tk公司表达盒被克隆到XhoI位点PGK-neo公司-1.2. 对于Southern blots，探针1是通过将200 bp基因组5′亚克隆到靶向载体获得的，探针2是通过在3′末端亚克隆基因组BamHI片段获得的().
β1-AP和α8-HIS-myc的克隆、COS-cell表达和蛋白质纯化将在其他地方介绍（S.D.等人，未发表的数据）。
α8-缺乏小鼠的产生
JM1胚胎干细胞（J.J.M.和R.A.P.，未发表数据）在有丝分裂失活的STO细胞上生长，并用25μg线性化靶向载体电穿孔。在选择性培养基（300μg/ml G418和0.2μM FIAU）中培养8–10天后，采集菌落，进行扩增，并通过聚合酶链反应和Southern印迹分析进行筛选，用于注射C57Bl/6囊胚(乔伊纳，1993). 为了获得生殖系传播，将嵌合体雄性小鼠与C57Bl/6雌性小鼠交配。
组织学方法
组织学方法如前所述(Jones等人，1994年). 主要抗体的使用如下：分别以10和25μg/ml的浓度对α8胞外或胞浆结构域的亲和纯化抗体；至p75NTR公司10微克/毫升(Weskamp和Reichardt，1991年); 并以15μg/ml（g.Dressler的礼物）的浓度加入Pax-2。
用α8β1-AP进行整体染色，肾脏用4%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中；用1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%Triton X-100封闭PBS；用缓冲液J（0.1%BSA，100 mM NaCl，1 mM MnCl）清洗2，0.1%Triton X-100，25 mM Tris-HCl（pH 7.5]）；并在缓冲液J中与3μg/mlα8β1-AP孵育。如有指示，包括GRGDSP或GRGESP肽（50–100μg/ml）。用缓冲液J清洗样品三次，用100 mM NaCl、1 mM MnCl清洗一次20.1%Triton X-100，25 mM Tris-HCl（pH 7.5）；用60%丙酮、3%甲醛在20 mM HEPES（pH 7.0）中固定；用150 mM NaCl、20 mM HEPES（pH 7.0）清洗；在65°C下加热1小时；用AP缓冲液（100mM NaCl，5mM MgCl）冲洗2，100 mM Tris-HCl（pH 9.5）；并用底物溶液（0.17 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，0.33 mg/ml硝基蓝四氮唑在AP缓冲液中）展开。对于抗体染色，用1%BSA、0.1%Triton X-100和1%H封闭固定样品2O（运行）2PBS中；用缓冲液D（1%BSA，0.1%Trition X-100，0.02%叠氮化钠在PBS中）洗涤；用10μg/mlα8抗体孵育；用缓冲液D清洗；并通过ABC方法（矢量）进行检测。含有α8β1-AP的切片染色将在其他地方描述（S.D.等人，未发表的数据）。
最西部斑点
肾脏在PBS中的均质器中均质，并在150 mM NaCl、1%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸、0.1%SDS、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中溶解。蛋白质在6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。将蛋白质转移到硝化纤维后，用PBS中3%的BSA将过滤器堵塞1小时，并按照上述组织切片方法进行开发。
