鲜血。2009年6月18日；113(25): 6411–6418.
髓样瘤
MicroRNA-29b直接靶向诱导急性髓系白血病DNA低甲基化和抑癌基因再表达DNMT3A型和3B公司和间接DNMT1（DNMT1）
,1,2,* ,1,2,* ,2,三 ,4 ,1,2 ,2,三 ,1,2 ,1,2 ,1,2 ,1,2 ,2,三 ,2,三 ,1,2 ,5 ,2,三 ,6 ,1,2 ,1,2 ,4 ,三，7 ,2,三和
1,2 穆勒·法布里
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
凯瑟琳·E.A.赫阿菲（Catherine E.A.Heaphy）
1医学部，
2综合癌症中心，
伊丽莎·卡莱加里
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
维奥利安·阿维兰热
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
斯特凡诺·沃利尼亚
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
丹尼尔·佩罗蒂
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
迈克尔·安德列夫
6德克萨斯大学安德森癌症中心血液和骨髓移植系分子血液学和治疗科，休斯顿；和
赖楚武
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
7哥伦布俄亥俄州立大学分子与细胞生物化学系
卡洛·克罗斯
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
1医学部，
2综合癌症中心，
三分子病毒学、免疫学和医学遗传学，
4药学学院
5哥伦布俄亥俄州立大学兽医生物科学系；
6德克萨斯大学安德森癌症中心血液和骨髓移植系分子血液学和治疗科，休斯顿；和
7哥伦布俄亥俄州立大学分子与细胞生物化学系
通讯作者。 *R。G.和S.L.对这项研究的贡献相等。
收到日期：2008年7月22日；2009年2月8日接受。
- 补充资料
[补充数字]
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摘要
异常的DNA超甲基化通过沉默与造血相关的结构正常基因而促进髓系白血病的发生。MicroRNAs（miRNAs）是非编码RNA，通过靶向蛋白编码mRNAs来调节基因表达。最近，miRNAs已被证明在恶性细胞的基因超甲基化和沉默中作为靶点和效应器发挥作用。在当前的研究中，我们发现miR-29b型在急性髓系白血病细胞中，DNA甲基转移酶的表达显著降低DNMT1、DNMT3A、和DNMT3B公司RNA和蛋白质水平。这反过来导致了全球DNA甲基化和第15页墨水4b和ESR1系列通过启动子DNA低甲基化。尽管下调了DNMT3A型和DNMT3B公司是miR-29b型对于这些基因的3′非翻译区，没有预测miR-29b型在DNMT1（DNMT1）3′非翻译区。进一步的实验表明miR-29b基因下调DNMT1（DNMT1）通过目标定位间接转速1，交易发起人DNMT1（DNMT1）基因。总之，这些数据提供了急性髓细胞白血病中miRNAs和异常DNA超甲基化之间的新的功能联系，并提示人工合成的miR-29b型寡核苷酸作为有效的低甲基化化合物。
介绍
DNA甲基化包括在序列5′-胞嘧啶-鸟苷（CpG）的背景下胞嘧啶的碳5位置酶促加甲基，并由DNA甲基转移酶（DNMTs）介导。1大约50%的人类基因的启动子区域包含胞嘧啶和鸟嘌呤含量高于预期的DNA区域（所谓的CpG岛），一旦甲基化，就会介导基因转录沉默。2DNMT亚型在基因组甲基化中有不同的作用。鉴于DNMT1（DNMT1）优先复制已经存在的甲基化模式，DNMT3A型和3B公司负责建立从头甲基化。2在血液系统恶性肿瘤中，包括急性髓细胞白血病（AML）亚群中，有报道称异常DNA超甲基化导致结构正常的抑癌基因沉默。三,4虽然导致异常DNA超甲基化的机制尚待完全阐明，但DNMT1（DNMT1）和DNMT3A型和3B公司与正常骨髓（BM）单核细胞（MNC）相比，在恶性髓系母细胞中观察到，这表明挪威船级社过度表达导致基因启动子甲基化，进而导致白血病的发生。4
越来越多的证据支持microRNAs（miRNAs）在DNA超甲基化异常机制中作为靶点和效应器的作用。5,6miRNAs是长度为19至25个核苷酸的非编码RNA，通过在部分或完全互补位点上的碱基配对诱导翻译抑制或切割其靶mRNAs来调节基因表达。7一些研究小组已经表明，miRNAs在人类恶性肿瘤中发生改变，并且可以通过调控靶基因的表达，发挥抑癌基因或致癌基因的作用。7与肿瘤抑制基因类似，具有肿瘤抑制活性的miRNAs通常位于缺失的基因组区域，或因恶性细胞中的突变或启动子高甲基化而沉默。5,8–10Saito等人最近证明miR-127型在人类膀胱癌中，启动子DNA高甲基化和下调沉默，并通过低甲基化药物治疗重新表达；这与癌基因的下调一致BCL6号机组，这是一个真正的目标miR-127型.5
我们小组最近报告称，miRNAs还通过靶向DNA甲基化机制参与控制DNA甲基化。6我们发现，在肺癌中miR-29家庭直接目标DNMT3A型和3B公司,6从而导致这些基因的下调，全球DNA甲基化（GDM）的降低，以及DNA高甲基化和沉默的肿瘤抑制基因的重新表达FHIT公司和WWOX公司然而，是否下调DNMT3A型和3B公司通过强制表达miR-29足以诱导恶性细胞中有效的DNA低甲基化，或者说，需要其他机制来达到这种效果，尚待充分阐明。
通过测试miR-29b基因在髓系白血病发生中，在当前的研究中，我们证明了miR-29b型促进DNA低甲基化不仅通过直接靶向DNMT3A型和3B公司也可以通过减少DNMT1（DNMT1）通过下调转速1，一个已知的交易激活因子DNMT1（DNMT1）基因。因此，这些结果支持了先前未报道的miRNAs在AML异常DNA甲基化中的作用，并为合成RNA的应用提供了药理学基础miR-29b型作为治疗白血病细胞DNA低甲基化的有效方法。
方法
患者和细胞系
这些AML细胞系Kasumi-1、MV4-11和K562来自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。我们选择了低（MV4-11）或缺失的细胞系miR-29b型（K562和Kasumi-1）。来自俄亥俄州立大学（OSU）白血病组织库的骨髓样本中的跨国公司，有3名未经治疗的AML患者70%以上的母细胞。这些原发性AML样本的形态学（法美白分类）和细胞遗传学/分子特征如下：患者1:FAB M2，核型正常，FLT3内部串联重复阴性；患者2：FAB M2，复杂核型（>5个畸变，包括−7）；患者3：FAB M2，核型正常。患者根据《赫尔辛基宣言》签署知情同意书，根据OSU机构审查委员会批准的方案，按照OSU机构指南储存和使用其组织进行发现研究。
细胞培养和转染
将Kasumi-1、MV4-11和K562细胞系生长在37°C下添加10%胎牛血清或15%胎牛血清（Kasumi-1）的RPMI培养基中。通过Ficoll-Hypaque（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）梯度离心制备BM AML样本中的MNC，并用无血清扩张培养基（StemCell Technologies，BC，Vancouver）培养，补充颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（50 ng/mL）、白细胞介素-3（20 ng/mL，和干细胞因子（100 g/mL）。合成预处理-miR-29b型根据制造商的说明，将最终浓度为50 nM的寡核苷酸或扰乱寡核苷酸作为阴性对照物（Ambion，Austin，TX），通过核穿孔（Amaxa Biosystems，Gaithersburg，MD）引入初级成核细胞或细胞系。在24、48、72或96小时收集转染细胞系。转染24小时后采集原始细胞。将细胞置于细胞裂解缓冲液中进行蛋白质分析，或置于Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）中进行RNA研究。MV4-11细胞用2.5μM Dectabine（Sigma-Aldrich）或磷酸盐缓冲生理盐水（Sigma Aldric）处理72小时。
miR-29b型慢病毒感染
这个miR-29b型慢病毒是一种基于猫免疫缺陷病毒的构建物，购自Systems Biosciences（加州山景城）。该结构包括miR-29b-1和200个碱基对的上游和下游侧翼基因组序列克隆到pMIF cGFP-Zeo-miR质粒（目录号MIFCZ301A-1）中。包装miR-29b型根据制造商的说明（Systems Biosciences），使用pPACKH1包装质粒混合物（目录号LV500A-1）在假病毒颗粒中进行构建。慢病毒快速滴度聚合酶链反应（PCR）试剂盒（目录号LV950A-1）用于测量拷贝数并确定感染的多重性以进行实验。Kasumi-1细胞（106)感染了miR-29b型荧光显微镜检测效率约为40%的慢病毒。空慢病毒被用作实验的对照。
细胞分化试验
Kasumi-1细胞用空载体或miR-29b型慢病毒，48小时后流式细胞术分选（使用GFP表达，分选效率90%），然后在感染后3天和6天用流式细胞仪评估CD11b表达。约5×105kasumi-1细胞清洗两次，并在黑暗中用抗CD11b抗体在4°下培养1小时（BD Biosciences PharMinen，San Diego，CA）。还使用了适当的同型对照。
定量实时PCR
如前所述，使用单管TaqMan miRNA分析（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）检测和量化成熟miRNA。11要检测Sp1、DNMT1和DNMT3A和3B类,第15页墨水4b、和ESR1系列mRNA水平，我们使用TaqMan基因表达分析。原始值使用let-7i（用于miR-29b型)和18秒（用于甲基转移酶,Sp1第15页墨水4b、和ESR1系列基因）作为内部控制。Let-7i公司之所以被选中，是因为该基因在我们小组之前的一项研究中测试的200多名AML患者中缺乏表达变异性。12实时PCR反应一式三份，包括无模板对照。使用比较C计算相对表达t吨方法。13
Northern印迹
如前所述进行Northern印迹。8简单地说，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。RNA样品（20μg）在12%聚丙烯酰胺变性（尿素）预制凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA）上运行，然后转移到Hybond上-n个_薄膜（GE Healthcare，Little Chalfont，英国）。用α-32P进行杂交miR-29b型在42°下过夜标记探针。这个miR-29b型探针序列是成熟的互补序列miR-29b型作为负荷对照，我们使用5S rRNA染色溴化乙锭和U6杂交后剥离过滤器，如前所述。8
蛋白质印迹
如前所述进行Western blot。14抗Sp1、-DNMT1、-DNMT3A和-DNMT3B抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。通过检测β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology）确认了等效的凝胶载量。
转速1沉默
一个2人的泳池转速1小干扰RNA（siRNAs）是商业化获得的（圣克鲁斯生物技术）。约100 nM转速1如细胞培养和转染方法中所述，通过核穿孔将siRNA或对照寡核苷酸siRNA转染到K562细胞中。
荧光素酶分析
的3′非翻译区（UTR）Sp1、DNMT1、和DNMT3A型和3B公司通过PCR从基因组DNA中扩增基因，并使用荧光素酶终止密码子下游的XBA1位点插入pGL3控制载体（Promega，Madison，WI）。使用的底漆组为：转速1FW 5′-CCTTCAGGATTTCACTG-3′和转速1RV 5′-GTCAAAAAGGCATCAGGGTA-3′，DNMT1（DNMT1）FW:5′-GGAGGAGGAGCTGCTAAGG-3′和DNMT1（DNMT1）RV:5′-TTGTTTATAGAGAT-TTATTTG-3′DNMT3A型和3B公司以前曾报道过引物。6我们还从完全互补的位点生成了几个缺失4bp的插入物DNMT3A型,DNMT3B公司、和转速1使用QIAGEN XL-site定向突变试剂盒的基因（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENE）。K562细胞（5×106)使用5μg萤火虫荧光素酶报告载体和0.5μg含有Renilla荧光素酶pRL-TK（Promega）的对照载体，根据制造商的协议（方案V，程序T-016），使用核穿孔（Amaxa Biosystems）进行共转染。对于每个核穿孔，50 nM的预处理-miR-29b型或者使用加扰的寡核苷酸。转染后24小时，使用双荧光素酶测定法（Promega）连续测量萤火虫和雷尼拉萤光素酶活性。
凝胶阻滞实验
来源于人类的互补寡核苷酸DNMT1（DNMT1）包含假定启动子的启动子区域转速1-结合位点被合成、退火并用标记32P-dCTP和Klenow。用前体蛋白转染K562细胞后，从中分离出核提取物-miR-29b型或使用核和细胞质提取试剂（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）的杂乱寡核苷酸。用核提取物和32P-标记DNMT1（DNMT1）启动子寡核苷酸如前所述进行。14
GDM分析
根据制造商的说明，使用DNeasy组织试剂盒（QIAGEN）从AML细胞中分离基因组DNA。如我们小组之前报告的那样，使用液相色谱/串联质谱（LC-MS/MS）方法测定GDM。15
基因启动子区域的DNA甲基化分析
定量DNA启动子甲基化ESR1系列和第15页以及预处理的5′上游侧翼序列-miR-29b-1型使用EpiTYPER甲基化分析（Sequenom，San Diego，CA）进行。打乱或miR-29b型转染后72小时提取核孔MV4-11细胞。在进行矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析以确定DNA甲基化模式之前，对总共1μg DNA进行亚硫酸氢处理、体外转录并用RNase A切割。16以下引物用于扩增第15页和ESR1系列:第15页正向，5′-AGGTTTGTAGGTTTATAGGTTT-3′；第15页背面为5′-TCTACTCTCTCTAACAAAATCATAATAA-3′；ESR1系列正向，5′-GGGTAGAATAGTAGTAGTTTGTT-3′；ESR1系列背面为5′-AAATTCTTTACTCCCAAAAAAAAC-3′。第二种方法（焦磷酸测序）用于验证ESR1系列结果如前所述。17简而言之，72小时后从转染了miR-29b型或加扰的寡核苷酸经过亚硫酸氢盐处理并进行PCR扩增（补充数据，可在血液网站；请参阅在线文章顶部的“补充材料”链接）。使用生物素标记引物，使用Sepharose珠纯化最终PCR产物。PCR产物与链霉亲和素Sepharose High Performance（GE Healthcare）结合，并对含有固定化PCR产物的Sepharosebeads进行纯化、洗涤和变性。然后，将0.3 amol/L焦磷酸测序引物退火至纯化的单链PCR产物，并使用PSQ HS96焦磷酸测序列系统进行焦磷酸测测序。这些实验由独立实验室（马萨诸塞州剑桥市Epigen）进行。17每个DNA位点的甲基化程度表示为甲基化胞嘧啶占甲基化和非甲基化胞苷总和的百分比。
统计分析
使用配对Wilcoxon符号秩检验比较样本之间的甲基化频率。所有分析均使用SPSS统计17.0软件（伊利诺伊州芝加哥）进行。P（P）值是双面的。
结果
miR-29b型降调节素DNMT1（DNMT1）、和DNMT3A型和AML中的3B
为了检验以下假设miR-29b型在AML中下调DNA甲基转移酶，我们转染了-miR-29b型或将扰乱的寡核苷酸插入K562和MV4-11 AML细胞系中，并测量DNMT1（DNMT1）和DNMT3A型和3B公司mRNA和蛋白质分别通过定量实时PCR和Western blotting检测。第三个AML细胞系Kasumi-1感染了miR-29b型慢病毒或空载体，因为在这些细胞中使用核穿孔方法效率低。基础miR-29b型这些AML细胞系和miR-29b型转染/感染后的表达值如图S1所示。
前体转染-miR-29b型，但没有扰乱对照，导致内源性mRNA水平显著降低DNMT3A型和3B公司对于所有3个细胞系(A、 B）。24小时时观察到的折叠变化减少为2.5、11.1和6.1DNMT3A型(A） 和2.8、17.7和4.9DNMT3B公司(B） 在pre中-miR-29b型–分别处理K562、MV4-11和Kasumi-1细胞，并与其各自的对照组进行比较。我们还注意到DNMT1（DNMT1）在pre中-miR-29b基因–处理的K562、MV4-11和Kasumi-1细胞(C） ●●●●。这是一个令人惊讶的发现DNMT1（DNMT1）预计不是的目标miR-29b型与这些结果一致，在预处理48小时后，在所有3个AML细胞系中也观察到内源性DNMT1、DNMT3A和3B蛋白水平的显著下调-miR-29b型转染(D） ●●●●。
miR-29b靶点DNMT1（DNMT1）,DNMT3A型、和3B公司AML细胞系和原发性AML母细胞.（A）DNMT3A型，（B）DNMT3B公司、和（C）DNMT1（DNMT1）核穿孔（K562，MV4-11）或感染（Kasumi-1）后的mRNA表达-miR-29b型或其各自的对照（K562和MV4-11细胞的加扰寡核苷酸和Kasumi-1细胞的空载体慢病毒）。直方图显示与对照组相比，正常化后mRNA表达的折叠变化（减少）18秒在3个独立的实验中。条形代表SD。（D）DNMT1、DNMT3A和3B蛋白在预处理后的表达-miR-29b型或控制K562、MV4-11和Kasumi-1细胞系的核穿孔或感染。通过检测β-肌动蛋白抗体确认了等效的凝胶载量。（E）DNMT1（DNMT1）和DNMT3A型和3B公司原发性AML患者样本（n=3）中的mRNA表达-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。直方图显示，与对照组相比，在与18秒。横线表示SD。
预-miR-29b型在原发性AML冲击波中进一步证实了–介导的下调。24小时后DNMT1（DNMT1）和DNMT3A型和3B公司转染前体蛋白的原发性急性髓细胞白血病细胞的mRNA水平-miR-29b型与干扰寡核苷酸转染对照组的比较(E、 S2）。
DNMT3A型和3B公司是真正的目标miR-29b型
可用的miRNA靶点预测程序18,19表明DNMT3A型和3B公司是的假定目标miR-29b型(A） ●●●●。我们通过荧光素酶报告分析在AML细胞中证实了这一发现。DNMT3A型和3B公司在萤火虫荧光素酶基因下游克隆互补位点，并与pre共转染-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。转染24小时后测量荧光素酶活性。与任一细胞共同转染的细胞DNMT3A型或3B公司记者和pre-miR-29b型与与干扰寡核苷酸共转染的人相比，荧光素酶活性降低了约60%(B） ●●●●。我们进一步从每个核苷酸中删除了4个核苷酸（GGUG）miR-29b型–预测位点并与前体基因一起共同转染突变结构-miR-29b型或K562细胞中的扰乱寡核苷酸。如所示B、 删除miR-29b型交互网站废除了miR-29b/DNMT3A和miR-29b/DNMT3B正常化荧光素酶活性无变化证明相互作用。
DNMT3A型和3B公司是的目标miR-29b型.（A）2个萤火虫荧光素酶报告子构建的模式DNMT3A型和3B公司，表示miR-29b型和的3′UTRDNMT3类（B）对与含有DNMT3A型或3B公司野生型或突变的3′UTR和pre-miR-29b型或如图所示的杂乱寡核苷酸。萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。数据显示为前体的相对荧光素酶活性-miR-29b型相对于来自3个独立转染的总共9个实验的对照（加扰寡核苷酸），转染的细胞。条形图代表SD。（C）用萤火虫萤光素酶构建体共转染的K562细胞的双萤光素酶测定，所述萤火虫萤光素酶构建体含有DNMT1（DNMT1）3′UTR和pre-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。数据显示为前体的相对荧光素酶活性-miR-29b型–转染细胞与从3个独立转染获得的9个实验的对照（扰乱寡核苷酸）有关。横线代表SD。
miR-29b型间接下调DNMT1（DNMT1）通过瞄准监管机构转速1
与…对比DNMT3A型和3B公司,miR-29b型预计不会与DNMT1（DNMT1）3′UTR区域，因此直接针对该基因。18,19为了进一步证明DNMT1（DNMT1）不是的直接目标miR-29b型，我们克隆了DNMT1（DNMT1）3′UTR转染荧光素酶报告载体并与pre共转染-miR-29b型或者将一个搅乱的寡核苷酸插入K562细胞系DNMT3A型和3B公司.与以下概念一致：DNMT1（DNMT1）不是的直接目标miR-29b型，经打乱或预处理的细胞之间的荧光素酶活性没有差异-miR-29b型寡核苷酸(C） ●●●●。因此，我们推断miR-29b型可能下调DNMT1（DNMT1）间接地。
最近的工作表明转速1，一种锌指转录因子，直接与DNMT1（DNMT1）并在小鼠和人类中积极调节该基因的转录。14,20在这里，我们进一步确认Sp1-DNMT1型通过显示链接转速1-小干扰RNA处理K562细胞导致细胞凋亡的下调转速1然后依次DNMT1（DNMT1）通过定量RT-CR和Western blotting测定的mRNA和蛋白质水平（图S3A、B）。DNMT1（DNMT1）与对照组（图S3C）和雌激素受体1α相比，下调导致GDM减少40%(ESR1系列)基因再表达（增加1.3倍转速1-siRNA与对照组比较；图S3D）。
有趣的是转速1包含4个预测的结合位点（核苷酸3370、3763、3818和5117）miR-29b型根据Pictar 200518和根据Targetscan 4.2预测的2个结合位点（核苷酸3370和3818处）19(A） ●●●●。因此，我们假设miR-29b型降调节素转速1表达，进而抑制DNMT1（DNMT1）交易激励，从而导致DNMT1（DNMT1）在mRNA和蛋白质水平。为了验证这个假设，我们克隆了转速1包括4个中的3个miR-29b型Pictar预测的结合位点（位点3370、3763和3818）进入荧光素酶报告载体并与前体共转染-miR-29b型或K562细胞中的扰乱寡核苷酸。预处理基因转染-miR-29b型在3个独立的实验中，基因报告者的荧光素酶活性降低了至少50%(B） ●●●●。我们进一步删除了每个序列中的4个核苷酸miR-29b型预测位点并与pre共同转染突变结构-miR-29b基因或K562细胞中的扰乱寡核苷酸。预测位点1和2（即3370和3763）或位点1、2和3（即33703763和3818）的同时突变miR-29b型结合位点废除了miR-29b/Sp1型正常化荧光素酶活性无变化证明相互作用。只有位点1（即3370）的突变不足以阻止这种相互作用(B） ●●●●。此外，前体蛋白的异位表达-miR-29b型AML细胞系和原发性AML母细胞诱导内源性下调转速1信使核糖核酸和蛋白质与打乱的寡核苷酸的比较(C、 D）。
miR-29b靶点转速1（A）基因表达转速13′UTR，4个预测预-miR-29b型结合位点。下面是荧光素酶实验中使用的荧光素素酶报告分析的模式。红色方框上的“X”符号表示miR-29b型已删除的网站。mut表示突变。（B） 对与含有野生型或突变体靶点的萤火虫荧光素酶构建物共转染的K562细胞进行双重荧光素酶检测转速1带预处理的3′UTR区域-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。数据显示为前体的相对荧光素酶活性-miR-29b型-转染细胞与对照组（扰乱寡核苷酸）共9个实验，来自3个独立的转染。横线代表SD。（C）转速1前体细胞核穿孔（K562，MV4-11）或感染（Kasumi-1）后mRNA和蛋白表达-miR-29b型或它们各自的对照、加扰寡核苷酸或空载体慢病毒。直方图显示SD的折叠变化。（D）转速13例原发性AML患者前体细胞核穿后mRNA的表达-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。直方图显示了与对照组相比，经标准化处理后的折叠变化（减少）18秒。横线表示SD。
最后，我们用未经转染或转染前体蛋白的K562细胞的核提取物进行EMSA-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。我们使用了一个从跨度导出的探针DNMT1（DNMT1）含有Sp1结合位点的启动子(). 我们观察到Sp1蛋白存在于DNMT1（DNMT1）未经处理或搅乱的寡核苷酸处理对照组的基因启动子-miR-29b型扰乱了转速1使用DNMT1（DNMT1）发起人。这些结果进一步支持了miR-29b型–介导的下调转速1和减少DNMT1（DNMT1）表达式。
DNMT1启动子活性被前体蛋白下调-miR-29b型通过镇压转速1.（A）EMSADNMT1（DNMT1）转染K562细胞的启动子DNA和核提取物miR-29b型构造(miR-29b型)或加扰控制（sc）。箭头表示DNMT1蛋白复合物。（B） EMSA的DNMT1（DNMT1）启动子DNA与人重组Sp1蛋白（0.5 mg，rhSp1，Promega，目录号E6391）或无蛋白提取物。这些数据进一步表明，Sp1与DNMT1（DNMT1）启动子DNA。（C） 第页，共页DNMT1（DNMT1）使用K562核提取物和未标记DNA竞争物的启动子DNA(转速1-绑定元素和DNMT1（DNMT1）启动子DNA，WT）。作为对照，我们使用了无DNA竞争对手（−）和包含TATA盒序列5′-GCAGAGCATAAGGTAGG a-3′的非特异性未标记探针（TFIID）。此序列与DNMT1（DNMT1）启动子DNA。这种寡核苷酸不竞争的事实表明DNA竞争的特异性DNMT1（DNMT1）DNA和SP1型DNA。（D） 第页，共页DNMT1（DNMT1）启动子DNA使用K562核提取物和未标记野生型（WT）或突变体（M）过量（20倍）DNA竞争物。前两条车道（左起）没有竞争者。The sequences of theDNMT1（DNMT1）启动子DNA和各种DNMT1（DNMT1）具有链接器扫描突变的突变体（以粗体显示）如下所示（M1-M5）。
pre的过度表达-miR-29b型减少全球DNA甲基化
接下来我们研究了pre的强制表达式-miR-29b型也可能在功能上导致DNA低甲基化。使用LC-MS/MS方法测量GDM15在MV4-11和Kasumi-1细胞系中分别转染或感染72小时后-miR-29b型表达寡核苷酸或慢病毒miR-29b型扰乱的寡核苷酸和空慢病毒载体分别作为MV4-11和Kasumi-1的阴性对照。我们观察到，用pre治疗的AML细胞株的GDM减少了约30%-miR-29b型寡核苷酸或miR-29b型慢病毒与阴性对照的比较(A、 B）。通过预处理降低MV4-11细胞的GDM-miR-29b型与在同一时间点使用地西他滨治疗的效果相当(A） 。
pre的过度表达-miR-29b型在AML细胞系中减少GDMMV4-11（A）和Kasumi-1（B）细胞系被核孔化（MV4-11）或感染（Kasumi-1）-miR-29b型（寡核苷酸和慢病毒）或其各自的对照。在核穿孔或感染72小时后，从两种细胞系中获得DNA，并通过LC-MS/MS测量GDM。14MV4-11细胞系也显示了用2.5μM去甲氧基丁卡因、低甲基化剂或磷酸盐缓冲盐水（对照）处理的结果，作为阳性对照。数据显示为绝对GDM。条形图表示两个独立实验的范围。
pre的过度表达-miR-29b基因恢复高甲基化的表达ESR1系列和第15页墨水4bAML通过启动子DNA低甲基化
AML患者经低甲基化药物治疗后，发现一些基因甲基化、沉默并重新表达，包括ESR1系列21和细胞周期素依赖性激酶抑制剂2B(第15页墨水4b).22评估是否过度表达miR-29b型也可能导致AML中高甲基化和沉默基因的再次表达ESR1系列和第15页墨水4b通过定量RT-PCR在MV4-11细胞系和ESR1系列K562细胞系转染前体-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。我们没有测量的原因第15页墨水4b在K562中是因为该基因在该细胞系中纯合缺失。23用前体转染-miR-29b型诱导ESR1系列72小时后，MV4-11和K562细胞的表达分别是对照组的86.1倍和2.1倍(A、 B）。同样，用前体转染-miR-29b型诱导第15页墨水4b72小时后与对照组相比增加了11.6倍(C） ●●●●。此外使用定量方法，16我们发现，在转染pre-miR-29b型寡核苷酸，再表达ESR1系列和第15页墨水4b与这两个基因的DNA甲基化水平降低相一致。这个ESR1系列转染前体蛋白的K562细胞DNA甲基化水平降低-miR-29b型与干扰寡核苷酸转染组相比（平均58%比82%；P（P）=0.06，配对Wilcoxon符号秩检验；D） 。虽然这一差异在统计上不显著，但有显著的趋势。同样ESR1系列转染pre的MV4-11细胞DNA甲基化水平显著降低-miR-29b型与干扰寡核苷酸转染组相比（平均26%vs49%；P（P）=0.03，配对Wilcoxon符号秩检验；E、 S4A）。这个第15页墨水4b在转染前体基因的MV4-11细胞中，DNA甲基化水平显著降低-miR-29b型与那些被打乱的寡核苷酸转染的人相比（平均75%比91%；P（P）=0.001，配对Wilcoxon符号秩检验；D、 S4B）。使用另一种方法（焦磷酸测序），我们确认ESR1系列DNA甲基化水平在-miR-29b型MV4-11转染细胞与打乱的寡核苷酸比较（平均76%vs 62%；P（P）=.04，配对Wilcoxon符号秩检验；图S4C、D）。
预-miR-29b型恢复高甲基化的表达ESR1系列和第15页墨水4b在MV4-11细胞系中（A）定量RT-PCRESR1系列在K562和MV4-11细胞中（B），以及第15页墨水4b（C） 用预处理剂进行72小时的核蒸发后-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。直方图用SD表示平均值ESR1系列K562（D）和MV4-11细胞（E）经预处理后的启动子区域-miR-29b型（■）或使用MassArray系统获得的打乱寡核苷酸（●）。15连接点的线表示相应的CpG对。（F） DNA甲基化定量数据的散点图第15页墨水4b在MV4-11细胞中-miR-29b基因（■）或打乱的寡核苷酸（●）。每个点代表一个CpG或一组分析的CpG。连接点的线表示相应的CpG对。散点图是使用GraphPad Prism（Windows 5.00版）创建的（GraphPad-Software，加利福尼亚州圣地亚哥）。这个P（P）比较打乱和预处理之间的CpG甲基化水平，获得值miR-29b型–使用配对Wilcoxon符号秩检验转染细胞。误差条指示SD。
pre的过度表达-miR-29b型诱导AML急变的部分分化
评估过度表达的生物效应miR-29b型在急性髓细胞白血病（AML）患者中，我们用miR-29b型慢病毒或空载体，并通过FACS测定CD11b表达。如所示，Kasumi-1细胞感染miR-29b型与空载体相比，6天时CD11b表达水平更高（miR-29b型慢病毒与空载体的比较）。
pre的过度表达-miR-29b型诱导AML急变的部分分化（A）流式细胞术分析感染慢病毒表达的Kasumi-1细胞中CD11b的表达miR-29b型或空向量。绿色表示空矢量（EV）；红色，miR-29b型慢病毒。
讨论
在当前研究中，我们描述了miR-29b型AML中DNA甲基化的调控。我们的数据表明miR-29b型目标甲基转移酶从而导致急性髓性白血病中DNA整体低甲基化和高甲基化沉默基因的再表达。目前的结果与我们之前在肺癌靶向活性方面的研究一致miR-29b型在DNMT3A型和3B公司并将这种miRNA的表观遗传学调控作用扩展到骨髓恶性肿瘤。6我们还展示了miR-29b型降调节素DNMT1（DNMT1）通过目标定位转速1是一种锌指转录因子，调节大量参与细胞周期、增殖、凋亡和恶性转化的基因。24已经证明转速1与…的启动子结合DNMT1（DNMT1）并激活DNMT1（DNMT1）小鼠的基因。20我们小组最近报道了蛋白酶体抑制剂硼替佐米通过干扰法国试验标准-κB类/转速1-依赖性转录DNMT1（DNMT1）在AML细胞系和患者的原代细胞中。14我们在这里展示了这一点miR-29b型降调节素转速1，从而干扰转速1-依赖性转录DNMT1（DNMT1）.
发现miR-29b型不仅降低调节DNMT3A型和3B公司而且DNMT1（DNMT1）具有重要的功能分支，因为有报道称DNMT3B公司在结肠癌细胞系中，GDM仅减少了3%。然而，两者的基因破坏DNMT1（DNMT1）和DNMT3B公司完全消除DNA甲基转移酶活性，GDM降低95%。25与这些结果一致，我们现在表明miR-29b型可以有效调节DNA低甲基化，因为它同时针对这两种情况DNMT3类和DNMT1（DNMT1）.
据我们所知，这也是第一份报告显示miR-29b型在功能上导致整体DNA低甲基化和基因重表达的高甲基化和沉默第15页墨水4b和ESR1系列在AML细胞系中。对小鼠的优雅研究支持第15页墨水4b在AML中作为第15页墨水4b-缺陷小鼠更容易发展为髓系白血病。26这个ESR1系列AML患者的基因也经常因甲基化而沉默，22我们之前发现，这些基因的再表达与使用低甲基化药物地西他滨治疗的患者的临床反应相关。27在当前研究中第15页墨水4b和ESR1系列，由pre诱导-miR-29b型与这些基因启动子区域的显著DNA低甲基化相一致，从而验证了miR-29b型.
在这项工作中，我们还提供了有关过度表达的生物学效应的见解miR-29b型反洗钱。正在恢复miR-29b型Kasumi-1细胞的表达诱导部分粒细胞分化。用低甲基化药物处理的AML细胞系也显示出类似的分化作用。28已经证明miR-29b型靶向诱导胆管癌细胞凋亡MCL-1型.29我们最近在AML中证实了这一发现。30异位表达miR-29b型AML细胞靶向诱导凋亡MCL-1型.30因此，恢复miR-29b基因AML母细胞中的表达诱导部分分化和细胞凋亡。
我们还认为这些发现具有潜在的相关治疗意义。瞄准DNMT1（DNMT1）在AML细胞系和患者中使用去甲他滨或阿扎胞苷，尽管可以强制抑制DNMT1（DNMT1）,15表明其他DNMT亚型的潜在活性未被这些药物有效抑制。因此，我们可以设想DNMT1（DNMT1）抑制剂（dectabine或azacitidine）与合成miR-29b型寡核苷酸可能会导致协同的低甲基化效应，更强大的基因再表达，进而改善AML的疾病反应。
致谢
作者感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心白血病组织库的Donna Bucci在主要AML样本制备方面提供的帮助。
这项工作得到了国家癌症研究所（资助R01-CA102031，G.M.；资助P01-CA76259和P01-CA81534，C.M.C.）以及劳里·施特劳斯发现奖和Kimmel翻译奖（R.G.）的支持。
脚注
内幕血液本文的分析出现在这个问题的前面。
本文的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：R.G.、S.L.、M.F.、Z.L.、C.E.A.H.、E.C.、S.S.、J.P.、J.Y.、V.H.、L.J.R.和L.-C.W.进行了研究；R.G.、S.L.、Z.L.、S.V.、W.B.、K.C.、M.A.、N.M.、L.J.R.、D.P.、C.D.B.、J.C.B.、C.M.C.和G.M.分析数据；R.G.、S.L.和G.M.写了手稿。所有作者都对手稿进行了批判性审查和编辑。
利益冲突披露：C.M.C.已经申请了miR-29家族在癌症中临床应用的专利。其余的作者声明没有相互竞争的经济利益。
通信地址：俄亥俄州立大学吉多·马库奇，BRT大厦，俄亥俄州哥伦布市第12大道460号898室，邮编：43210；电子邮件：ude.cmuso@iccucraM.odiuG.
工具书类
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