尽管对肿瘤细胞进行了深入研究，但对正常细胞中调节抑癌基因p53的机制仍知之甚少。内源性p53的生化分析带来了挑战，因为在没有应激的情况下，p53在非转化细胞中保持在低水平(1)。突变型p53通常在肿瘤细胞中表现出更高的蛋白质稳定性(2,三)。这为分子分析提供了机会，尽管蛋白质可能会失去或获得功能(4)。事实上，关于p53调节的一些假设，包括特定翻译后修饰的相对重要性、突变位点以及与调节蛋白的相互作用，在小鼠模型中受到了挑战，在小鼠中可以确定p53的体内功能(三,5–7).
除了在维持基因组稳定性和抑制肿瘤方面的主要作用外，p53还调节正常细胞的特定功能(1)。这些包括发育过程中基因表达的调节(8,9)、细胞衰老和衰老(10)，和代谢功能(6)。尽管是p53ERTAM公司小鼠模型，其中p53的功能和反应可能在时间上受到调节(11)在应激刺激、转化或肿瘤发生之前，有关p53内源性调控的问题仍然没有答案。为了阐明调节内源性p53的机制，我们建立了一个基于TAP-tag与ORF融合的小鼠和干细胞模型第53天它允许通过质谱法对p53蛋白伴侣进行TAP纯化和分析以及翻译后修饰。在这里，我们描述了p53的蛋白相互作用伙伴，它通过泛素化负调节p53蛋白的稳定性。我们探讨了Trim24/bonus-p53相互作用在体内的意义果蝇属发现了该生物体中p53水平的负调控因子。人类肿瘤衍生癌细胞，保留野生型TP53型，通过凋亡对靶向的TRIM24缺失作出反应。对一种先前未知的p53负调控因子的鉴定表明，恢复p53功能的潜在治疗靶点尚待确定。
结果和讨论
建立用于p53分析的小鼠和干细胞模型。
为了便于分析正常细胞中的内源性p53，我们进行了基因靶向，以创建小鼠胚胎干细胞和小鼠(12)表达与C末端TAP标签（p53-TAP）融合的内源性调节p53蛋白KI公司,A类) (13)。p53-TAP的种系传递KI公司等位基因经Southern杂交和等位基因特异PCR证实(图S1A)。第53页-TAPKI公司p53对外源性和内源性刺激保持完全反应TAP-KI公司/+ES细胞和小鼠。细胞凋亡的诱导(图S1B类)以及p53调节基因的表达水平，Cdkn1a型（第21页/CIP1），百万平方米、和Perp公司(图S1C类)在p53-TAP中，在阿霉素暴露的一段时间内几乎相同KI公司和野生型ES细胞。染色质免疫沉淀（ChIP）显示p53-TAPKI公司p53蛋白与特定基因的内源性p53反应元件的相互作用是相同的(图S1D类).
敲入C末端TAP-tag不会破坏p53的调节功能。(A类)靶向策略：同源重组和靶向，如图所示，通过插入loxP侧翼的PGK，产生p53的C末端TAP标签融合-新插入p53的内含子10，在框架中插入TAP-tag盒，全长p53插入外显子11。在选择靶向ES细胞后新通过引入一个cre-expressing质粒来产生p53，从而去除盒TAP-KI公司/+ES细胞（参见SI文本详细信息）。(B类)体内细胞凋亡：e13.5 CNS（WT，p53）的IHCTAP-KI公司/+，p53TAP-KI/TAP-KI)裂解半胱天冬酶3表示凋亡，无（无IR）或暴露于γ-IR（5 Gy IR）。
在ES细胞中，p53介导的凋亡不依赖于转录，因为它主要由p53与线粒体的相互作用驱动(14)。因此，我们进行了体内分析以评估p53-TAPKI公司应激反应，其中p53的下游功能主要由p53调节的转录驱动。p53基因TAP-KI公司/+将小鼠进行杂交以获得活的纯合p53-TAPKI公司（第53页TAP-KI/TAP-KI)以预期基因型比例出生的小鼠，出生后1年未出现肿瘤发展(图S1E类)。我们暴露了胚胎第13.5天（e13.5）的野生型、杂合型和纯合型p53/TAP胚胎KI公司基因型，γ射线照射诱导p53依赖的凋亡反应(15)。中枢神经系统（CNS）切片和免疫组织化学（IHC）的活化、裂解半胱天冬酶3显示p53-TAPKI公司体内出现凋亡反应，与野生型p53无明显区别(B类).
为了调节细胞凋亡和多种下游途径，p53形成四聚体复合物(16)。内源性p53-TAPKI公司野生型p53在p53中表达TAP-KI公司/+ES细胞形成混合异四聚体p53-TAPKI公司/野生型p53蛋白复合物，通过尺寸排除色谱在200 kDa和>1 MDa之间分离(图S1F类)。综上所述，这些数据表明TAP融合到p53和形成异聚物，p53蛋白复合物并没有破坏p53在转录和凋亡中的功能。
鉴定Trim24为p53伴侣。
p53提取物TAP-KI公司/+和p53+/+通过TAP色谱法纯化ES细胞(13)，质谱分析前(图S2A类)。多种肽证实了p53的身份，以及两个已知的p53相互作用的伙伴：Mdm2(17,18)和53BP1(19)。此外，我们还回收了以前不被称为p53伙伴的蛋白质，例如Trim24(20)。最初被命名为转录中介因子1-α（TIF1α），Trim24被鉴定为类视黄醇信号的共同调节因子(21)。Trim24在肿瘤组织特异性分布中高度表达，是已知的肿瘤易位靶点布拉夫（T18）和Ret公司急性早幼粒细胞白血病和甲状腺乳头状癌的致癌基因(22–24).
与高水平的修剪24在特定肿瘤中表达，正常ES细胞中Trim24水平的降低导致核定位p53水平的显著增加(A类)而人类细胞系中Trim24的异位表达降低了p53水平(B类)。通过联合免疫沉淀（co-IP）在ES细胞中验证Trim24-p53相互作用(图S2B类)在多个人类细胞系中(B类)。与RNAi介导的Trim24蛋白和RNA水平降低平行(A类,图S2C类、和图S3)，特异性内源性，p53靶基因Cdkn1a型（第21页/CIP1）和百万平方米在阿霉素治疗前后显著激活(C类和图S3A类)。Trim24减少和p53增加对其他p53调节基因没有统计学意义上的影响，例如，Perp公司，或色氨酸-53自身(图S2C类和图S3)。在从e13.5胚胎中分离出来的MEF中，修剪24耗尽导致p21和马里兰州2表达，以及Perp公司(图S2D类)。细胞耗尽(图S3A类)或缺乏(图S2D类)p53未显示Trim24缺失的显著影响，支持Trim24介导调节的p53依赖性。
Trim24是p53的负调控因子。(A类)RNAi介导的修剪24导致ES细胞中p53蛋白增加，Trim24蛋白减少（shTrim24和shControl）。(B类)TRIM24与人类细胞中的p53相互作用。使用U2OS、HEK293T或MCF7细胞的细胞裂解液（输入），在Dox（0.5μg/mL）或在指定的时间段（hr）内未诱导Dox应激后，用于内源性TRIM24、Flag-TRIM24（Flag）和/或p53的IP。Flag-TRIM24在U2OS和HEK293T细胞中体外表达（+Flag-TRIM24），24小时后进行分析。SDS/PAGE后用指示的抗体进行免疫印迹，以检测相互作用的蛋白质，如所示。(C类)Trim24的缺失导致ES细胞中特异性p53靶基因的激活。实时RT-PCR测定的RNA表达的显著变化由以下内容表示P（P）值小于0.05（学生的t吨测试）。值表示为fold-change，与siControl-treated细胞相比t吨= 0.
Trim24-p53调控途径的体内分析。
哺乳动物Trim24是由70个家族成员组成的更大TRIM组中TIF1亚家族的3个成员之一(25)。已知TRIM家族成员之间的蛋白质相互作用，siRNA缺失修剪24,修剪28、和修剪33（分别为TIF1α、TIF1ß和TIF1γ）显示了补偿，这可能会改变Trim24-调节反应。哺乳动物Trim28（Kap1，TIF1ß）在表观遗传沉默、E3-SUMO连接酶活性中具有已知作用，并与多种蛋白质相互作用，包括Mdm2和E2F1(26–28)。为了确定Trim24是否在体内特异性调节p53，我们转向果蝇属其中基因奖金是TIF1亚家族中进化上保守的唯一同源物(29)，最类似于TRIM24阀内件和TRIM33阀内件.
奖金是Polycomb基因群的成员，是男性生存和变态所必需的(29)。通过图像盘的镶嵌分析，我们发现细胞克隆在奖金以绿色荧光蛋白（GFP，A类)、较小且高度凋亡(艾岛，裂解半胱天冬酶3-阳性）。RNAi介导的果蝇属p53（D-p53）拯救了奖金凋亡表型，导致奖金克隆和caspase 3切割缺失(B类)。类似的拯救是通过显性阴性突变型D-p53实现的。这些观察结果表明奖金导致不受限制的D-p53活性并诱导凋亡。因此，奖金可能是组织中D-p53活性和细胞死亡的主要负调节因子果蝇属，没有的正交百万平方米或之前确定的调节p53蛋白稳定性的途径(30).
Trim24缺失导致细胞凋亡果蝇属. (A类)奖金突变克隆[以GFP标记(A类)]英寸果蝇属由于细胞凋亡（Cas3*-标记），翼想象盘较小。(B类)RNAi介导的D耗竭-p53基因在里面奖金突变克隆（以GFP标记）抑制细胞凋亡（缺乏Cas3*标记）并导致克隆大小显著增加。Aiii公司和比尔显示光盘的轮廓。（比例尺，20μm）
两者之间的联系TRIM24/奖金p53依赖性细胞死亡在进化过程中得以保存。损失TRIM24阀内件在人类乳腺癌细胞系MCF7中(A类)引起自发凋亡(二，裂解层粘连蛋白A阳性），同时有丝分裂减少(iv（四），磷酸化H3阳性），与对照细胞相比(我和三)。在p53阳性MCF7、人肺癌A549和结肠癌HCT116细胞以及p53缺失的MCF7，p53阴性/突变的人前列腺癌PC3和人乳腺癌T47D中进行的siTRIM24/p53平行研究证实，p53依赖性细胞凋亡发生于p53缺失TRIM24阀内件仅在p53阳性细胞中(图S4A类和B类)。什么时候？TRIM24阀内件在MCF7细胞中被耗尽，即使没有DNA损伤，p53蛋白水平也会增加(图S4C类).
TRIM24负调节p53蛋白的稳定性。(A类)MCF7细胞中TRIM24的耗竭增加了细胞凋亡，减少了有丝分裂。用siControl（左）和siTRIM24（右）寡核苷酸转染后，使用识别裂解的层粘连蛋白-A（上）的抗体检测细胞凋亡（绿色），或使用磷脂酶抑制剂H3（下）检测有丝分裂细胞（蓝色）。细胞另外用Hoescht染色，然后进行自动图像采集和分析。(B类)TRIM24的表达降低了p53的寿命。用环己酰亚胺处理MCF7细胞0、15、30、60、120和240分钟（上部，仅转染载体），无DNA损伤（-Dox）或DNA损伤（+Dox）；和（下方，Flag-TRIM24）转染Flag-TRIM24后进行类似处理。通过免疫印迹法分析p53、TRIM24和Flag-TRIM24蛋白水平，通过密度测定法定量，并绘制时间曲线以确定p53的寿命。(C类)内源性p53泛素化测定：如图所示，用Mdm2、Flag-TRIM24、Flag-TRIM24ΔRing、siTRIM24或载体对照转染MCF7细胞。从转染MCF7细胞的裂解液中免疫沉淀p53，用MG132（+）或未经处理（-）处理，并用抗泛素抗体免疫印迹以捕获多泛素化p53和抗p53抗体以指示p53的水平。(D类)p53的体外泛素化：对体外翻译的p53进行体外泛素反应35如图所示，在存在或不存在UbE1、UbcH8和25μM锌的情况下，S-p53与hTRIM24结合（+：20μg，++：40μg，染色估计）。通过放射自显影分析反应。
TRIM24通过改变p53的稳定性来调节p53蛋白水平。
TRIM蛋白家族的成员由其保守的N末端结构域定义：一个环结构域、两个B盒结构域和一个线圈结构域，而其C末端结构域则更具变异性。TRIM家族的一些成员是已知的E3-泛素连接酶，泛素化蛋白酶体介导降解的特异性蛋白质(25)。p53的特定负调控因子，如Mdm2，通过其RING结构域以这种方式控制p53蛋白水平(7,31).
我们确定TRIM24的RING结构域作为E3-泛素连接酶来调节p53蛋白水平，类似于Mdm2(C类)。添加蛋白酶体介导的降解抑制剂MG132导致p53蛋白水平升高，并检测到内源性泛素化p53。TRIM24（Flag-TRIM24）或Mdm2的异位表达增加了p53的泛素化，降低了p53水平。当TRIM24的RING结构域被删除（TRIM24ΔRING）时，p53的泛素化降低，当内源性TRIM24全部耗尽时，泛素化进一步下降（siTrim24）。
TRIM24的异位表达改变了p53蛋白衰变的动力学(B类和图S5)。通过向MCF7细胞中添加环己酰胺，蛋白质合成的停止导致p53蛋白的时间依赖性损失，TRIM24的异位表达加速了p53蛋白的时间依赖性损失。应激介导的p53（Dox）诱导延长了p53蛋白半衰期5倍，这与异位TRIM24有效对抗(B类)。TRIM24作为p53蛋白水平的直接调节器，其作用由p53的体外泛素化支持(D类)。杆状病毒表达，Flag-TRIM24在E2 UbcH8存在下诱导p53的泛素化，与Mdm2将UbcH5用作E2形成对比(32).
我们的结果表明，Trim24是p53的负调控因子，与Mdm2和Cop1并列，是一种靶向p53降解的环蛋白(33)。Trim24可能位于p53和/或核受体调节的信号通路网络之间的交叉点。Trim24作为特定核受体（例如维甲酸受体）的共同阻遏物的双重作用(21)以及p53水平的调节器，可能决定Trim24调节的细胞类型和/或组织特异性结果(34)。Mdm2显然是先前确定的p53水平负调控因子中的主要调控因子，例如PirH2、ARF-BP1、Cop1等(17,18,35)。这些蛋白是否在特定细胞类型或特定条件下负性调节p53，有待于对其体内功能进行分析。
p53失去作为抑癌剂的能力是其基因突变的结果，更广泛地说，是调节其稳定性、活化或下游功能的途径功能障碍的结果。我们将Trim24作为多种来源细胞中的p53分子，并将其进化保护作为p53的负调控因子，这突出了p53控制及其微调的中心性质。靶向p53的E3-泛素连接酶的去调控是人类癌症的共同主题(36)。以Trim24蛋白为靶点治疗提高p53蛋白水平可能为p53功能的恢复和诱导肿瘤细胞凋亡提供一条途径。
方法
p53的生成水龙头小鼠ES细胞和小鼠。
一种产生p53 C末端TAP标签融合的靶向载体将一个loxP侧翼的PGK-neo盒插入到p53的内含子10中，并将一个TAP-tag盒插入框架中，将全长p53插入外显子11中，包含约3.5 kb 5′和2.5 kb 3′同源臂和MC1-TK阴性选择标记。有关ES细胞和生成小鼠的靶向性和分析的详细信息，请参阅SI文本.
果蝇研究。
奖金突变克隆和RNAi介导的D失活-p53基因由MARCM系统诱导(37)，使用奖金21亿等位基因(29)。UAS-D-p53基因RNAi库存由克莱顿·莫里森（贝勒医学院）提供。
细胞凋亡检测。
根据制造商说明书（BD PharMingen），通过膜联蛋白V（FITC）和碘化丙啶双重染色对凋亡细胞进行计数。在Epics XL流式细胞仪（Coulter）上分析了2万例事件，并使用System II软件（Coutter）测定了细胞凋亡率。如前所述，我们在小鼠胚胎脑切片上对裂解的caspase-3（细胞信号传导）进行了免疫组化(38).
TAP纯化、IP、银染和免疫印迹。
使用约5-10 mg总蛋白全细胞裂解液从mES细胞中进行TAP-tag IP。细胞在裂解缓冲液1中进行裂解（LB1:50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%Nonide P-40，10%甘油，1 mM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂Calbiochem，cat#539131），然后在100000×克在4°C下保持1小时。上清液用125μL（50%浆液）蛋白A Sepharose珠（GE Healthcare）在4℃下摇晃2 h。移除小球，并在4°C下将抗蛋白A（P2921，Sigma）抗体添加到预分离的裂解液中过夜。TRIM24-IP的抗TRIM24（TIF1-α，A300–815A，Bethyl）使用了相同的方法。按照预分离的方式添加珠子，然后收集在色谱柱（Bio-Rad）中，然后用LB1（150 mM NaCl）、LB2（300 mM NaC1）、LB3（500 mM NaCI）、LB1和LB2洗涤10分钟。对于含有抗蛋白A的TAP-IP，在4°C下用10μg烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶在20 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、0.1%Nonide P-40、10%甘油、0.5 mM EDTA、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂中从珠中分离蛋白复合物3小时。将IP蛋白转移到硝化纤维素膜上，并用p53（CM5，Novocastra）、TRIM24（Bethyl）和β-肌动蛋白（Genetex）的一级抗体进行免疫印迹。
p53TAP小鼠存活曲线。
p53基因水龙头/+杂合小鼠杂交产生p53+/+，p53水龙头/+和p53轻敲/轻敲对每个基因型的20只小鼠进行肿瘤发生、死亡或疾病迹象的监测。记录被杀小鼠的年龄，并使用Prism 5（Graphpad）计算Kaplan-Meier存活曲线。
尺寸-排除色谱法。
如上所述收集、裂解和离心ES细胞。通过Superose6（10/25）（GE Healthcare）对约0.5 mg mES全细胞裂解物蛋白质进行尺寸排除色谱分析，该色谱与LB1缓冲液平衡。有关详细信息，请参阅SI文本.
p53的泛化。
如图所示，用质粒转染MCF7细胞。用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞6 h，并在添加10 mM碘乙酰胺（GE Healthcare）和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中进行裂解。使用p53（DO1）抗体从1 mg蛋白裂解物中免疫沉淀内源性p53，并使用抗泛素抗体（Sigma）进行免疫印迹。用p53重复印迹，以确认p53的下拉作用相等。
p53的体外泛素化。
如前所述，N末端标记的人类TRIM24在杆状病毒系统中表达并纯化(39)但没有从旗杆洗脱。如前所述，体外泛素化完成(32)，经过以下修改：15μL体外翻译35S标记的p53（TNT系统，Promega）在4°C下与20–40μg珠结合Flag-hTRIM24孵育1小时。将标记珠洗涤2次，并在37°C的反应缓冲液（BostonBiochem）中与100 ng UbE1、150 ng UbcH8和10μg泛素孵育1 h。反应在9%SDS/PAGE凝胶上分离35放射自显影检测S-标记p53。
p53半衰期的测量。
用Flag-TRIM24或对照DNA转染MCF7 24 h，并在分析前的不同时间点用30μg/mL蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理。为了分析p53在阿霉素（Dox）作用后的半衰期，细胞先用Dox预处理4h，然后同时用CHX+Dox处理。如上所述对蛋白质水平进行量化，并绘制为剩余蛋白质百分比与CHX治疗时间的关系图，以计算p53半衰期。
ChIP分析和其他方法。
如前所述，进行了ChIP分析(40)，修改详见SI文本细胞培养、siRNA缺失条件和其他方法可在SI文本.
