实验血液学。作者手稿；PMC 2009年7月10日发布。
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尼姆斯：美国国立卫生研究院19051
B细胞中涉及RasGRP、Erk和Bim的促凋亡信号通路
,一 ,一 ,一 ,b条 ,c（c） ,d日和一
斯泰西·斯坦格
一加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系
安娜·洛佩兹校园
一加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系
宋晓华
一加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系
南希·道尔
b条加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学儿科系
彼得·布隆伯格
c（c）美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院癌症生物学和遗传学实验室
保罗·温德
d日美国加州斯坦福大学化学与系统生物学系
詹姆斯·斯通
一加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系
一加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系
b条加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学儿科系
c（c）美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院癌症生物学和遗传学实验室
d日美国加州斯坦福大学化学与系统生物学系
- 补充资料
1
GUID:D5D65E64-6003-45EA-B965-9D0B673C80FA
摘要
目标
Bryostatin-1和相关的二酰甘油（DAG）类似物激活淋巴细胞中的RasGRP，从而激活Ras并模拟免疫受体信号的某些方面。为了确定RasGRPs在淋巴细胞凋亡中的作用，并确定DAG类似物在淋巴细胞疾病中的潜在治疗用途，我们描述了淋巴源性细胞系对DAG类似品的反应。
材料和方法
用bryostatin-1或其合成类似物“pico”处理人淋巴源性B细胞系和小鼠原代B细胞。用生化分析研究Ras信号通路伙伴和Bcl-2家族成员。使用生长和凋亡测定法监测细胞反应。
结果
用DAG类似物刺激B细胞可激活蛋白激酶C/RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk信号和促凋亡BH3-only蛋白Bim的磷酸化。在体外，Bim在以前与凋亡活性增加相关的部位被Erk磷酸化。在来自非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的Toledo B细胞中，DAG类似物刺激导致广泛的凋亡。细胞凋亡可以通过下调Bim或过度表达Bcl-2来抑制。它与Bak–Bax复合物的形成和线粒体膜通透性增加有关。Toledo B-NHL细胞凋亡显示出对持续信号的显著依赖性。
结论
在B细胞中，Erk激活直接导致与Bim激活相关的位点上Bim的磷酸化。在Toledo B-NHL细胞中，凋亡对持续信号的依赖性表明，Bcl-2家族成员可以解释信号持续时间，这是B细胞受体介导的阴性选择的重要决定因素。某些B-NHL病例可能通过此处概述的机制对DAG类似物治疗产生反应。
淋巴细胞的反应取决于抗原受体信号的强度和持续时间以及通过其他受体的伴随信号[1,2]. 不同条件下的免疫受体刺激会导致明显相似的后续生化事件，但这些可以促进淋巴细胞发育、活化、无能、增殖或凋亡。控制淋巴细胞的凋亡尤其重要，因为必须通过这种方法剔除具有强烈自我激活免疫受体的细胞，以避免自身免疫性疾病[三].
小GTPase Ras在淋巴细胞发育和功能过程中，在传递免疫受体信号中起着关键作用。淋巴细胞中的Ras受RasGRPs（Ras鸟苷释放蛋白）调节[4–6]. 这些构成了一类Ras鸟苷酸核苷酸交换因子（Ras GEF），其具有与蛋白激酶C（PKC）的二酰甘油（DAG）结合域相似的调节C1域。免疫受体信号传导导致磷脂酶C激活，导致DAG在细胞膜中积聚。通过C1结构域结合DAG，RasGRP被招募到膜中，在那里它们与底物Ras相互作用，并将其转化为活性GTP结合状态。此外，膜DAG招募并激活PKC，PKC通过磷酸化正向调节RasGRPs[5]. 一旦Ras被激活，它可以与多种下游效应器系统相互作用，其中最具特征的是Raf-Mek-Erk激酶级联。蛋白激酶Erk磷酸化许多底物，从而影响细胞增殖、分化和存活。
在包括淋巴细胞在内的许多细胞类型中，凋亡受Bcl-2家族调控，该家族由三种功能不同的蛋白质组成[7]. 促凋亡Bak和Bax可形成多亚单位复合物，损害线粒体外膜的完整性。这导致细胞色素C释放、促凋亡分子APAF-1的组装和执行者半胱天冬酶的激活。在健康细胞中，根据一种流行的模型，抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-Xl和Mcl1，通过结合和中和Bak和Bax来对抗这一过程。反过来，这些抗凋亡蛋白可以被第三类Bcl-2蛋白滴定，即仅促凋亡的BH3蛋白[三].
Bim是淋巴细胞凋亡的关键BH3-唯一调节因子[7–9]. 一些证据支持Bim基因表达受免疫受体信号下游调控的观点[10–12]. 此外，来自许多细胞系统的证据支持Bim可以通过磷酸化进行积极或消极调节的建议[13–15]. Bim通过选择性剪接表达为三种尺寸和丰度递减的经典蛋白：BimEL、BimL和BimS(). BimEL特异区Ser69（啮齿动物中的Ser65）的Erk磷酸化导致多种细胞类型中的泛素依赖性蛋白水解[15,16]. 相反，激酶Jnk在Ser44、Thr56和Ser58上磷酸化BimL[17]. 磷酸化被认为有助于BimL从细胞骨架重新分布到线粒体，从而增加其凋亡活性。然而，在T细胞中，Bim与线粒体构成相关，这表明磷酸化必须通过其他方式激活Bim[18]. 阐明淋巴细胞磷酸化是如何调节Bim功能的，将对免疫受体信号如何调节免疫细胞凋亡提供相当深入的见解。
体内外Erk对BimEL和BimL的磷酸化作用。(一个)用10 nM pico处理细胞28小时（左面板）或100 nM处理细胞20分钟（右面板）。抑制剂是在二酰基甘油（DAG）类似物刺激之前加入的。(B类)Toledo B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞用10 nM pico治疗不同时间段，Bim磷酸化通过抗磷酸化BimEL（Ser 69）抗体探测（顶部面板）或电泳迁移率转移（底部面板）证明。(C类)体外磷酸酶处理逆转了BimEL和BimL电泳迁移率的降低。前两个通道代表直接分析的裂解物（L）。(D类)直接免疫沉淀或与抗Bcl-2抗体共沉淀的内源性Bim蛋白，在电泳迁移率变化分析之前，用重组Mek+Erk磷酸化。(E类)重组麦芽糖结合蛋白（MBP）-BimL野生型（wt）、MBP-BimL三突变型（tm）和MBP-BimS与Mek-activated Erk（奇数车道）在标记的三磷酸腺苷（ATP）存在下孵育。顶部面板，放射性磷酸盐掺入通过2小时放射自显影术检测。底板、MBP-BimL和MBP-BimS通过抗Bim抗体免疫印迹检测。未标记的箭头表示MBP-Bim的蛋白水解酶分解产物，该产物在激酶分析之前存在于蛋白质制剂中。控制通道（偶数）来自相同的配对反应，但省略了Erk。(F类)示意图显示了主要Bim剪接形式与磷酸化位点和本文中讨论的潜在泛素化位点（K112）位置之间的结构关系。
在这里，我们报告了用DAG类似物治疗托莱多非霍奇金B细胞淋巴瘤（B-NHL）细胞系导致PKC/RasGRP-Erk信号轴激活、促凋亡Bim磷酸化和Bim依赖性凋亡。这种新型凋亡途径的特性可能揭示了持续的BCR信号是如何导致强自我激活B细胞的缺失的。我们的结果也可能为使用DAG类似物治疗B-NHL的一个子集提供了一个机制上的理论基础。
材料和方法
试剂和抗体
pan-PKC抑制剂Bisindolylmalemide I购自Calbiochem，最终浓度为4.6μM。Mek抑制剂U0126购自Cell Signaling，用量为1 uM。四甲基罗丹明乙酯（TMRE）购自Molecular Probes。MG132（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA）在10 uM时使用。Lambda磷酸酶购自新英格兰生物实验室。
以下来自细胞信号的抗体用于通过免疫印迹检测蛋白质：Bim（#4582）、Bcl-2（#2872）、Bcl-Xl（#2762）和Mcl1（#4572）。聚ADP-核糖聚合酶家族成员1（PARP-1）抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（sc-8007）。对于免疫沉淀，我们使用Bax（N20，sc493；圣克鲁斯生物技术）、Bak（NT，06536 Upstate Biotechnology）和G-Beta（m14，sc-261 Santa Cruz Biotechnology）抗体。对磷酸-BimEL（人类Ser69）的抗体来自Chemicon（AB3579）。抗Bcl-2抗体6C8（BD Biosciences，Mississauga，Ontario，Canada）用于共沉淀Bcl-2和Bim，用于体外Erk磷酸化研究。
细胞和基因转移
Toledo B-NHL、Ramos和RL细胞系取自美国型培养物收集中心，并在添加10%胎牛血清、抗生素和5×10−5Mβ-巯基乙醇。
通过分子克隆技术证实了野生型BimEL、L和S mRNA序列在Toledo B-NHL中的存在。为了降低Toledo B-NHL细胞中所有三种Bim亚型的表达，我们使用了一种小干扰RNA（siRNA）逆转录病毒载体[19]. 使用无辅助性的两性包装细胞系将逆转录病毒转导到Toledo B-NHL细胞中，并用2.5 ug/mL嘌呤霉素筛选感染细胞。使用携带可诱导金属硫蛋白启动子的pBMGNeo表达质粒过度表达Bcl-2[20]. 用消化后不是通过电穿孔将I限制性内切酶、线性质粒DNA导入Toledo B-NHL中，然后选择1.0 mg G418（活性药物）/mL的转染细胞。添加5 uM CdCl可增强Bcl-2的表达2过夜，然后在pico治疗期间。
从5-8周龄B6和光栅1−/−;Rasgrp3型−/−如前所述，采用磁珠技术的双突变小鼠（C57Bl/6J背景）[21,22]. 动物研究是根据阿尔伯塔大学健康科学政策和福利委员会批准的协议，根据加拿大动物护理委员会指南进行的。
生化分析
通过免疫印迹检测RasGRP1和RasGRP3是使用我们之前描述的方法和抗体进行的[23,24]. Ras、Mek和Erk信号分析如前所述[24].
为了检测Bak–Bax复合物，首先在含有20 mM Tris pH 7.4、137 mM NaCl、2 mM乙二胺四乙酸、10%v/v甘油、2%w/v 3[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-丙磺酸盐（CHAPS）和蛋白酶抑制剂的缓冲液中溶解细胞[25]. 添加抗体和蛋白A Sepharose后，将裂解产物在0C下培养2小时，然后在同一缓冲液中洗涤三次，但CHAPS降低至0.5%。免疫沉淀样品用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用抗Bak抗体进行免疫印迹。
为了去除Bim的磷酸化，在NP-40裂解缓冲液（20 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，10%甘油，1%v/v NP-40，40 mMβ-甘油磷酸盐和蛋白酶抑制剂）中裂解pico处理的Toledo细胞，并离心以去除细胞核。Bim是用蛋白A Sepharose珠从裂解物中免疫沉淀的，该蛋白珠涂有可识别所有三种Bim物种N末端区域的多克隆抗体。在NP-40裂解缓冲液中洗涤三次后，在由50 mM Tris（pH 7.5）、100 mM NaCl、2 mM MnCl组成的磷酸酶反应缓冲液中清洗珠子一次2、2 mM二硫苏糖醇、0.1 mM乙二醇四乙酸和0.01%Brij 35。然后将100 uL样品（50%珠体积）与1000单位噬菌体λ磷酸酶在30°C下培养30分钟。在一些分析中，在添加酶之前，在0.5 mM处添加磷酸酶抑制剂原钒酸钠。为了控制抑制剂或磷酸酶对电泳迁移率的非特异性影响，在反应结束时也向实验样品中添加原钒酸盐。
为了在体外证明Bim的Erk磷酸化，使用了两种方法。第一种方法是直接从RL细胞的NP-40缓冲液裂解物中免疫沉淀Bim，或使用抗Bcl-2抗体与Bcl-2共沉淀。我们选择RL细胞进行此实验，因为这些细胞中Bcl-2的过度表达可能有助于Bim与Bcl-2结合。将免疫沉淀蛋白在30°C的温度下，在含有重组His-tagged-Mek1（4.0μg）和GST-Erk2（4.0μG）的50-uL反应中孵育60分钟，每种蛋白均在大肠杆菌、100μM未标记的三磷酸腺苷（ATP）、25 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM醋酸镁和2 mM二硫苏糖醇。使用电泳迁移率变化分析监测磷酸化。在第二种方法中，BimL野生型和BimL三重突变体（Ser44Ala、Thr56Ala、Ser58Ala）cDNA在大肠杆菌使用载体pMalC2，该载体以麦芽糖结合蛋白（MBP）-BimL融合蛋白的形式表达每个蛋白。GST-Erk首先通过与重组Mek1和100 uM未标记ATP孵育激活。然后使用谷胱甘肽珠从Mek1中分离活化的Erk，并在含有20 uM未标记ATP和10 uCi的反应中用于磷酸化MBP-BimL[32Pγ]ATP。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过放射自显影术监测标签并入MBP-BimL。
为了量化下调和过度表达研究中的Bim和Bcl-2，使用ImageQuant TL 2005对免疫印迹图像进行分析。结果是重复实验的代表。
细胞凋亡和生长分析
为了确定线粒体完整的细胞比例，在不同培养孵育期的最后20分钟，在100 nM的条件下添加TMRE。流式细胞术分析清楚地区分了两种染色性质没有重叠的细胞群体：凋亡细胞（未染色）和存活细胞（染色）。Toledo B-NHL细胞以约22小时的倍增时间生长，并且DAG类似物诱导的TMRE染色损失在较短的时间内发生。因此，我们将活细胞表示为原始百分比，并忽略了非凋亡部分增殖的可能影响。然而，Ramos细胞的倍增时间约为13小时，抗IgM诱导的TMRE染色损失在48小时比24小时更明显。因此，在我们将观察到的凋亡细胞数量绘制为每种培养物中初始细胞数量的百分比（5.4×10+52.0 mL）。通过对代表性培养物的直接显微镜观察，验证了每种方法的有效性。根据制造商的说明（德国曼海姆罗氏）使用dUTP末端标记TUNEL分析。
不同B细胞群体之间的相似性和差异。(一个)从C57Bl/6J小鼠（B6）分离的原代脾B细胞在未经处理的情况下孵育或用pico刺激3.5小时，事先添加或不添加Mek抑制剂。通过电泳迁移率变化分析BimEL和BimL，以检测磷酸化。(B类)同样，来自C57Bl/6J（B6）和光栅1 −/−;Rasgrp3型−/−双突变体（RasGRP1/3−/−)小鼠在10 nM pico处理4小时后进行比较。(C类)用抗IgM抗体（10 ug/mL）单独或Mek抑制剂预处理Ramos B细胞30分钟，然后通过免疫印迹分析Bim。(D类)Ramos B细胞在含有U0126、抗IgM或两者的培养基中培养48小时。使用流式细胞术检测细胞凋亡，以量化无法吸收四甲基罗丹明乙酯（TMRE）的细胞，并将凋亡细胞的数量绘制为输入细胞的百分比(***第页< 0.0001; 参见材料和方法）。结果在独立实验中重复。(E类)采用TMRE染色和流式细胞术，比较托莱多B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）和RL细胞对微创治疗的反应。用pico培养24小时。(F类)通过免疫印迹分析Toledo B-NHL和RL细胞中各种Bcl-2家族成员的表达。裂解物由未经处理的培养物以及单独使用10 nM pico或Mek抑制剂处理4小时的培养物制备。每一条凝胶通道都装载了100 ug蛋白质。(G公司)通过使用Bim免疫印迹分析BimEL来检测Bi-mEL迁移率和表达水平，比较Toledo B-NHL细胞（T）和RL细胞（R）对pico（10 nM）和蛋白体抑制剂MG132处理的反应。治疗5小时。
标记细胞通过流式细胞仪使用氩激光（480nM）和Cellquest软件（BD Biosciences）使用FACScan进行分析。流式细胞仪值是在两个单独的实验中从四个单独的培养物中得出的平均值（平均值的±标准偏差）。使用学生的t吨-测试。细胞增殖实验采用Zf型计数器（Coulter Electronics）进行。
结果
刺激Toledo B细胞中的RasGRPs通过线粒体途径触发Mek依赖性凋亡
我们检测了一组人类B细胞衍生的细胞系对DAG类似物的反应，如bryostatin-1及其合成类似物“pico”[26]. 我们之前证明，这两种化合物在基于T细胞RasGRP1的分析中无法区分[27]. 我们发现，用低纳米摩尔浓度的DAG类似物处理Toledo B-NHL细胞，使其呈现颗粒状、空泡状外观并死亡().
二酰甘油（DAG）类似物通过蛋白激酶C（PKC）和Mek依赖机制诱导托莱多B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞死亡。(A–D)在不同条件下培养48小时后，显示Toledo B-NHL细胞的形态：(一个)未经处理；(B类)10 nM微微；(C类)10 nM pico加4.8 uM双吲哚甲酰胺I；(D类)10毫微克加上10微米U0126。
PKC抑制剂Bisindolylmalemide I保护Toledo细胞免受pico诱导的细胞死亡(). Mek抑制剂U0126也阻断了pico的毒性作用(). Mek抑制剂PD098059也获得了类似的结果（数据未显示）。
其他信号通路的抑制剂，如环孢霉素A（钙调神经磷酸酶）、雷帕霉素（mTOR）、Ly294002（磷脂酰肌醇3-激酶）、JNK抑制剂II（JnkI和Jnk2丝裂原活化蛋白[MAP]激酶）和SB 202190（p38 MAP激酶），不能保护Toledo B-NHL细胞免受皮卡诱导的死亡（数据未显示）。
与我们研究的其他B细胞一样，Toledo细胞同时表达RasGRP1和RasGRP3(). 添加100 nM pico导致Toledo B细胞中Ras-GTP水平迅速升高。这可能导致Raf的激活，如Mek和Erk磷酸化的快速诱导所证明的(). 经pico处理后，RasGRP3表现出电泳迁移率降低，表明磷酸化(). pan-PKC抑制剂Bisindo-lyl马来酰亚胺I阻断了皮卡刺激的Toledo细胞中RasGRP3电泳迁移率的改变，减少了Ras-GTP的积累，并阻断了Mek1和Erk的活化(). PKC抑制剂对Mek1和Erk的影响大于对Ras-GTP的影响，这可能反映了PKC在Raf活化中的作用[28]. 真实的bryostatin-1在Toledo B-NHL细胞中引发与pico所见的信号反应不可区分(). 因此，与我们研究的其他B细胞相比[6,22]，Toledo B-NHL细胞具有类似的RasGRP信号系统。
托莱多B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中RasGRP1和RasGRP3的表达及通过二酰甘油（DAG）类似物的激活。(一个)免疫印迹显示RasGRP1和RasGRP3的存在。RasGRP3的磷酸化明显表现为经皮考处理后电泳迁移率降低。通过对C57Bl/6J（B6）和RasGRP3缺失突变（−/−）小鼠脑提取物中内源性RasGRP2的平行分析，以及利用载体pBabePuro（左四车道）对大鼠2细胞中外源性表达的RasGRP1的分析，证实了RasGRP4抗体的特异性。Pico诱导的Erk和Mek磷酸化用磷酸化抗体证明，而Ras-GTP用下拉法检测。这两种磷酸化标记对应于磷酸化标记1和磷酸化标记2。单独或在用pan-PKC抑制剂Bisindolylmalemide I（Bis）预处理后，用100 nM pico处理20分钟。(B类)Bryostatin-1引起RasGRP信号系统的类似激活。用100 nM bryostatin-1处理细胞10分钟。NS=非特异性带。
用pico长期处理Toledo B-NHL细胞导致其将TMRE同化到线粒体的能力逐渐丧失()表明Toledo B-NHL细胞因凋亡而死亡。使用TUNEL分析监测DNA片段，大多数细胞在48小时后出现核DNA片段(). 使用pico和bryostatin-1获得的结果非常相似。通过直接电泳分析（数据未显示），凋亡细胞也显示出广泛的细胞核DNA片段。我们还观察到PARP-1的蛋白水解断裂，这意味着执行者半胱天冬酶的激活(). Mek抑制剂阻断了所有这些凋亡反应。因此，Toledo B-NHL细胞中的DAG类似物处理通过RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk介导的线粒体途径诱导细胞凋亡。
通过线粒体途径通过二酰甘油（DAG）类似物治疗Toledo B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞诱导凋亡。(一个)用10 nM pico处理细胞不同时间（以小时为单位），然后用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色以检测线粒体健康的细胞。通过在整个培养期内加入Mek抑制剂U0126来证明染色损失的Mek依赖性。(B类)使用TUNEL分析测定48小时5或100 nM微微处理（黑色和灰色条代表重复培养物）或苔藓抑制素-1处理（浅色条）后DNA片段的诱导。(C类)用10 nM Pico处理24小时后，通过免疫印迹证实了Pico诱导的、Mek依赖的聚ADP-核糖聚合酶家族成员1（PARP-1）的裂解。全长PARP-1由p115表示，而p85代表半胱天冬酶叶子物种。
DAG类似物诱导的凋亡涉及Bim、Bcl-2和Bak/Bax依赖机制
我们通过免疫印迹法检测了各种Bcl-2家族成员的状态，以揭示Erk活化与Toledo B-NHL细胞线粒体膜通透性增加之间的联系。引人注目的是，在DAG类似物处理的Toledo B-NHL细胞中，仅促凋亡的BH3蛋白Bim表现出电泳迁移率变化，表明磷酸化(). 用Mek抑制剂U0126预处理阻断了pico-induced mobility shift of BimEL and BimL(). 当用pan-PKC抑制剂预处理阻断RasGRP1和RasGRP3的激活时，也得到了类似的结果().
BimEL和BimL的磷酸化在pico处理期间显著持续，在一个实验中观察到最晚24小时。BimEL的修饰包括Ser69上的磷酸化，如磷酸特异性抗体所示(). BimEL和BimL迁移率变化密切相关。与其他细胞类型的情况相反，BimEL的丢失，正如泛素化和蛋白质体介导的降解所预期的那样，是适度的或没有观察到。正如之前的研究所证实的那样，刺激的BimEL和BimL迁移率变化对磷酸酶治疗敏感(). BimS在我们的免疫印迹中没有重复显示，但从未发现发生诱导的迁移率变化(、和). 这些是潜在的重要观察结果，因为它们表明Erk可以磷酸化共识位点Ser44、Thr56和Ser58上的BimL，这些修饰以前与促凋亡功能增强相关。
pico诱导Toledo B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞凋亡中持续RasGRP-Erk信号和Bim磷酸化的需求。(一个)未经处理（菱形）培养Toledo B-NHL细胞，用10 nM pico单独（方形）处理4天，或另外用4.6 uM双吲哚甲酰胺I（圆形）或1.0 uM U0126（三角形）处理4天后，用无药培养基冲洗。然后将细胞在常规培养基中再培养4天并进行计数。(B类)用10 nM pico处理Toledo B-NHL细胞，并在31小时通过四甲基红胺乙酯（TMRE）染色评估线粒体完整性。测定了在9小时时洗掉pico的效果。还比较了在pico（早期Bis）前或8小时后（晚期Bis）添加Bisindolylmalemide I的效果。(C类)同样，未经处理的细胞（浅色条）或用10 nM pico（深色条）处理的细胞，在30小时时用TMRE染色检查，在4、8或12小时时不添加或添加U0126，如图所示。(D类)在加入或不加入Mek抑制剂的最后30分钟培养后，在指定的时间取出后一个实验中的等分细胞。通过免疫印迹法分析裂解液中的磷酸化标记物和Bim。
为了确定Erk是否能直接磷酸化BimL，将内源性Bim免疫沉淀并与活化蛋白激酶孵育。因为Bim与Bcl-2在物理上相关，可能作为相对更有效的底物[13]，我们还与抗Bcl-2抗体间接共沉淀Bim。在这两种情况下，使用凝胶迁移率测定法对样品进行评估，以记录磷酸化。值得注意的是，无论以哪种方式沉淀的BimEL和BimL都充当了Erk子策略，而BimS没有(). 为了更详细地研究BimL的Erk磷酸化，重组全长BimL与活化的Erk和放射性标记的ATP孵育。正如预期的那样，很容易检测到野生型BimL中的磷酸盐掺入(). 在44、56和58位具有丙氨酸取代的三重突变蛋白不是底物，BimS也不是。总之，这些观察结果表明，在DAG类似物诱导的凋亡过程中，Erk可以在促凋亡位点上直接磷酸化Bim().
使用逆转录病毒载体来指导siRNA的表达，该siRNA能够下调所有三种典型Bim剪接形式，证实了Bim作为该系统中凋亡效应分子的关键重要性。与表达无关控制载体的细胞相比，Bim-EL蛋白水平降低了44%(). Bim的减少与皮科治疗后24小时TMRE染色的大量保留有关。它还导致48小时时DNA片段减少().
Bcl-2家族成员对二酰甘油（DAG）类似物诱导Toledo B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞凋亡的调节。(一个)通过免疫印迹检测表达对照载体siLuc或siBim载体的Toledo B-NHL细胞的Bim表达水平。Erk被视为负载控制。结果代表了两个独立的实验。(B类)通过四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色，在10 nM微微处理20小时（实验#1）或26小时（实验#2）后比较表达siLuc和siBim下调载体的Toledo细胞。两个实验的结果通过表达活细胞百分比与未处理细胞的百分比进行了标准化(**第页< 0.03). (C类)同样，在两个单独的实验中，使用TUNEL分析法对核DNA片段进行10 nM pico处理28小时后的siLuc和siBim进行比较(***第页< 0.005). (D类)对表达空载体（BMG）和过度表达Bcl-2的Toledo B-NHL细胞进行了比较，包括与不包括CdCl2启动子诱导，通过抗Bcl-2免疫印迹。Erk被视为负载控制。(E类)用10 nM pico处理24小时后，比较Bcl-2工程载体和空载体Toledo B-NHL细胞的TMRE染色。在独立实验中重复了结果。(F类)同样，用10 nM pico治疗48小时后，用TUNEL分析评估Bcl-2过度表达对细胞凋亡的影响。(G公司)通过抗Bax免疫沉淀物中的Bak检测到Toledo B-NHL细胞中由pico诱导的、Mek依赖的Bak–Bax物理复合物的形成。Pico治疗24小时。L=裂解液。在另外两个实验中也得到了类似的结果。
使用诱导载体过度表达Bcl-2也能有效抑制细胞凋亡(). 值得注意的是，尽管质粒编码的Bcl-2的基础过表达仅导致与内源性水平相比大约增加了两倍()，这足以防止在应用pico后24小时大多数细胞中TMRE染色的丢失(). 然而，当我们在pico治疗后48小时检测DNA片段时，凋亡抑制更明显()通过诱导载体表达实现更高水平的Bcl-2表达（大约是内源性水平的三倍）。
最后，我们发现Bak和Bax可以从DAG类似物处理的Toledo B细胞制备的裂解物中以复合物的形式免疫沉淀(). Bak和Bax的诱导聚集是Mek依赖性的。此外，这只在晚些时候才明显，在24到30小时之间显著增加（数据未显示）。这些研究表明，DAG类似物诱导的RasGRP-Erk信号转导导致Bim激活，随后Bak/Bax激活和凋亡，这一过程可以通过适度过度表达Bcl-2来拮抗。
DAG类似物治疗后，我们没有重复观察到p38或Jnk MAP激酶的激活(补充图S1). 我们也没有观察到DAG类似物处理对使用亚细胞分离方法的Bim膜结合的实质性影响。Bim仅与微微刺激和非刺激细胞中的微粒分数相关(补充图S2). 最后，我们发现小部分Bim和Bcl-2可以从Toledo B-NHL裂解物中共沉淀，但这种物理结合的程度不受pico诱导的Bim磷酸化的显著影响(补充图S3).
DAG类似物诱导Toledo B细胞凋亡需要延长RasGRP-Erk信号
刺激Toledo B细胞凋亡是一个缓慢的过程。例如，尽管使用10 nM微微的剂量，Bim在2至4小时内被完全磷酸化，但Bak–Bax复合物的形成在24至30小时时更加明显。我们推断，新暴露于DAG类似物的Toledo细胞可能不会无可挽回地发生凋亡，而细胞活性可能会通过在中期阻断RasGRP-Erk信号而得到挽救。这种信号中断实验可能提供有关凋亡程序执行缓慢的有用信息。
在初步实验中，我们将Toledo细胞在pico中单独培养4天，或另外与U0126或Bisindolylmaleimide I一起培养4天。对细胞进行计数，通过反复离心从新鲜培养基中洗去药物，然后重新计数(). 在无药物条件下额外培养4天后，再次对细胞进行计数。显微镜观察证实，未经处理的细胞在第一个培养期增加了约四倍，而经皮考处理的细胞发生了凋亡。在第一个4天与pico的孵育期内，Bisindolylmalemide I的存在阻止了凋亡细胞的出现，并且这种处理的细胞在第二个培养期内增加了约四倍。去除pico和U0126后的细胞增殖不太稳定。然而，根据显微镜观察，U0126完全抑制了细胞凋亡。总之，这些研究表明，pico可以被清除出细胞，抑制剂保护细胞的活性，而不是简单地抑制凋亡程序的执行。
根据初步实验的结果，我们用10 nM pico单独处理Toledo细胞9小时。在细胞清洗和进一步培养后，于31小时进行TMRE染色以评估细胞活力。该实验表明，与在DAG类似物中持续培养的细胞相比，大多数细胞在暴露于pico后9小时后可从凋亡反应中转移(). 在pico处理8小时后添加Bisindolylmalemide I对避免TMRE染色丢失也非常有效，事实上，与在pico前添加时一样有效。
在另一种信号阻断方法中，我们用10 nM pico处理Toledo细胞，然后在不同时间点添加Mek抑制剂，然后在30小时后进行TMRE染色(). 同样，当Erk的DAG类似物信号在中间阶段中断时，TMRE染色检测到的凋亡反应得到了实质性的消除。在本实验中，我们分析了不同时期的微微氧暴露后，无论是否最后30分钟暴露于Mek抑制剂U0126，Erk和Bim的磷酸化(). 这些分析证实了Erk、BimEL和BimL在pico处理后的后期仍然保持磷酸化。重要的是，在任何时候测试时，这两种蛋白质在Mek抑制后都会迅速去磷酸化。总之，这些实验表明DAG类似物诱导Toledo B-NHL细胞死亡需要持续的信号传导。
B细胞RasGRP-Erk-Bim信号转导的普遍性
我们检测了其他B细胞，以比较它们对DAG类似物的反应。从小鼠脾脏分离的B细胞显示出BimEL和BimL的pico诱导的Mek依赖性磷酸化(). 缺乏RasGRP1和RasGRP3的双突变细胞在pico处理后未表现出BimEL或BimL磷酸化(). 原代B细胞在过夜培养过程中表现出显著的自发死亡，排除了对诱导凋亡的研究。
Ramos B细胞在BCR和RasGRP信号方面具有良好的特征[6,24]. 我们发现，用抗IgM抗体刺激可诱导BimEL和BimL磷酸化(). 用抗IgM治疗也会导致细胞凋亡，这可以通过大量未被TMRE染色的细胞的出现来证明(). 重要的是，Mek抑制剂U0126基本上阻断了这种作用。相比之下，RL细胞没有出现凋亡迹象(). 我们确定了两个可能解释RL细胞对DAG类似物相对抗性的因素。首先，微刺激RL细胞导致BimEL丢失(). 通过使用Mek抑制剂U0126治疗，该过程被逆转()或蛋白体抑制剂MG132(). 第二，RL细胞表达相对较高水平的Bcl-2，这与预期的携带T（14:18）染色体重排的B-NHL细胞系一样(). 其他B细胞系（如Pfeiffer、C1R和RPMI7666）的微微反应研究较少。它们表现出pico-induced BimEL和BimL磷酸化，BimEL降解，并且不发生凋亡（数据未显示）。
讨论
在这里，我们表明DAG类似物诱导B细胞中RasGRP的激活导致Bim在抗凋亡和促凋亡位点上的Erk依赖性磷酸化。在Toledo B-NHL细胞中，RasGRP介导的Bim激活导致广泛的凋亡。来自恶性血液病（包括B-NHL）的细胞系被认为代表在血细胞发育的不同阶段被阻止的克隆细胞群[29]. 从表面标记、BCR基因结构和IgG可变区序列分析来看，Toledo B-NHL细胞似乎代表转化的生发中心B细胞[30]. 生殖中心B细胞通常通过体细胞突变产生新的BCR物种，其中一些B细胞在一个被认为需要长时间接触BCR抗原的过程中被删除[31–34].
我们的研究表明，DAG类似物诱导Toledo B-NHL细胞凋亡需要激活PKC/RasGRP介导的Ras-Erk信号。它还涉及以前参与淋巴细胞凋亡控制的Bcl-2家族成员。Bim下调研究和Bcl-2过表达研究提供了令人信服的连接PKC/RasGRP-Erk和Bcl-1家族调控系统的功能数据。RasGRP-Erk信号传导的药理抑制阻断Bim磷酸化、Bak/Bax物理结合、TMRE染色丢失、DNA片段化、PARP-1裂解和凋亡的形态学迹象。虽然我们不能排除抑制剂和siRNA试剂的非靶向效应，但这些事件在单独使用pico治疗后的顺序或多或少符合线性路径(). 由于RasGRP信号将BCR信号连接到Ras和重要的下游效应系统，我们认为Toledo B-NHL的DAG类似物反应可能为正常生发B细胞中BCR介导的负选择提供了见解。
拟议的信号通路。将蛋白激酶C（PKC）和RasGRP1/3与Toledo B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）细胞凋亡联系起来的拟议信号通路。单头箭头表示积极的调节作用，而双头箭头表示Bcl-2家族成员之间的相互调节作用和物理联系。指出了Mek抑制剂（U0126）和pan-PKC抑制剂（Bis）的作用点。
我们之前对小鼠原代B细胞的研究表明，RasGRP1和RasGRP3的主要功能是促进BCR诱导的B细胞增殖[21,22]. 然而，这种增殖在很大程度上依赖于共刺激，众所周知，共刺激会对BCR信号的增殖反应和凋亡反应产生不同的影响。我们目前对小鼠B细胞和各种人类B细胞系的研究表明，RasGRP和Mek依赖的促凋亡Bim磷酸化可能在B细胞中普遍存在。重要的是，我们对Ramos B细胞的实验表明，Mek依赖性凋亡并非Toledo B-NHL独有，内源性DAG生成系统也可以促进这一途径。此前已有文献证明，BCR刺激的生发中心衍生B细胞系（包括Ramos）凋亡过程中BimL磷酸化[35]. 这些早期的研究还得出结论，Erk而不是Jnk对Bim具有正向调节作用。泛素介导的BimEL降解、抗凋亡蛋白的表达和其他生物化学途径的活性可能阻止DAG-和DAG-类似物在大多数B细胞类型中诱导的凋亡的执行。
磷酸化调节Bim功能的机制尚不清楚。普遍认为BimEL特异性位点Ser69的Erk依赖性磷酸化可导致多种细胞类型的泛素依赖性降解，这显然是一种抗凋亡反应。然而，在神经元中，该位点上的磷酸化被提议通过允许BimEL招募Pin1（一种肽基丙基异构酶）来激活蛋白质。Pin-1被认为通过催化作用于其他蛋白质而起到细胞凋亡效应器的作用[36]. 此外，蛋白激酶Jnk可磷酸化BimL中的Ser44、Thr56和Ser58，BimEL中也存在这些位点(). 最近，一项对Bim非磷酸化突变小鼠的精细遗传分析证实，Bim磷酸化既可以是抗凋亡的，也可以是促凋亡的[37]. 不能进行泛素介导的BimEL降解的小鼠表现出Bim表达增加和凋亡增加。相反，Bim突变小鼠在人体BimL中编码的丙氨酸替代物相当于Thr56()细胞凋亡减少，这归因于Bim与Bcl-2结合减少。重要的是，Erk和Jnk都参与了该位点的促凋亡磷酸化[37].
当前工作的一个关键方面是Erk激活、BimL磷酸化和Toledo B-NHL细胞凋亡之间的密切关系，这表明Erk可以直接激活B细胞中的Bim。以前对BimL截短型的研究得出结论，Erk不是BimL激酶[38]. 然而，我们的体外磷酸化实验使用了免疫沉淀的内源性Bim蛋白和全长重组BimL，清楚地将Erk活性与促凋亡的Bim磷酸化位点联系起来。然而，我们无法记录Bim磷酸化对Bim-Bcl-2关联程度的任何一致影响。这一负面结果可能反映了我们共沉淀分析的技术局限性。或者，Bim的促凋亡磷酸化可能通过一些其他方式增加其活性，例如招募非Bcl-2家族蛋白[35]. 最后，应该注意到BimEL和BimL共有的三个共有Erk磷酸化位点侧翼Lys112，这是BimEL中一个潜在的泛素化位点(). 因此，促凋亡磷酸化可能会对抗BimEL降解，此外，Bim还可能通过一种尚待确定的机制激活Bim，这种机制可以在BimL中表现出来。
诱导Toledo B-NHL细胞凋亡的一个显著特征是其显著依赖于持续的RasGRP-Erk信号和Bim磷酸化。这一发现导致了一个关于B细胞缺失调控的新假说。具体来说，Bcl-2蛋白家族可能充当一个分子计时器，使B细胞能够测量BCR信号的持续时间。强自活性BCR物种将以稳定的方式与抗原结合，并引发持续的RasGRP-Erk活性和持续高水平的活化磷酸化抗体。虽然Bim仍处于活性促凋亡状态，但抗凋亡蛋白（如Bcl-2）与促凋亡蛋白（例如Bak和Bax）的解离将缓慢进行，这受到它们高度相互亲和性的限制。如果有足够的时间，活性Bim会滴定出来并以某种方式中和Bcl-2及其类似物，从而使Bak和Bax重新排序并破坏线粒体膜的完整性。自我反应较弱、低亲和力的BCR物种会暂时激活RasGRP-Erk信号传导至Bim。受到Bim去磷酸化活动的反作用，这些信号将无法为Bcl-2家族成员重组提供机会之窗。
以前，BCR介导的未成熟B细胞系WEHI-231的凋亡通过适度的RasGRP1过度表达而增强[39]. 在这个系统中，发现对凋亡的影响与Erk的信号转导无关。相反，RasGRP1表达对核因子-κB和Bcl-Xl水平的影响已被证实。需要进一步研究以确定B细胞中Erk依赖性和Erk非依赖性凋亡信号的普遍性和潜在机制。
我们的结果为天然苔藓抑制素-1及其合成类似物pico在基于RasGRP的分析中的等效性提供了进一步的证据。Bryostatin-1是一种具有抗癌细胞作用的化合物，在临床试验中已被评估为抗癌药物。其作用已被解释为对PKC激活和下调的影响。这里介绍的工作概述了DAG模拟作用的更详细机制()可能用于治疗B细胞肿瘤的一个子集。还应考虑将DAG类似物与Bcl-2拮抗剂和蛋白体抑制剂结合的可能性。
致谢
这项工作得到了加拿大卫生研究院、艾伯塔省癌症委员会和艾伯塔传统医学研究基金会（J.C.S.）、国家卫生研究院院内研究计划、国家癌症中心、，癌症研究中心和美国国立卫生研究院的资助（CA31845）。我们感谢H.M.Hu提供了siRNA载体，感谢C.Bcl-2表达载体。我们感谢Michele Barry、Raymond Lai、Hanne Ostergaard、Ing Swie Goping、Troy Baldwin和Eileen White提出的有用建议。
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