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美国病理学杂志。2009年7月；175(1): 148–160.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2009.080837
预防性维修识别码：PMC2708802型
PMID：19541937

透明质酸对TGFβ1依赖性肌成纤维细胞分化的调节

杰森·韦伯,罗伯特·H·詹金斯,索马·梅兰,亚历德·菲利普斯、和罗伯特·斯特德曼
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肌成纤维细胞是一种收缩性细胞，以α-平滑肌肌动蛋白的表达为特征，介导伤口闭合和富含胶原蛋白的瘢痕的形成。长期以来，它们在肺、肝和肾等器官中的存在被认为是进行性纤维化的标志。转化生长因子β1-成纤维细胞的驱动分化是肌纤维细胞的主要来源，最近的数据表明透明质酸是这一过程的主要调节剂。本研究更详细地研究了这种分化机制。转化生长因子β1-透明质酸合成的抑制对抗了肌纤维母细胞表型的依赖性分化，证实透明质酸对分化是必要的。然而，仅仅向成纤维细胞中添加透明质酸并不能再现这种反应，因为结果涉及到透明质酸蛋白以及细胞内的大分子组装从头开始的透明质酸在这一过程中至关重要。我们先前认为，在肌纤维母细胞分化过程中，脂质-纤维成分发生了重新定位。本研究表明，透明质酸受体CD44、透明质酸酶HYAL 2和转化生长因子β1-受体ALK5全部从筏位重新定位到非筏位，而外源性透明质酸的加入逆转了这一点。这些数据强调了内源性透明质酸在肌纤维母细胞分化中的作用。虽然透明质酸合成对分化至关重要，也是必要的，但外源性提供的透明质酸可对抗分化，突显出透明质酸在此类细胞命运过程中的病理作用。

纤维化可被视为创伤愈合紊乱，其中存在进展而非疤痕消退。细胞外基质的过度积累，导致正常组织结构和功能的破坏，这是由成纤维细胞的一种特殊表型——肌成纤维细胞介导的。这些是收缩细胞，以α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达为特征。1它们介导伤口闭合和富含胶原蛋白的疤痕的形成，它们在肺、肝和肾等器官中的存在长期以来被认为是进展性疾病的标志。2,三细胞因子转化生长因子-β1（转化生长因子β1)被认为是伤口愈合和纤维化进展的介体。三,4,5,6,7,8,9此外，为了直接影响细胞外基质的周转，它上调成纤维细胞中的α-SMA在体外和体内并促使成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。三,10,11

作为肌成纤维细胞分化的结果，最近的研究12描述了透明质酸（HA）在分化细胞周围的细胞周基质中的积聚。HA是一种普遍存在的结缔组织糖胺聚糖，由HA合成酶（HAS）合成，已分离出三种脊椎动物基因并对其进行了表征：第1阶段，第2阶段、和HAS3型.13,14在正常组织中，HA在维持细胞外基质稳定性和组织水合作用中发挥作用。然而，HA及其细胞表面受体（CD44）的表达增加已在许多与器官功能障碍相关的纤维化疾病中检测到。15,16,17,18,19HA通常作为一种高分子量分子存在，参与体内平衡、基质稳定性和组织水合作用。它在调节细胞粘附、迁移、分化和增殖中起着重要作用，15,20,21,22,23,24,25,26,27,28因此与肿瘤生长和转移、组织重塑和伤口愈合密切相关。HA还参与调节细胞对TGFβ的反应1例如，上皮细胞改变了TGFβ1HA与其受体CD44相互作用后的信号传导。25,26

我们之前已经证明，成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化与内源性HA的积累和代谢的主要变化有关。12随后，HA的这种积累被证明有助于TGFβ1-肌成纤维细胞的诱导分化及转化生长因子β的影响1关于扩散。29,30在本报告中，HA对TGFβ影响的机制1-研究表明，依赖性反应依赖于HA合成。然而，向成纤维细胞添加外源HA可拮抗细胞对TGFβ的反应1表明这些作用不是在TGFβ水平上发生的1-受体。此外，外源性HA的添加并没有完全模拟内源性HA的合成，在TGFβ的控制中，强烈暗示HA的组装，而不仅仅是HA的存在1-驱动差异化。

材料和方法

试剂

除非另有说明，否则所有通用试剂均从英国多塞特郡普尔Sigma-Aldrich购买。对于细胞的外源性添加（批号F1750762），透明质酸以冷冻干燥的白色粉末的形式由日本Kabushiki Kaisha的Denki Kagaku Kogyo提供，并按照前面所述进行稀释和制备。25

人肺成纤维细胞的培养

原代人肺成纤维细胞（AG02262）购自Coriell Cell Repositories（新泽西州Coriell医学研究所）。细胞培养在1:1（v/v）混合的Dulbecco改良Eagle's培养基中：含有2 mmol/L的F-12我-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，补充10%（v/v）胎牛血清（英国东苏塞克斯郡Biosera）。细胞（直到第10代）在5%CO中保持在37°C2增湿的大气。实验前，所有细胞在无血清培养基中生长48小时，以实现细胞周期同步。

肌纤维母细胞分化

TGFβ刺激成纤维细胞分化为肌成纤维细胞1（10 ng/ml）72小时，然后在5%CO中保持在37°C2增湿的大气。然后用pH 7.3的无钙/无镁PBS彻底清洗产生的肌成纤维细胞。除非另有说明，否则所有实验均在无血清培养基中进行，以避免血清因素的任何影响。

4-甲基伞形酮31和外源性HA（如前所述制备25,26与TGFβ同时添加到成纤维细胞中1-4-甲基伞形酮的最终浓度为0.5 mmol/L。外源HA（MW 1.73×106Da）的最终浓度为25μg/ml。Alk-5特异性抑制剂SB431542用于抑制TGFβ1信号传导，Erk特异性抑制剂PD98059用于抑制丝裂原活化激酶信号传导。使用时，这两种药物的最终浓度均为10μmol/L。

HA浓度的测定

细胞在35 mm培养皿中生长汇合，并根据制造商的说明（透明质酸测试试剂盒；英国彼得堡Corgenix），使用商用酶联HA结合蛋白测定法测定细胞培养上清液中的HA浓度。

HA的代谢标记

为了进行代谢放射性标记HA，将在T75培养瓶中培养的融合单层细胞培养在含有20μCi/ml D的无血清培养基中-[三H] -氨基葡萄糖盐酸盐（GE Health care，Bucks，UK）24小时。取出培养基，用PBS洗涤细胞。将培养基和洗涤液结合形成条件培养基提取物。然后用等体积的200μg/ml XIV型蛋白酶（Sigma-Aldrich）处理条件培养基提取物24小时。剩余的HA，即表面/CD44相关HA和基质相关HA，通过用100μg/ml蛋白酶培养细胞24小时一起去除。将其倾析并指定为细胞提取物。

将每种提取物通过用8 mol/L尿素缓冲液平衡的二乙氨基乙基纤维素-Sephacel离子交换柱（GE Health care）。用几层体积为8 mol/L的尿素缓冲液清洗色谱柱，这样可以去除任何低分子量肽和未合并的放射性标记。放射性标记HA在含有0.3 mol/L NaCl的8 mol/L尿素缓冲液中洗脱。将每个提取物分为两部分，并通过在50μg/ml未标记HA、肝素和硫酸软骨素作为共沉淀剂的情况下，在95%（v/v）乙醇中用三倍体积的1%（w/v）醋酸钾孵育沉淀HA，在4°C下过夜。然后在500×克持续10分钟。倒出上清液，在6 ml 95%（v/v）乙醇中清洗颗粒，然后再次在500×克持续10分钟。去除上清液后，在Sephacryl S-500柱（150 cm×0.6 cm）（GE Health care）上通过尺寸排除色谱法对每种提取物的前半部分进行分析，该柱与4 M/L胍缓冲液平衡，流速2.4 ml/h（0.6 ml/分数）。每种提取物的后半部分用透明溶链霉菌透明质酸酶（ICN Pharmaceuticals Ltd，Hampshire，UK）（1U）在37°C下过夜。然后将提取物与200μl 4 mol/l胍缓冲液混合，并在同一个Sephacryl S-500色谱柱上用4 mol/l胍缓冲溶液平衡，如上所述通过尺寸排除色谱进行分析。要生成[三H] -HA洗脱曲线，从未处理提取物的下半部分中减去每个提取物的下半部中的透明质酸酶抗性计数，并校正稀释系数。

胶原蛋白的分离

汇合的单层细胞在T25培养瓶中生长，并在无血清条件下滞留48小时。然后根据需要对其进行刺激，并用20μCi/ml同时标记[三H] -脯氨酸，持续72小时。通过倾析烧瓶收集上清液（条件培养基提取物）。在37°C下用4 ml提取缓冲液培养15分钟后提取细胞提取物：0.2%（v/v）triton X-100溶于25 mmol/L Tris-HCl，pH7.5含有蛋白酶抑制剂（盐酸苯甲脒，N个-乙基马来酰亚胺和苯基甲基磺酰氟）。然后将其收集起来，用另外2 ml提取缓冲液清洗烧瓶，并与细胞提取物结合。基质提取物在−20°C下用4 ml 4 mol/L胍在1%（v/v）triton X-100中的25 mmol/L Tris-HCl pH7.5中萃取过夜，其中含有蛋白酶抑制剂。收集提取物，并在室温下用另外的2ml洗涤烧瓶30分钟。将其与基质提取物结合并储存在−20°C下。

提取物纯化

通过离子交换色谱法在用10mmol/L Tris（pH 7.4）平衡的二乙基氨基乙基纤维素柱上纯化每种提取物。使用1 mmol/L NaCl从色谱柱中洗脱样品2在10mmol/L Tris（pH 7.4）中，然后对H进行透析2O过夜。通过在0.2 mol/L NH中平衡的PD10柱通过凝胶过滤进一步纯化条件培养基提取物、细胞提取物和基质提取物样品三HCO公司三收集2 ml组分。将背景水平以上可检测到放射性的部分聚集在一起，并记录体积。对每个样品的一半进行胶原酶消化以确认[三H] 脯氨酸掺入是胶原蛋白生成的准确测量，从未消化的提取物中减去每个提取物后半部分中的胶原酶抗性计数，得出胶原蛋白特异性掺入。

免疫细胞化学

α-SMA的间接免疫荧光鉴定和丝状肌动蛋白（F-actin）的可视化被用作肌纤维母细胞分化的确认。细胞在8孔permanox室载玻片（Nunc）中生长汇合，生长停滞48小时，然后在无血清条件下刺激长达7天。刺激后，将细胞固定在冷的1:1丙酮/甲醇中10分钟，然后在无钙/无镁PBS中彻底清洗。用1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）在hanks平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich）中在4°C下封闭细胞上的非特异性位点1小时。在HBSS中的0.1%（w/v）BSA中彻底清洗细胞。用适当的一级抗体培养细胞（表1）在室温或4°C下隔夜，在HBSS中的0.1%（w/v）BSA中稀释2小时。将细胞在HBSS中0.1%（w/v）BSA中反复洗涤，然后在室温下用异硫氰酸荧光素结合抗鼠IgG（DakoCytomation）孵育1小时，并用HBSS中的0.1%（w/v）BSA稀释。用0.1%（w/v）BSA在HBSS中对细胞进行广泛清洗，安装在Vectashield荧光贴装剂（Vecta Laboratories，Peterborough，UK）中，并在Leica Dialux×20荧光显微镜（Leica Microsystems Ltd，Milton Keynes，UK。

表1

免疫荧光初级抗体

抗体类别。不主机类型稀释
抗人波形蛋白（Dako细胞形成）M0725型鼠标单克隆IgG11:50
抗人细胞角蛋白（DakoCytomation）M0717号鼠标单克隆IgG11:50
抗人α-SM肌动蛋白（Sigma）A5691型鼠标单克隆IgG2a个1:30
反人类HYAL2是加州大学旧金山分校R Stern博士的一份礼物不适用兔子多克隆1:200
抗人CD44（Calbiochem，Merck Biosciences Ltd.，英国诺丁汉）老鼠单克隆IgG2亿1:200

细胞蛋白提取

用PBS冲洗汇合的单层细胞。然后使用RIPA裂解缓冲液（德国圣克鲁斯生物技术公司）对细胞进行裂解；将1%（v/v）蛋白酶抑制剂鸡尾酒、新制备的1%（vv/v的）苯甲基磺酰氟和1%（v/v）原钒酸钠加入其中，在冰上孵育15分钟。样品被刮除、收集并在2500×克在4°C下保持10分钟。收集上清液并将其储存在−80°C下，直至通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析。

蛋白质分离

将相当于30μg蛋白质的每个样品（蛋白质浓度通过Bio-Rad蛋白质测定法测定，Bio-Rad Laboratories）与该体积的一半的3×还原PAGE加载缓冲液混合，并在95°C下孵育5分钟。使用Bio-Rad Mini-PROTEAN仪器进行SDS-PAGE。将30微克蛋白质样品加载到含有0.1%十二烷基硫酸钠的12%聚丙烯酰胺凝胶上（表2）在150 V的流动缓冲液中进行电泳，直到溴酚蓝跟踪染料向下迁移90%的凝胶。

表2

半定量PCR引物

底漆顺序产品规模（bp）循环次数升序编号
β-肌动蛋白
 感觉5′-CCTTCCCTGGGCATGGAGTCCT-3′20425NM_001101号
 反义5′-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3′
ED-A纤维连接蛋白
 感觉5′-ACATTGATCGCCCTAAA-3′27425NM_212482号
 反义5′-ATAGCTGTGGACTGGGT-3′

蛋白质转移和检测

通过Western blot，使用BioRad Mini-blot II仪器（Bio-Rad实验室）将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（GE Health care）中，在150 V的转移缓冲液中冰上90分钟。用5%（w/v）脱脂奶粉和0.01%（v/v）吐温-20在Tris缓冲盐水（TBS）中孵育1小时，阻断硝化纤维素膜以防止非特异性结合。将硝化纤维素膜与适当的一级抗体（抗人磷酸-Smad 2[Ser 465/467]、抗人磷酸S-mad3[Ser423/425]或抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Abcam plc，英国剑桥）孵育，作为负荷控制。用0.01%（v/v）吐温-20在TBS中反复清洗硝化纤维素膜，并用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育，必要时稀释，5%（w/v）脱脂奶粉，0.01%（v/v）吐温-20在室温下孵育2小时。根据制造商的协议，ECL-Plus（GE Health care）对抗体结合进行可视化。通过密度测定法（Chemi-Doc；Bio-Rad）量化可视化条带的强度，并针对每个样品的甘油醛-3-磷酸脱氢酶内控条带的表达进行校正。

荧光素异硫氰酸-卟啉染色

刺激后，在室温下将细胞固定在4%（w/v）多聚甲醛中15分钟。然后将细胞晾干，然后在室温下在PBS中0.1%（v/v）吐温-20中渗透5分钟。在室温下用5%（w/v）BSA在PBS中封闭细胞上的非特异性位点20分钟。在PBS中的0.1%（w/v）BSA中彻底清洗细胞。细胞与异硫氰酸荧光素-共轭物（Fluka，Sigma-Aldrich）孵育，在室温下用PBS中0.1%（w/v）BS A稀释，避光1小时。细胞在PBS中0.1%（w/v）BSA中反复洗涤，然后安装在Vectashield荧光贴片剂中，并在Leica Dialux 20荧光显微镜上进行紫外线照射下的检查。

RNA提取

汇合的单层细胞在6孔板中培养。用PBS清洗细胞单层，然后用1 ml Tri-Reagent（Sigma-Aldrich）溶解细胞。向样品中添加氯仿（200μl），并通过倒置搅拌直至完全乳化。然后将样品在4°C下培养5分钟，以分离水相和酚相，然后在16000×克在4°C下保持20分钟。去除水层并与等量的冰镇异丙醇混合。将混合物在4°C下培养24小时，然后在16000×克在4°C下保持20分钟。去除上清液，用70%（v/v）乙醇通过倒置洗涤颗粒，然后在16000×克在4°C下保持20分钟。将RNA颗粒在室温下风干，然后溶解在20μl H中2O。

反向转录

采用随机引物法进行逆转录（RT）。每次反应的最终体积为20μl，其中包含1μg RNA样品、2μl 10×RT随机引物、2μl 10×RT缓冲液、0.8μl 100 mmol/l dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）（混合核苷酸：dATP、dCTP、dGTP和dTTP）、1μl Multiscribe逆转录酶和1μl RNase抑制剂。所有使用的试剂均作为高容量cDNA逆转录酶试剂盒（Applied Biosystems）提供。RT使用应用生物系统公司的“Gene Amp PCR System 9700”热循环器进行。用H制备阴性对照（−RT）2O替代Multiscribe逆转录酶。将溶液在25°C下培养10分钟，使随机六聚体引物退火到RNA。然后在四个dNTP存在的情况下，使用逆转录酶将溶液加热到37°C 2小时，延长引物，从而生成cDNA。最后的加热步骤是将溶液加热到85°C，持续5秒。产生的单链互补DNA（cDNA）储存在−20°C。

半定量PCR

PCR的最终体积为每反应50μl，包含2μl cDNA，正反义引物各20 pmol（表2）、3μl 10 mmol/l dNTPs（Sigma-Aldrich）、5μl PCR缓冲液（10×）（Applied Biosystems）、0.25μl（5 U/μl）AmpliTaq Gold（AppliedBiosystemas）和37.25μl H2O.用H制备阴性对照（−PCR）2O取代了cDNA。PCR扩增在GeneAmp PCR系统9700 Thermocycler（Applied Biosystems）中进行。将溶液加热至94°C 2分钟以激活Taq聚合酶，然后进行必要的循环次数（表2）94°C持续30秒，55°C持续32秒，72°C持续1分钟，然后72°C再持续15分钟。

在含有0.5 mg/ml溴化乙锭的TAE缓冲液中，通过2%（w/v）琼脂糖凝胶（超纯琼脂糖，GIBCO）电泳分离产物。使用Chemi-Doc凝胶文档系统（英国Hemel Hempstead生物实验室）在紫外光下对其进行可视化和拍照。

定量聚合酶链反应

定量（Q）PCR在每次反应20μl的最终体积中进行，包含1μl cDNA、10μl TaqMan Fast Universal Master Mix（20×）（Applied Biosystems）、8μl H2O、 和1μl TaqMan基因表达检测引物和探针混合物（Applied Biosystems）。用H制备阴性对照（−PCR）2O取代了cDNA。QPCR扩增在7900HT快速实时PCR系统热循环器（Applied Biosystems）中进行。使用95°C循环1s，60°C循环20s，共40个循环进行扩增。

比较C类T型方法用于基因表达的相对定量。这个C类T型从目标基因中减去标准参考基因（核糖体RNA）的（扩增在扩增曲线线性范围内的阈值周期）C类T型以获得ΔC类T型.平均ΔC类T型然后计算类似样本的值。计算实验样品中靶基因的表达相对于对照样品中的表达：

方程式M1

式中ΔC类T型（1） 是平均ΔC类T型实验样品的计算值，以及ΔC类T型（2） 是平均ΔC类T型为对照样品计算的值。使用Applied Biosystems UK Ltd.的RQ Manager软件分析数据。

成纤维细胞和肌成纤维细胞的siRNA转染

根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）对成纤维细胞进行特异性siRNA寡核苷酸（HAS2、Smad2和Smad3）的瞬时转染。简单地说，将2μl转染试剂稀释在98μl Opti-MEM还原生长培养基（Gibco）中，并在室温下培养5分钟。siRNA寡核苷酸在Opti-MEM还原生长培养基中稀释，最终浓度为1.2μmol/L，总体积为100μL。然后将转染试剂混合物和siRNA混合物合并，并在室温下再培养20分钟。将新形成的转染复合物（200μl）分散到12孔培养板的空孔中。至每口井，9×104然后添加细胞，使每个孔中的总体积为1.2 ml，最终siRNA浓度为100 nmol/L。然后轻轻摇动平板以确保复合物充分混合，然后在37°C下与5%CO孵育224小时。在此之后，抽吸培养基并用无血清Dulbecco改良的Eagle's培养基替换：不含抗生素的F12生长培养基。在37°C下与5%CO孵育2在细胞刺激之前，只要有必要获得最大的转染效率。使用针对每个靶基因的特异性引物，通过QPCR确认每个使用的siRNA敲除成功。

转化生长因子β的定位1受体26

细胞生长到大约70%的汇合处，然后在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基替换培养基，无血清培养液中含有TGFβ1（10 ng/ml），或含有TGFβ的无血清培养基1（10 ng/ml），HA（25μg/ml）72小时。用冰镇PBS清洗单层两次。然后将两个融合皿中的成纤维细胞刮入2 ml 500 mmol/L碳酸钠中，pH 11.0。均质是通过10次紧密的Dounce均质器敲击来完成的，然后是三次20秒的超声波破碎机（Soniprep 150；Fisher Scientific），以破坏细胞膜。通过添加在（2）中制备的2 ml 90%蔗糖，将匀浆调整为45%蔗糖-[N个-吗啉]乙磺酸缓冲盐水；由25 mmol/L 2制备-[N个-吗啉]乙磺酸，pH 6.5，含0.15 M/L NaCl），置于超离心管底部。不连续的蔗糖梯度（4 ml 35%蔗糖，3 ml 5%蔗糖，均在2-[N个-吗啉]），并在SW40 TI转子中以39000 rpm离心20小时（加利福尼亚州帕洛阿尔托Beckman Instruments）。在5%至35%的蔗糖界面处观察到光散射带。从试管顶部收集了11个1 ml组分。

膜组分的Western Blot分析

将60微升的每个级分与15μl的5×还原性SDS缓冲液混合，并在95°C下煮沸5分钟，然后加载到10%SDS-PAGE凝胶上。在150伏的还原条件下进行电泳1小时，然后将分离的蛋白质在150伏、90分钟的时间内转移到硝化纤维素膜上（英国白金汉郡GE Health care），如上所述。用含5%脱脂奶粉的TBS封闭膜1小时，然后与第一抗体（抗TGFβ受体1，Santa Cruz Biotechnology Inc，Germany，在含5%脱脂奶粉的TBS中以1:200稀释）在4°C下孵育过夜。随后用含有1%吐温的TBS清洗印迹，然后在室温下与二级抗体孵育1小时（抗兔IgG-辣根过氧化物酶，在含有5%脱脂奶粉的TBS中稀释1:10000）。根据制造商的说明，使用增强化学发光（GE Health care）对蛋白质进行可视化。

利用小窝蛋白-1和EEA-1的存在来确定该组分分别代表脂筏蛋白还是非脂筏蛋白。蛋白质转移到硝化纤维素膜后，用含有5%脱脂奶粉的TBS封闭膜1小时，然后在4°C下与一级抗体（抗小窝蛋白1或抗EEA1，在含有5%BSA的TBS中稀释1:2500；马萨诸塞州丹佛市的细胞信号技术）孵育过夜。随后用含有1%吐温的TBS清洗斑点，然后在室温下与二级抗体孵育1小时（抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，在含有5%脱脂奶粉的TBS中1:10000稀释；德国圣克鲁斯生物技术公司）。根据制造商的说明，使用增强化学发光法（GE Health Care）对蛋白质进行可视化，并通过密度测定法（Chemi-Doc；BioRad）进行量化。数据表示为每个组分中该实验总TGFβ受体的百分比。

统计分析

成对学生的吨-只对一个变量的实验进行了测试。对于多变量实验，使用单向方差分析确定统计差异，然后使用Tukey的Honest显著差异（HSD）方法对数据进行配对。应用的Tukey HSD方法包括多重测试修正和不平衡设计调整。结果表示为平均值±SE。所有数据均使用软件（SPSS 14.0 Chicago，IL）和P（P）<0.05被认为是显著的。

结果

转化生长因子β1-肌成纤维细胞表型的诱导

使用TGFβ1触发成纤维细胞分化导致α-SMA mRNA的时间依赖性诱导，在48到72小时左右达到峰值（图1A）伴随着α-SMA蛋白的表达增加，其并入肌动蛋白应力纤维，以及细胞形态的改变（图1、B和C）通过转染成纤维细胞Smad2或3 siRNA，然后将其与TGFβ孵育，表明表型变化的诱导与Smad信号通路有关1与干扰对照组的转染相比，Smad2 siRNA存在时α-SMA水平降低了80%，Smad3 siRNA存在下降低了60%（图2，A–D）.

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肌成纤维细胞表型的诱导。成纤维细胞生长到接近汇合处，然后在无血清培养基中生长48小时。抽吸培养基并用新鲜无血清培养基（对照）或含有10 ng/ml TGFβ的无血清培养液替换1持续时间长达72小时。答：mRNA的提取方法如材料和方法QPCR定量α-SMA表达。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，如材料和方法结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用配对学生的吨-检验和统计显著性被视为P（P）< 0.05.B类：72小时后固定细胞，并对波形蛋白或α-SMA进行免疫染色。结果代表了四个单独的实验。抄送：将72小时后固定的细胞在PBS中的0.1%（v/v）吐温-20中透化，然后用异硫氰酸荧光素鬼笔肽染色F-肌动蛋白，如所述。结果代表了四个单独的实验。

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肌纤维母细胞的诱导依赖于Smad相关的TGFβ信号。在无血清培养基中用Smad2、Smad3或打乱对照的特异性siRNA转染成纤维细胞48小时。改变培养基，用TGFβ刺激细胞1（10纳克/毫升）持续72小时。mRNA的提取方法如材料和方法.转染Smad 2特异性siRNA后(A类和B类)或Smad 3特异性siRNA(C类和D类)，Smad 2的表达(A类)、Smad 3(C类)和α-SMA(B类和D类)通过QPCR进行量化。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析检验进行统计分析(P（P）<0.001），然后进行Tukey的HSD事后测试，统计显著性为P（P）< 0.05.

与细胞表型分化相关的是I型胶原的表达增加（图3A），纤维连接蛋白的EDA亚型（图3B）和HA（图3、C和D）.

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细胞外基质成分的表型特异性变化。成纤维细胞生长到接近汇合处，然后在无血清培养基中生长48小时。抽吸培养基并用新鲜无血清培养基（对照）或含有10 ng/ml TGFβ的无血清培养液替换1持续时间长达72小时。答：对于胶原蛋白定量，细胞同时用20μCi/ml进行代谢标记[三H] -按说明纯化的每种提取物中的脯氨酸和胶原蛋白。结果表示为在无血清条件下（对照）或在10 ng/ml TGFβ存在下72小时后组合提取物的总标记胶原蛋白的平均值±SEM（三个独立实验）1使用配对学生的吨-测试和统计显著性为P（P）< 0.05.B类：在无血清培养基（对照）或含有10 ng/ml TGFβ的无血清培养液中72小时后从细胞中提取mRNA1如中所述材料和方法对纤维连接蛋白的ED-A亚型进行RT-PCR。将产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并在溴化乙锭染色后在UV下观察。结果显示了四个单独实验的产物。存在或不存在（对照）10 ng/ml TGFβ的细胞培养基中的HA1通过酶联免疫吸附测定进行分析，时间长达72小时(C类)（使用配对的Student’st吨-检验和统计显著性被视为P（P）<0.05）或代谢标记和凝胶过滤色谱法(D类)如上所述。

透明质酸合成对肌纤维母细胞分化至关重要

在以前的研究中，透明质酸的积累与肌纤维母细胞分化的启动之间存在联系。12,29,30为了更详细地研究HA合成在这一过程中是否重要，使用4-mU耗尽UDP-葡萄糖醛酸的细胞质池，UDP-糖醛酸是HA链延长所必需的，31并使用诱导型HAS2亚型的siRNA来抑制合成酶的产生。HA酶联免疫吸附试验用于确认HA抑制（图4A），在0.5 mmol/L时效果最佳（较高浓度具有细胞毒性，数据未显示）。在与TGFβ孵育的成纤维细胞中添加4-mU后，α-SMA诱导受到浓度依赖性抑制1 （图4B）0.5 mmol/L及以上时达到最大值（>95%），表明HA是诱导肌纤维母细胞表型的重要因素。然而，这不是通过对R-Smads的影响介导的，因为4-mU对Smad2或Smad3的磷酸化没有影响（图4C）使用HAS2的siRNA来确认抑制剂的作用。QPCR证实了HAS2 siRNA的敲除作用（图4D）100 nmol/L，击倒率在50%至70%之间。这与α-SMA的伴随减少有关（图4E）确认HA合成和分化之间的联系。

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抑制HA链延伸对分化的影响。成纤维细胞生长停滞48小时。然后更换培养基，在没有（对照）或存在TGFβ的情况下继续培养1持续72小时。如图所示，添加不同浓度的HA链延伸抑制剂4-mU（或载体0.1%二甲基亚砜）。答：TGFβ抑制的剂量反应1-4 mU刺激HA合成。结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析检验进行统计分析(P（P）<0.001），然后进行Tukey的HSD事后测试，统计显著性为P（P）< 0.05.B类：通过QPCR评估4-mU的最佳剂量对α-SMA表达的影响。使用核糖体RNA表达作为内源性对照，并相对于对照样品测定基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析检验进行统计分析(P（P）<0.001），然后进行Tukey的HSD死后检验，统计显著性为P（P）< 0.05.抄送：4-mU的最佳剂量对pSmad 2和3诱导的影响。细胞生长停滞48小时，然后与TGFβ一起或不与TGFβ一起孵育1有无4-mU持续60分钟。提取细胞蛋白，并对磷酸化Smads 2和3进行SDS-PAGE和Western blotting，如所述。结果代表了四个独立实验。D类和电子邮箱：成纤维细胞在无血清培养基中转染HAS2特异性siRNA或干扰对照48小时。改变培养基，用TGFβ刺激细胞1（10纳克/毫升）持续72小时。提取mRNA并表达HAS2(D类)和α-SMA(E类)通过QPCR进行量化。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析检验进行统计分析(P（P）<0.001），然后进行Tukey的HSD事后测试，统计显著性为P（P）< 0.05.

细胞周HA组件的作用

细胞周HA基质中含有大量透明粘连蛋白，有助于其组装。在本研究中，在TGFβ孵育的成纤维细胞中，IαI重链3（HC3）和TSG-6的表达分别增加了5倍和20倍172小时（图5，A和B）用SB431542阻断Alk 5受体可将此增加抑制90%，证实TGFβ参与其中1受体。然而，TSG-6和HC3的诱导不是通过Smad2或Smad3作为siRNA介导的，无论是单独还是联合使用，对TSG-6的mRNA水平都没有影响（图6，A和B）或HC3（未显示数据）。转化生长因子β1在分化过程中也激活有丝分裂原激活的蛋白激酶信号32,33,34,35,36,37,38,39在有丝分裂原活化蛋白激酶抑制剂PD98059存在的情况下，TSG-6的表达降低了40%（图6C）这表明分化信号至少触发了两条信号通路（Smad-dependent和ERK-dependent）。

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ALK 5抑制对HC3和TSG-6表达的影响。成纤维细胞生长停滞48小时。然后更换培养基，在没有（对照）或存在TGFβ的情况下继续培养172小时，有或没有ALK 5抑制（10μmol/L SB431542）。提取HC3的mRNA并进行QPCR(A类)和TSG-6(B类)如上所述。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析检验进行统计分析(P（P）<0.001），然后进行Tukey的HSD死后检验，统计显著性为P（P）< 0.05.

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Smad和ERK抑制对TSG-6表达的影响。成纤维细胞转染(A类)Smad2或(B类)Smad3特异性siRNA或加扰对照在无血清培养基中培养48小时。改变培养基，用TGFβ刺激细胞1（10纳克/毫升）持续72小时。未转染细胞(C类)接受TGFβ1在存在或不存在10μmol/L PD98059（或载体，0.1%二甲基亚砜）的情况下刺激72小时。然后提取细胞并对TSG-6进行QPCR，如所述。结果代表四个独立实验的平均值。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。采用单向方差分析检验和Tukey的HSD事后检验进行统计分析，统计显著性为P（P）< 0.05.

外源性HA对肌纤维母细胞分化的影响

为了检测HA浓度的增加是否直接影响成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转化，纯化HA与TGFβ同时添加1培养基为生长抑制的成纤维细胞。TGFβ对α-SMA的诱导有显著抑制作用1 （图7，A和B）由于向最终分化的肌成纤维细胞中添加外源性HA对其静息状态或TGF-β没有影响，因此这种抑制被证明是分化过程特有的1-刺激α-SMA表达（图8）.

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外源HA对α-sma诱导的影响。成纤维细胞生长到接近汇合处，然后在无血清培养基中生长48小时。抽吸培养基并用无血清培养基（对照）或含有10 ng/ml TGFβ的无血清培养液替换172小时±HA。答：从细胞中提取mRNA，如材料和方法对α-SMA进行QPCR。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析进行统计分析(P（P）<0.001）检验，然后是Tukey的HSD死后检验，统计显著性为P（P）< 0.05.B类：72小时后通过固定细胞证实α-SMA蛋白的相应表达，并对波形蛋白或α-SMA进行免疫染色。结果代表了三个独立的实验。

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HA对肌成纤维细胞α-SMA诱导的影响。肌成纤维细胞生长到接近汇合处，然后在无血清培养基中生长48小时。抽吸培养基，用新鲜无血清培养基（对照）或含有25μg/ml HA、10 ng/ml TGFβ的无血清培养基代替1，或10 ng/ml TGFβ1在25μg/ml HA存在下72小时。提取mRNA，并按所述进行α-sma QPCR。核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于对照样品分析基因表达。采用比较CT方法对基因表达进行相对定量，结果表示为5个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析进行统计分析(P（P）=0.00183）测试，然后是Tukey的HSD事后测试，统计显著性为P（P）< 0.05.

该实验室先前的工作已经证实，外源性HA在上皮细胞中的主要作用是作为TGFβ的修饰物1发送信号。26转化生长因子β孵育成纤维细胞1在HA存在下，显著抑制TGFβ1-Smad3的依赖性磷酸化（图9A）结合其对内源性HA的影响，这些结果强烈表明HA依赖于TGFβ水平的分化诱导1但这并不是通过简单地提供细胞外HA来复制的。此外，一旦细胞分化为肌成纤维细胞，这种依赖性就会消失（图9B）.

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HA对成纤维细胞和肌成纤维细胞Smad3磷酸化的影响。成纤维细胞(A类)或用10 ng/ml TGFβ培养72小时后分化的肌成纤维细胞1(B类)用PBS（×3）洗涤，在无血清培养基中生长48小时，然后用10 ng/ml TGFβ刺激60分钟1在有或无25μg/ml HA的情况下。提取细胞蛋白，并按照所述进行磷酸化Smad 3的SDS-PAGE和Western blotting。结果代表了六个独立实验。

外源性HA处理还抑制了与TGFβ孵育诱导的HC3和TSG-6的表达1 （图10，A–B）表明外源性HA拮抗细胞周HA涂层形成的机制。因此，HA的合成及其组织成外套与肌成纤维细胞表型的诱导有关。

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HA对HC3和TSG6诱导的影响。成纤维细胞生长停滞48小时。然后改变培养基，在不存在（对照）或存在TGFβ的情况下继续孵育172小时，含或不含25μg/ml HA。然后提取细胞并对HC3进行QPCR(A类)和TSG-6(B类)如上所述。使用核糖体RNA表达作为内源性对照，并相对于对照样品测定基因表达。比较级CT型方法用于基因表达的相对定量，结果表示为四个独立实验的平均值±SEM。使用单向方差分析进行统计分析(P（P）<0.001）检验，然后是Tukey的HSD事后检验，统计显著性为P（P）< 0.05.

成纤维细胞分化过程中的受体重定位

先前的研究表明，在肌纤维母细胞分化过程中，细胞表面HYAL2发生重定位。12其他人最近的报告40和41,42作为综述，有人认为HYAL 2和CD44共同定位于质膜中的脂筏。据报道，TGF受体在脂筏和非脂筏池之间穿梭。为了研究是否存在与CD44和HYAL 2平行的TGF受体重定位，我们通过蔗糖密度离心、SDS-PAGE和Western blotting检测了TGF受体1（ALK-5）的定位，并通过免疫化学检测了CD44和YYAL 2的细胞表面表达。HYAL 2和CD44共同定位于成纤维细胞质膜上的离散区域(图11A控制）。然而，在向肌成纤维细胞分化的过程中，它们的表达模式更加分散(图11A转化生长因子β1)这意味着从离散的脂筏到非筏池的重组。Western blotting显示TGFR1在非筏式水池中的相关重定位（图11、B和C）通过与外源HA孵育而逆转。

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分化过程中的受体重定位。成纤维细胞生长停滞48小时。然后更换培养基，在没有（对照）或存在TGFβ的情况下继续培养1持续72小时。答：固定细胞并进行HYAL 2（绿色）和CD44（红色）免疫染色。B类：提取细胞蛋白并按所述进行密度梯度超速离心。用SDS-PAGE和Western blotting鉴定的ALK-5受体分离每个组分中的蛋白质。抄送：结果通过4个独立实验的斑点密度分析表示。使用单向方差分析进行统计分析(P（P）<0.001）检验，然后是Tukey的HSD事后检验，统计显著性为P（P）< 0.05.

讨论

组织修复过程中细胞表型的调节是决定伤口愈合成功或瘢痕形成和纤维化发展的重要因素。在本研究中，TGFβ的过程1-先前的研究表明，线性糖胺聚糖HA可能是分化的调节剂。29,30结果表明，HA的合成对分化的发生至关重要。然而，尽管分化过程是通过Smad信号通路介导的，但无论是在诱导HAS2亚型的表达水平上，还是在合成酶的化学抑制水平上，Smad3磷酸化都不受HA合成阻断的影响，这表明HA在TGFβ水平上都有其影响1受体或通过Smad信号传导下游的单独机制。TSG-6和HC3的表达增加也与Smad磷酸化无关，这表明尽管细胞骨架重塑和HA外壳组装都是TGFβ的结果1-触发分化它们由独立的途径介导。此外，如果两者都被拮抗，分化就不会发生。

转化生长因子β1是多效性生长因子家族的成员，可调节多种细胞反应和功能。其作用是通过受体结合和启动由I型和II型受体组成的复合物来转导的[综述43,44]每一种都是丝氨酸/苏氨酸激酶。单个家族成员使用不同的I型（ALK）和II型受体启动信号传递，每个I型受体磷酸化不同的R-Smad来传播信号。对于TGFβ1,ALK-4、ALK-5和ALK-7是最常激活的I型受体，其靶点为Smad2和Smad3。在本研究中，选择性ALK5抑制可拮抗TGFβ的所有反应1，表示经典TGFβ1受体激活。然而，ERK和Smad通路都被TGFβ激活1与受体结合。ERK激活已在前面描述过35并被证明与上皮/间充质转化有关。36,45然而，它的参与和重要性取决于细胞类型36在目前的研究中，ERK活性对于触发与HA外壳形成有关的机制很重要，而Smad活性直接与细胞的表型变化有关。

HA是大多数细胞外基质的普遍成分，对维持基质稳定性和组织水合作用非常重要。它通过与细胞表面受体（主要是CD44和RHAMM）以及与其复合的结合蛋白（透明粘连蛋白）的相互作用，在调节细胞功能方面发挥重要作用。24,46,47,48,49,50,51,52因此，它是组织重塑的重要调节器，并与许多生物和病理过程有关，包括伤口愈合、胚胎发育、肿瘤生长和炎症。53,54,55,56以前的研究表明HA在促进TGFβ1-介导的成纤维细胞表型激活，29而肌成纤维细胞表型的分化与HA细胞周被的组装有关。12我们现在表明，不能简单地通过添加外源HA来模拟该涂层的组装（即使HA确实对细胞有影响）。外源性HA可拮抗细胞骨架的重新排列和从头开始的α-SMA的表达，这是分化的标志。外源HA的不同作用很可能反映了它与细胞表达的透明质酸和HA受体相互作用的不同方式。以前的研究已经进行了类似的观察，并表明HA的生物作用可能受到其向细胞呈现的方式以及其组装成不同细胞周围复合物的方式的影响。26,49,50,51,57

CD44是与HA外壳组装相关的主要受体51在本研究中，我们观察到当成纤维细胞发生表型改变时，CD44在细胞表面重新定位。在成纤维细胞中，它以离散的点状分布定位，随着细胞分化而变得弥散。这与Western blotting显示的ALK5（TGFRI）从脂筏的重新分布一致。HYAL2重定标在之前的报告中有描述，12和其他研究描述了TGFRI、CD44和HYAL2与脂筏相关。26,57在本研究中，TGFR1的重定位受到外源HA的拮抗，尽管内源性细胞周被中存在HA，但这显然是允许变化的。这再次强调了细胞对两种HA反应的差异，并再次强调了HA大分子组装在细胞周围环境中的潜在重要性。在本研究中，CD44是否直接参与介导外源性或内源性HA的作用，或者是否涉及其他HA受体，目前正在研究中。

总之，本研究结果强调了HA在肌纤维母细胞分化调控中的密切作用。虽然HA的合成和组织是分化发生的必要条件，但外源性HA可对抗分化。目前正在调查这些观察结果的中介机制。然而，数据确实强调了HA在病理学中的重要作用，并表明影响细胞识别HA和对HA作出反应的方式的调节可能具有控制细胞命运的重要潜力。

脚注

请将转载请求发送给英国加的夫CF14 4XN希思公园加的夫大学医学院肾病研究所R.Steadman博士。电子邮件：ku.ca.fc@rnamdaets.

由威尔士肾脏基金会支持。

A.P.和R.S.对这项工作做出了同等贡献。

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会