跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
免疫。作者手稿；可在PMC 2009年7月9日获得。
以最终编辑形式发布为：
免疫。2009年2月20日；30(2): 242–253.
2009年2月5日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.immuni.2008.11.012
预防性维修识别码：PMC2707901型
NIHMSID公司：NIHMS118204标准
PMID：19200759

Toll样受体7通过白细胞介素23依赖性免疫细胞浸润和归巢减轻西尼罗河致命性脑炎

特伦斯镇，1,5,6,9 白凤伟，2,9 田旺，2,7 Amber T.卡普兰，5 冯倩，三 露丝·R·蒙哥马利，三 约翰·安德森，8 理查德·弗拉维尔，1,4,*和埃罗·菲克里格2,4
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

西尼罗河病毒（WNV）是一种由蚊子传播的单链RNA（ssRNA）黄病毒，可导致不同严重程度的人类疾病。我们研究了Toll样受体7缺陷(Tlr7号机组−/−)和髓样分化因子88缺乏(Myd88（Myd88）−/−)这两种小鼠对ssRNA的识别能力都有缺陷，并且发现病毒血症和对致命WNV感染的敏感性增加。尽管大多数先天性细胞因子的组织浓度增加，CD45+白细胞和CD11b+巨噬细胞无法归宿WNV感染的细胞，并渗入靶器官Tlr7号机组−/−老鼠。Tlr7号机组−/−WNV感染后，小鼠和巨噬细胞的白细胞介素12（IL-12）和IL-23反应降低，IL-12 p40和IL-23p40缺乏的小鼠(伊利12b−/−)或IL-23 p19(伊利23a−/−)，但不是IL-12 p35(伊利12a−/−)，响应类似Tlr7号机组−/−小鼠对致命性西尼罗河病毒脑炎的敏感性增加。总之，这些结果表明，依赖TLR7和IL-23的西尼罗河病毒应答是一种重要的宿主防御机制，其作用是影响免疫细胞归巢到受感染的靶细胞。

简介

西尼罗河病毒（WNV）是一种蚊子传播的单链RNA（ssRNA）病毒，已成为北美流行性病毒性脑炎的最常见病因，最近已成为全球公共卫生关注的问题(Campbell等人，2002年;Debiasi和Tyler，2006年;古尔德和菲克里格，2004年;Gubler，2007年). 尽管人类感染通常是无症状的，但老年人和免疫力低下的人尤其有可能患上危及生命的神经系统疾病，包括脑膜炎和脑炎(Campbell等人，2002年;Davis等人，2006年). 目前尚不存在批准用于人类的治疗方法，病毒的发病机制尚不完全清楚。在小鼠中，WNV诱导全身感染，然后穿过血脑屏障，导致脑炎和死亡(Wang等人，2001年，2004). 诱导1型干扰素（IFN）(安德森和拉哈尔，2002年;布林顿，2001年;Gilfoy和Mason，2007年)和体液免疫(Diamond等人，2003a，2003年3月)提供针对WNV发病机制的一线防御和细胞免疫，包括γδT细胞(Wang等人，2003a)，CD4细胞+(Kulkarni等人，1991年;Sitati和Diamond，2006年)和CD8+(Shrestha和Diamond，2004年，2007;Shrestha等人，2006年;Sitati等人，2007年;Wang等人，2003b)αβT细胞参与WNV感染宿主的恢复。

类Toll-like受体（TLR）是一组系统发育上保守的、种系编码的分子，在启动先天免疫中起着重要作用。哺乳动物TLR由11–12个成员组成，它们作为模式识别受体（PRR）感知病原体相关分子模式（PAMP）(库雷希和梅德日托夫，2003年;山本等人，2004年). 越来越多的证据表明TLR能够识别多种病原体，包括细菌（通过TLR2、TLR4、TLR6和TLR9）、鞭毛原生动物（通过TLR5）和病原真菌（通过TLR 2、TLR3和TLR6）(Roeder等人，2004年;山本等人，2004年). TLR2和TLR4识别病毒蛋白(Bieback等人，2002年;Kurt-Jones等人，2000年;Rassa等人，2002年)，我们的数据表明TLR3介导病毒成分（包括双链RNA[dsRNA]和dsRNA模拟物poly（I:C））和完整病毒（包括郎呼肠孤病毒和西尼罗河病毒）的宿主识别(Alexopoulou等人，2001年;Edelmann等人，2004年;Town等人，2006年;Wang等人，2004年). 此外，TLR7和TLR8与MyD88对ssRNA和ssRNA产生病毒的依赖性识别有关，包括水疱性口炎病毒、流感病毒、人细小病毒1和人类免疫缺陷病毒(Diebold等人，2004年;Heil等人，2004年;Lund等人，2004年;Schlaepfer等人，2006年;Triantafilou等人，2005年).

TLR7在体内识别病毒感染方面的功能作用尚不清楚。因为WNV是一种阳性ssRNA病毒，因此可能被宿主TLR7检测到(Lund等人，2004年)，我们试图阐明TLR7在控制病毒感染中的作用。

结果

Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−小鼠更容易感染致死性西尼罗河病毒

我们使用WNV脑炎小鼠模型检测TLR7和MyD88在体内病毒识别中的作用。用2×10攻击小鼠三WNV的斑块形成单位（p.f.u.）与大约50%野生型（C57BL/6J）动物存活的剂量（LD）相对应50)每天监测两次死亡率。TLR7缺陷(Tlr7号机组−/−)小鼠对致死性西尼罗河病毒感染的敏感性（9%存活率）显著高于野生型对照小鼠（50%存活率，p<0.05；图1). TLR7信号传递需要适配器分子MyD88(Diebold等人，2004年;Hemmi等人，2002年;Lund等人，2004年)，我们的数据表明WNV感染MyD88缺陷型病毒后的存活结果类似(Myd88（Myd88）−/−)与野生型对照组相比，小鼠存活率为15%（p<0.05；图1). TLR9识别含有非甲基化CpG基序的细菌DNA(Hemmi等人，2000年)和TLR7一样，需要MyD88来发送信号(Bauer等人，2001年;Hemmi等人，2003年). 此外，最近有人认为TLR9可能与TLR7合作识别与小鼠巨细胞病毒相关的病毒核酸(Zucchini等人，2008年). 然而，我们的结果表明Tlr7号机组−/−小鼠对西尼罗河病毒感染具有特异性，因为TLR9缺乏(第9天−/− −/−)野生型西尼罗河病毒感染小鼠50（43%的存活率）与对照组（50%的存活率，p>0.05；图1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f1.jpg
增加的易感性Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−老鼠，但不是第9天−/−西尼罗河病毒挑战后的小鼠

野生型小鼠（n=24），Tlr7号机组−/−小鼠（n=22），Myd88（Myd88）−/−小鼠（n=13），以及第9天−/−小鼠（n=14）经腹腔感染WNV（LD）50)并连续21天每天监测两次死亡率。所示数据表示为x轴上的感染后时间（天）和y轴上的存活率（%）。Kaplan-Meier生存分析显示野生型和Tlr7号机组−/−或Myd88（Myd88）−/−小鼠，但野生型和第9天−/−老鼠。所示数据来自2-4个独立实验。

病毒载量和细胞因子Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−西尼罗河病毒感染小鼠

接下来我们检查了大脑和全身的病毒载量。感染后第2-3天（p.i.）在脾脏、肝脏和血液中检测到大量WNV，第6天在大脑中检测到WNV(Wang等人，2004年). 定量实时聚合酶链反应（Q-PCR）检测西尼罗河病毒包膜基因(WNVE公司)与对照组小鼠相比Tlr7号机组−/−小鼠（p<0.05）；图2A)和Myd88（Myd88）−/−小鼠（p<0.05）；图2B)在第2-3天的血液中Myd88（Myd88）−/−脾的WNVE公司RNA表达(图2B)第3天p.i.，这在Tlr7号机组−/−小鼠在第3天（数据未显示），但在第6天p.i.显著升高（p<0.01；图2A). 引人注目的是，WNVE公司RNA表达在Tlr7号机组−/−第6天p.i.时的大脑（p<0.05；图2A)并且在Myd88（Myd88）−/−第6天大脑（p<0.05）；图2B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms118204f2.jpg
Tlr7号机组-和Myd88（Myd88）-西尼罗河病毒攻击后依赖性病毒载量和先天性免疫细胞因子反应

野生型，Tlr7号机组−/−，或Myd88（Myd88）−/−小鼠腹腔注射西尼罗河病毒（LD）50).

（A） 定量实时PCR（Q-PCR；平均无单位比率+1 SEM）用于WNVE公司在感染后第3天（D），来自野生型和Tlr7号机组−/−老鼠。

（B） Q-PCR结果（平均无单位比+1 SEM）WNVE公司野生型与野生型的D3外周血、D3脾脏或D6灌注脑样本Myd88（Myd88）−/−老鼠。

（C） 野生型和非野生型血液固有免疫细胞因子的Q-PCR结果（平均无单位比率+1 SEM）Tlr7号机组−/−小鼠感染后服用D3。

（D） 野生型血液样本中IL-23（左栏）或IL-12 p40（右栏）的ELISA结果（pg/mL；平均值+1 SEM），Myd88（Myd88）−/−，或Tlr7号机组−/−D2上的老鼠我的88−/−小鼠实验）或D3(Tlr7号机组−/−小鼠实验）。

（E） Q-PCR结果（野生型和Tlr7号机组−/−感染D6小鼠。

数据来自2-4个类似独立实验的汇总结果，每组实验至少n=3（最多n=22）***与野生型小鼠相比，p<0.001、p<0.01和p<0.05。

此外，对Tlr7号机组−/−并在第6天用WNV（LD50). 符合WNVE公司Q-PCR结果显示，从Tlr7号机组−/−大脑（n=4；1.33×107脑pfu/g±0.9×107SEM）与野生型大脑（n=5；0.04×107pfu/g脑±0.03×107SEM），趋向于统计显著（p=0.07）。此外，还测量了血液和大脑中细胞因子的丰度。令人惊讶的是，WNV感染者血液中干扰素α（IFN-α）、干扰素β、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的RNA表达均显著增加（*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001）Tlr7号机组−/−小鼠与对照组在第3天p.i(图2C).

尽管WNV感染后全身固有细胞因子RNA普遍增加Tlr7号机组−/−小鼠，IL-12 p40（与IL-23共享的细胞因子链）RNA(伊利12b)血样中显著减少（p<0.05）Tlr7号机组−/−小鼠与对照组(图2C)，发现分泌的异二聚体IL-23蛋白在Myd88（Myd88）−/−感染后早期小鼠与对照组的比较(补充实验程序在线获取）（p<0.05；图2D). 此外，与来自Tlr7号机组−/−与对照组相比，小鼠血浆中IL-12 p40蛋白浓度显著降低（p<0.05）(图2D). 脑组织中IL-12 p35、IL-12 p 40和IL-23 p19 RNA的定量Tlr7号机组−/−与对照组相比，在第6天p.i.，小鼠的IL-12 p35和IL-23 p19 RNA显著减少（*p＜0.05，**p＜0.01）Tlr7号机组−/−老鼠(图2E).

体内对西尼罗河病毒感染细胞归巢的免疫细胞依赖TLR7和MyD88

接下来，我们进行了WNV抗原和CD11b（小胶质细胞和巨噬细胞标记物）或CD45（白细胞标记物）的免疫荧光分析Tlr7号机组−/−与对照组小鼠相比，我们的重点是嗅球，因为这个大脑区域对西尼罗河病毒感染和脑炎症最敏感(Wang等人，2004年). 符合WNVE公司Q-PCR，这些分析显示感染者大脑中WNV抗原免疫反应增强Tlr7号机组−/−小鼠与感染野生型动物的比较(图3A). 其他大脑区域也获得了类似的结果，包括大脑皮层、脑干、小脑和纹状体（数据未显示）。在野生型小鼠中，CD11b+小胶质细胞、巨噬细胞和CD45+白细胞与受感染的神经元紧密相连（通常直接接触）。然而，尽管WNV负担增加，CD11b+和CD45+免疫细胞在Tlr7号机组−/−小鼠，尽管在距离WNV感染的脑细胞较远的小鼠中检测到(图3A). 如预期，来自野生型或Tlr7号机组−/−小鼠没有显示WNV抗原、CD45或CD11b的信号(图3A). 在感染者中观察到更严重的表型Myd88（Myd88）−/−大脑，其中CD45+细胞几乎不存在(图S1A)尽管WNV负担增加(图S1B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f3.jpg
体内白细胞归巢于西尼罗河感染细胞Tlr7号机组受抚养人

野生型（WT）或Tlr7号机组−/−小鼠腹腔注射WNV（LD）50). 未感染WT和Tlr7号机组−/−小鼠被安乐死，并作为阴性对照进行并行处理。

（A） 在感染后第6天分离灌流脑，用配备Zeiss ApoTome的表观荧光显微镜（原始放大倍数63×）通过免疫荧光检测WNV抗原（绿色信号）和CD45（白细胞共同抗原，红色信号）或CD11b（巨噬细胞和小胶质细胞标志物，红色信号）。

（B） 在感染后第3天分离出灌流的肝脏，用配备Zeiss Apo-Tome的表观荧光显微镜（原始放大20倍）对WNV抗原（绿色信号）和CD45（红色信号）进行成像。DAPI（蓝色信号）被用作核复染，并显示了具有代表性的图像。CD45的数量+或CD11b+与WNV抗原共定位的每张图像中的细胞数+面积（第一个数字）和总CD45+或CD11b+每个图像的单元格（第二个数字）显示在（A）和（B）的右下角。

（C） 定量PCRWNVE公司野生型或Tlr7号机组−/−第3天p.i.的肝脏。图中显示的是+1 SEM。

（D） 定量PCR伊利23a野生型或Tlr7号机组−/−第3天p.i.的肝脏图显示平均值+1 SEM。在2-4个独立实验中观察到类似结果，每个实验组至少有4个n=4**与野生型小鼠相比，p<0.01和p<0.05。

确定感染者免疫细胞归巢受损Tlr7号机组−/−小鼠对大脑具有特异性，我们还分析了肝脏（WNV感染的另一个靶器官）(Venter等人，2005年)从野生型到Tlr7号机组−/−在野生型小鼠中，共聚焦显微镜显示大量CD45+感染肝细胞附近的白细胞。然而，不同的结果模式在Tlr7号机组−/−老鼠。与大脑CD45的观察结果类似+细胞存在，但通常在WNV感染的肝细胞附近发现(图3B). 当考虑到受感染时，这种表型更加引人注目Tlr7号机组−/−小鼠肝脏中的WNVE公司RNA拷贝数与野生型对照组相比（p<0.01；图3C). 此外，这种效应与IL-23 p19 RNA在Tlr7型−/−与野生型小鼠肝脏的比较(图3D). 为了确定这种影响是否归因于Tlr7号机组−/−在注射巯基乙酸后4天，从腹腔内回收免疫细胞、巨噬细胞并计数。有一个适度的无显著性的趋势，即在Tlr7号机组−/−小鼠（n=4只/组，野生型与Tlr7型−/−小鼠：7.16×106± 1.94 × 106与9.14×10相比6± 1.61 × 106; p=0.17），表明这些动物的巨噬细胞募集、运动和归巢都完好无损。综合起来，这些数据表明TLR7介导的免疫细胞在体内归巢到WNV感染的靶细胞，并且这种效应与IL-12和IL-23反应有关。

体外识别WNV触发因子TLR7和IL-23依赖的巨噬细胞趋化作用

为了确定是否减少免疫细胞对西尼罗河病毒感染细胞的归巢Tlr7号机组−/−我们建立了一种跨阱趋化性实验。因为CD11b+巨噬细胞归巢感染靶细胞在Tlr7号机组−/−小鼠外周巨噬细胞Tlr7号机组−/−和野生型小鼠进行体外趋化性分析。将TLR7小分子激动剂loxoribine（loxO）、WNV感染的神经母细胞瘤-2a（N2a）裂解物上清液或巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1，作为阳性对照）和1×10的剂量范围载入跨孔板的下腔（包含玻璃盖玻片）5巨噬细胞被放置在上腔。6小时后，回收下室玻璃盖玻片，并用CD11b抗体进行免疫标记，以进行共聚焦显微镜检查。野生型巨噬细胞迁移增加是对loxO、感染的N2a裂解物上清液和MCP-1的反应。然而，尽管Tlr7号机组−/−巨噬细胞增加了向MCP-1的迁移，表明其具有完整的趋化反应，对氧合物或感染的N2a裂解物上清液具有折射性(图4A). 定量显示（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）显著降低Tlr7号机组−/−巨噬细胞朝向loxO（50或100μM）或感染的N2a裂解物上清液（感染倍数[MOI]=0.5，从未稀释到1:50），但不朝向MCP-1(图4B). 我们还用MOI=1的WNV感染了N2a细胞，并制备了细胞裂解物上清液，并注意到这种材料对Tlr7号机组−/−与野生型巨噬细胞跨井迁移相比（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f4.jpg
Tlr7号机组-依赖性巨噬细胞体外归巢

（A） 腹腔巯基乙酸合法巨噬细胞由野生型或Tlr7号机组−/−将小鼠置于transwell平板的上腔。在下室中，添加TLR7激动剂洛索里尼（loxO，从0到100μM）、WNV感染的N2a细胞裂解物的上清液（MOI=0.5，从1:1稀释到1:50）或巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1，1000μg/mL）6小时。回收放置在下室的玻璃盖玻片，用于共焦显微镜检查CD11b（绿色信号）。DAPI（蓝色信号）被用作核复染物（原始放大倍数63倍），并显示了代表性图像。（B） CD11b型+对高倍视野（原始放大倍数63倍）中的细胞进行计数（n=3/条件），数据以平均值+1 SD表示。在3-4个独立实验中也获得了类似的结果**与野生型巨噬细胞相比，p<0.01和p<0.05。

接下来，我们确定Tlr7号机组−/−巨噬细胞对WNV感染的反应与IL-12和IL-23的减少有关。Tlr7号机组−/−和野生型巨噬细胞感染WNV（MOI=1），并分别通过Q-PCR和免疫印迹检测IL-12 p40 RNA和IL-23 p19蛋白。感染Tlr7号机组−/−与野生型细胞相比，巨噬细胞产生的IL-12 p40 RNA显著减少（p<0.01），WNV诱导的IL-23 p19蛋白在感染者中也明显减少Tlr7号机组−/−巨噬细胞(图5A). 此外，Tlr7号机组−/−当测量IL-12 p40或TNF-α时，巨噬细胞对氧合酶的剂量范围完全无反应，这进一步表明上述作用是TLR7依赖性的(图S2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f5.jpg
Tlr7号机组和IL-23信号依赖性巨噬细胞反应

（A） 腹腔巯基乙酸合法巨噬细胞由野生型（WT）或Tlr7号机组−/−小鼠（关键适用于[A]和[C]）并在MOI=1时感染WNV。24小时后，制备细胞裂解物伊利12bQ-PCR分析（左，无单位比率+1 SEM）或免疫印迹IL-23 p19和肌动蛋白作为负荷对照（中间）。密度测定（IL-23 p19与肌动蛋白信号的比值）如右图所示。

（B） 用TLR7配体洛索里尼（loxO，如图所示，从0到250μM）刺激巨噬细胞24小时，并对细胞裂解物进行IL-12Rβ1、IL-12Rα2、IL-23R或肌动蛋白的免疫印迹（左）。密度测定（IL-12Rβ1与肌动蛋白信号的比值）显示在右侧面板中（每种情况下n=3）。

（C） 巨噬细胞（左）感染WNV（从1.0到2.0 MOI），24小时后采集细胞裂解物进行IL-12Rβ1、IL-12Rα2、IL-23R或肌动蛋白的免疫印迹分析。密度测定法（靶信号与肌动蛋白的比率）显示在每个免疫印迹下面的图表中。巨噬细胞（右侧）放置在跨孔板的上腔中，IL-23（0~10 ng/mL）放置在下腔中。6小时后，CD11b+通过共聚焦显微镜在下腔室的玻璃盖玻片上计数高功率场中的细胞（每个条件n=3）**与相同剂量的野生型巨噬细胞相比，p<0.01和p<0.05。平均值±1SD如（B）和（C）所示。在2-4个独立实验中观察到类似的结果。

在我们的模型中，我们提出脑旁巨噬细胞（小胶质细胞）最初在TLR7识别脑穿透性WNV时产生IL-12和IL-23，然后浸润性巨噬细胞和其他白细胞会响应此信号迁移。如果是这样的话，那么人们可能会认为IL-12受体（R）和IL-23R表达的减少是低反应性的基础Tlr7号机组−/−巨噬细胞对WNV诱导的趋化性。为了解决这种可能性，Tlr7号机组−/−或野生型巨噬细胞受到一定剂量范围的loxO的攻击，并测定IL-12R和IL-23R的蛋白表达。正如IL-12和IL-23共享IL-12 p40亚单位一样(库珀和卡德，2007年)，其受体也形成共享共同链IL-12Rβ1亚单位的异二聚体(van de Vosse等人，2003年). 虽然IL-12Rβ2和IL-23R在Tlr7号机组−/−loxO攻击后，野生型巨噬细胞中IL-12Rβ1被诱导，但Tlr7号机组−/−巨噬细胞无反应(图5B). 接下来确定野生型西尼罗河病毒感染与Tlr7号机组−/−巨噬细胞也能产生类似的作用。与loxO攻击相似，MOI=1或2的WNV诱导野生型巨噬细胞表达IL-12Rβ1，但这种反应在Tlr7号机组−/−巨噬细胞(图5C). 最后，我们利用我们的跨阱实验在体外检测了IL-23或IL-12是否可以直接影响TLR7依赖性巨噬细胞的趋化性。结果表明，IL-23剂量依赖性地（从2.5到10 ng/mL）增强了野生型的趋化性，但没有Tlr7号机组−/−巨噬细胞(图5C). 然而，野生型和Tlr7号机组−/−巨噬细胞对IL-12 p70趋化性具有折射作用（n=3个跨孔/组，野生型与野生型的平均值±SDTlr7号机组−/−巨噬细胞对细胞的高倍视野，0ng:4个细胞±1个细胞对4.33个细胞±.58个细胞；2.5纳克：4.67个细胞±.58个细胞，而5.33个细胞±.58个细胞；5.0ng:4.67个细胞±.58个细胞对5.33个细胞±0.58个细胞；10 ng:4.33个细胞±.58个细胞对4.67个细胞±0.58个细胞）。因此，IL-23（而不是IL-12）在体外对TLR7依赖性巨噬细胞趋化性负责。

为了确定我们在Tlr7号机组−/−巨噬细胞可能是代偿性的Tlr公司响应，Tlr公司对WNV感染的巨噬细胞进行Q-PCR阵列Tlr7号机组感染后，RNA发生了实质性改变Tlr7号机组−/−巨噬细胞（数据未显示）。此外，对趋化因子和趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体进行Q-PCR阵列，以确定WNV感染后TLR7的任何其他靶点，但没有明显变化（数据未显示）。最后，通过蛋白细胞因子阵列分析感染巨噬细胞的上清液，我们没有观察到野生型和Tlr7号机组−/−巨噬细胞（数据未显示）。因此，根据无偏见的方法，在巨噬细胞中未发现WNV的其他TLR7依赖性靶点。

体内对西尼罗河病毒感染细胞归巢的免疫细胞依赖TLR7-IL-23

我们迄今为止的数据表明，TLR7对WNV的识别导致IL-23依赖性免疫细胞归巢。为了在体内直接测试这一假设，野生型IL-12 p35缺陷(伊利12a−/−)，IL-12 p40缺乏(伊利12b−/−)或IL-23 p19缺陷(伊利23a−/−)小鼠感染了西尼罗河病毒，我们在p.i.第6天通过共焦显微镜评估了感染的大脑中是否存在西尼罗湖病毒和浸润的白细胞。野生型和伊利12a−/−小鼠表现出CD11b+巨噬细胞和小胶质细胞(图6)和CD45+白细胞(图S3A)与受感染的脑细胞紧密相连。然而，在这两者中伊利12b−/−和伊利23a−/−小鼠，CD11b+巨噬细胞和小胶质细胞(图6)和CD45+白细胞(图S3A)未明确与WNV感染细胞的病灶共定位。此外，伊尔23a−/−小鼠的CD11b浸润较少+巨噬细胞和小胶质细胞(图6)与WNV感染的脑细胞没有明显关联。因此，针对WNV感染细胞的免疫细胞的适当浸润和归巢需要IL-23。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f6.jpg
西尼罗河病毒噬菌体归巢依赖IL-23信号

野生型（n=6），伊利12a−/−（n＝4），伊利12b−/−（n=4），以及伊利23a−/−（n=3）小鼠感染西尼罗河病毒（LD）50). 感染后第6天分离大脑，用CD11b（绿色信号）和WNV抗原（红色信号）抗体进行共聚焦显微镜免疫染色，以显示WNV感染脑区的小胶质细胞和浸润性巨噬细胞。TOPRO3被用作核复染（蓝色信号），合并图像显示在右侧。CD11b的数量+与WNV抗原共定位的每张图像中的细胞数+区域（第一个数字）和总CD11b+每个图像的单元格（第二个数字）显示在右下角。在2-4个独立实验中也得到了类似的结果。

为了更好地定义和枚举野生型大脑免疫细胞，Tlr7号机组−/−，Myd88（Myd88）−/−，伊利12a−/−，伊利23a−/−，或伊利12b−/−小鼠感染WNV（LD50)在p.i.第6天分离大脑。我们将流式细胞术方法应用于收获大脑的单细胞悬浮液，以表征脑过滤巨噬细胞的数量（基于CD45你好CD11b型+地位；Juedes and Ruddle，2001年;Town等人，2008年)、脑旁小胶质细胞（CD45整数CD11b型+F4/80银+;Juedes and Ruddle，2001年;Town等人，2008年)和脑过滤CD45你好CD4细胞+和CD45你好CD8（CD8）+这些小鼠的T细胞。与我们的共聚焦显微镜分析一致，与野生型相比，脑浸润巨噬细胞减少了59%至98%Tlr7号机组−/−，Myd88（Myd88）−/−，伊利12b−/−，或伊尔23a−/−小鼠，而伊利12a−/−小鼠似乎与野生型WNV感染的大脑相似(图7). 当考虑CD4时，一个大致相似的结果模式是明显的+和CD8+T细胞，当比较野生型和Tlr7号机组−/−，Myd88（Myd88）−/−，或伊利12b−/−小鼠，而伊利12a−/−或伊尔23a−/−小鼠似乎与野生型WNV感染的大脑相似(图7). 然而，当考虑到脑内滞留小胶质细胞时，出现了不同的结果模式，这与野生型WNV感染的大脑没有明显区别，只是明显减少了75%伊利12b−/−老鼠(图7). 我们还通过CD19表达分析了B细胞，但没有检测到这些小鼠基因型之间的一致性差异（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms118204f7.jpg
野生型脑免疫细胞的特征，Tlr7号机组−/− −/−，Myd88（Myd88）−/−，伊尔12−/−、和伊利23−/−西尼罗河病毒感染小鼠

WNV感染（LD）后第6天的2-3个独立实验显示了脑流式细胞术结果50; n=每种基因型1–5只小鼠，数量代表指定门的百分比±SD）。收集37:70%的Percoll界面，并对其进行CD45、CD4、CD8、CD11b和F4/80抗原染色，如（A）所示（右图适用于所有面板）。流式细胞仪分析至少收集了100000个事件，点图显示x轴上的侧面散射（SSC）和y轴上的CD45对数荧光强度。数字表示选通区域内阳性细胞的百分比。

（A） 脑流式细胞术结果显示为野生型与。Tlr7号机组−/−老鼠。

（B） 脑流式细胞术数据显示野生型与Myd88（Myd88）−/−或伊利12a−/−老鼠。

（C） 脑流式细胞术数据显示野生型与伊利23a−/−或伊利12b−/−老鼠。

为了确定白细胞归巢至WNV感染的大脑的受损是否是由于白细胞扩张或分化的一般缺陷，或是外围细胞死亡所致，我们如上所述分析了相同动物的脾脏，没有检测到基因型之间的任何差异（数据未显示）。有趣的是，在其他神经炎症条件下，外周白细胞渗入（1）实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导的小鼠或（2）缺乏先天免疫TGF-β信号的阿尔茨海默病小鼠模型的中枢神经系统（CNS），也有类似的影响，但这些外围细胞的数量基本上没有改变(Laouar等人，2008年;Town等人，2008年). 总之，这些脑流式细胞术结果证实了我们的共聚焦显微镜分析，并加强了我们的结论，即白细胞（特别是巨噬细胞和T细胞）向WNV感染的CNS的脑浸润或归巢依赖于TLR7-MyD88-IL-23信号传导。

最后，我们确定致死性西尼罗河病毒脑炎后的存活是否依赖于IL-12、IL-23或两者。因此，野生型，伊利12a−/−，伊利12b−/−，或伊尔23a−/−小鼠感染WNV（LD50)每天监测两次生存率。基于IL-23依赖性免疫细胞归巢于WNV感染的脑细胞的研究结果，我们假设伊利12b−/−和伊利23a−/−但不是伊利12a−/−致死性西尼罗河病毒攻击后的小鼠。结果与该假设一致。具体来说，尽管伊利12a−/−小鼠与野生型对照组没有差异（两组的存活率均为42%，p>0.05；图S3B)，两者都是伊利12b−/−小鼠存活率为27%，野生型对照组为53%，p<0.05；图S3B)和伊利23a−/−小鼠存活率为0%，野生型对照组为25%，p<0.01；图S3B)更容易感染致命的西尼罗河病毒。总之，这些结果表明，致死性西尼罗河病毒攻击后的生存需要完整的IL-23，而不是IL-12应答。

讨论

哺乳动物的先天免疫反应是抵御入侵病原体的重要第一道防线。值得注意的是，TLR是PAMP不可或缺的传感器，其功能是驱动先天免疫反应，从而微调适应性免疫(库雷希和梅德日托夫，2003年;山本等人，2004年). 众所周知，TLR3识别dsRNA(Alexopoulou等人，2001年;Town等人，2006年). WNV是一种阳性的ssRNA黄病毒，在其生命周期中产生dsRNA，并且第三阶段−/−小鼠对致死性西尼罗河病毒脑炎的敏感性降低(Wang等人，2004年). 这一发现表明TLR3是一种识别WNV dsRNA的宿主免疫受体。此外，该病毒利用TLR3通过诱导增加血脑屏障通透性的全身TNF-α来提高宿主的传染性。然而，人类中大多数西尼罗河病毒感染是无症状的(Campbell等人，2002年;Davis等人，2006年)强调宿主免疫机制必须存在以抑制西尼罗河病毒感染。在这份报告中，我们表明Tlr7号机组−/−小鼠对致死性西尼罗河病毒脑炎的易感性增加；这一发现指出，TLR7是宿主抵抗西尼罗河病毒感染的第一道防线，它通过识别病毒进入宿主后立即出现的ssRNA，甚至在第一轮复制之前。TLR7被认为完全依赖MyD88作为适配器分子，并且，与这个概念一致，我们发现我的88−/−小鼠物镜检查Tlr7号机组−/−致死性西尼罗河病毒感染后小鼠存活率降低。

我们试图了解导致Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−小鼠感染致死性西尼罗河病毒脑炎。有趣的是，病毒负荷在全身和大脑中都增加了Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−这表明，这些先天免疫分子的丢失导致宿主无法控制病毒感染性。令人惊讶的是，Tlr7号机组−/−老鼠有增加WNV攻击后大多数先天性促炎细胞因子的系统浓度，包括IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6和TNF-α，被认为是宿主抗病毒免疫的关键介质(安德森和拉哈尔，2002年;布林顿，2001年;Gilfoy和Mason，2007年). 这种矛盾的结果很可能是由于其他先天性免疫病毒PRR，如TLR3、RIG-I和MDA-5，它们仍有望在Tlr7号机组−/−WNV感染小鼠。此外，西尼罗河病毒感染研究伊尔6−/−和TNF-可溶性受体I型缺陷(变压器1−/−)小鼠表明，这种敏感性的降低依赖于通过I型受体（Tnfsr1）的TNF-α（而非IL-6）信号，导致血脑屏障通透性增加，从而增强病毒进入中枢神经系统(Wang等人，2004年). 然而，重要的是，最近使用不同WNV株的报告显示TLR3和Tnfsr1具有保护作用，表明宿主抗病毒先天免疫可能是WNV毒株特异性的(Daffis等人，2008年;Shrestha等人，2008年). 浆细胞样树突状细胞（pDCs）被认为是通过TLR7信号通路对病毒感染产生IFN-α和IFN-β的主要来源(Cella等人，1999年;Hornung等人，2002年). 然而，为了应对WNV的挑战，Tlr7号机组−/−与野生型小鼠相比，小鼠产生了更多的IFN-α和IFN-β。因此，在我们看来，pDCs的功能障碍不太可能是WNV敏感性增加的根本原因Tlr7号机组−/−老鼠。

与IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6和TNF-α的增加量相反，在致命的WNV感染后，全身IL-12 p40、脑IL-12 p35和IL-23 p19的减少Tlr7号机组−/−老鼠。此外，Myd88（Myd88）−/−小鼠体内IL-23的丰度降低。此外，白细胞、小胶质细胞和巨噬细胞对WNV感染细胞的归巢在Tlr7号机组−/−和Myd88（Myd88）−/−老鼠。这种作用可以在体外重现，因为我们发现，尽管野生型巨噬细胞向TLR7激动剂loxO或WNV感染的神经元样细胞的感染上清液迁移Tlr7型−/−巨噬细胞受到明显抑制。然而，应该注意的是，巯基乙酸合法的腹腔巨噬细胞并不一定反映单核细胞或组织巨噬细胞（如小胶质细胞和库普弗细胞）的行为。我们继续假设，TLR7识别WNV可促进IL-12-IL-23依赖性免疫细胞归巢到受感染的靶细胞。有趣的是，TLR7与热休克蛋白70协同促进巨噬细胞吞噬作用(Wang等人，2006年)增加了TLR7促进巨噬细胞归巢和清除WNV感染细胞的可能性。

IL-12-IL-23轴最近已成为关键的免疫调节途径。有趣的是，有人假设IL-12和IL-23之间的“平衡倾斜”控制了炎症反应的结果，IL-23的作用是通过辅助T细胞17（Th17）产生IL-17(Goriely等人，2008年). IL-17在IL-23介导的痘苗病毒耐药性中发挥“一定但次显性的作用”(Kohyama等人，2007年)，表明IL-17（可能由先天性免疫细胞产生的IL-23诱导）可能将先天性免疫TLR-IL-23信号与适应性免疫Th17细胞联系起来。为了支持这一点，最近的研究表明，IL-17被分泌到用TLR7和TLR8激动剂处理的人外周血单个核细胞的上清液中(Kattah等人，2008年). 根据本文报道的TLR7和IL-23信号转导的结果，未来的研究需要评估IL-17在西尼罗河病毒性脑炎中的假定作用。

因为IL-12和IL-23共享p40亚单位，并且都利用共同的IL-12Rβ1链进行信号传递，所以最初很难区分这两种细胞因子的作用。例如，尽管人们曾认为IL-12介导实验性自身免疫性脑脊髓炎的炎症、自身侵袭性反应，但后来的一份开创性报告显示IL-23是负责的细胞因子(Cua等人，2003年). TLR配体可促进天然免疫细胞产生IL-12和IL-23。具体而言，树突状细胞对革兰氏阳性细菌和真菌的TLR2识别导致p40和p19亚单位（但不是p35）的诱导，而病毒对TLR3的刺激或革兰氏阴性细菌对TLR4的参与则诱导所有三个亚单位(Bekeredjian-Ding等人，2006年;Gautier等人，2005年;Goriely等人，2006年;Napolitani等人，2005年;Re和Strominger，2001年). 我们在WNV感染后的野生型巨噬细胞中发现IL-12 p40 RNA和IL-23 p19蛋白的诱导作用，并且在Tlr7型−/−巨噬细胞。此外，IL-12和IL-23共同受体链IL-12Rβ1在loxO攻击或WNV感染后以TLR7依赖性方式诱导。值得注意的是，IL-12Rβ2（与IL-12Rβ1配对以促进IL-12信号传导）在Tlr7号机组−/−巨噬细胞，提示一种代偿机制，即这些细胞“偏向”IL-23而非IL-12应答。

为了进一步确定TLR7依赖性免疫应答是否依赖于IL-12或IL-23（或两者）途径，我们（1）评估了野生型和Tlr7号机组−/−巨噬细胞在体外对IL-12或IL-23产生应答，在体内对WNV感染的野生型和伊利12a−/−，伊利12b−/−，或伊利23a−/−小鼠，以及（2）在野生型与野生型WNV感染后进行生存分析伊利12a−/−，伊利12b−/−，或伊尔23a−/−老鼠。外源性添加IL-23（而非IL-12）能够促进野生型巨噬细胞的趋化性，而Tlr7号机组−/−巨噬细胞对刺激具有屈光性。一直以来，西尼罗河病毒感染导致免疫细胞受损，无法回到受感染的脑细胞伊利12b−/−和伊利23a−/−老鼠，但不在伊利12a−/−老鼠。如果IL-23依赖性免疫细胞归巢到受感染的靶细胞是对抗致命性西尼罗河病毒脑炎的一个缓解因素，那么在受到致命剂量西尼罗湖病毒的攻击后，预计生存率会降低伊利12b−/−和伊利23a−/−老鼠，但不在伊利12a−/−动物。观察到与该假设一致的结果模式。有趣的是，以前的一份报告显示，趋化因子受体CCR5是白细胞向大脑输送和缓解致命性西尼罗河病毒脑炎所必需的(Glass等人，2005年)，进一步强调免疫细胞浸润和归巢作为一种重要的宿主防御机制的作用。

我们的结果表明，需要完整的TLR7和IL-23信号来促进有效病毒清除的宿主-病毒-病原体相互作用模型。具体地说，我们在该模型中假设，WNV中的常驻组织巨噬细胞通过TLR7识别病毒ssRNA，靶向器官，如肝脏中的Kupffer细胞和大脑感觉组织中的小胶质细胞，从而入侵WNV。这些常驻巨噬细胞随后分泌IL-23，促进包括血载巨噬细胞或单核细胞在内的外周免疫细胞的浸润和归巢，进而上调IL-12Rβ1以接收IL-23信号。一旦渗入WNV靶器官，这些外周免疫细胞就可以通过TLR7-IL-23依赖和独立机制影响病毒的中和和清除。TLR7过度施压小鼠的炎症反应和自身免疫进一步强调了TLR7在促进免疫细胞激活方面的重要性(Deane等人，2007年). 综上所述，我们的结果表明，TLR7是白介素-23依赖性免疫细胞归巢到受感染靶细胞所需的西尼罗河病毒的关键宿主传感器，并表明旨在促进TLR7-IL-23信号传导的药物治疗将有利于西尼罗湖病毒和其他脑炎的治疗。

实验程序

老鼠

Tlr7号机组−/−(Lund等人，2004年),Myd88（Myd88）−/−(Adachi等人，1998年)、和第9天−/−(Hemmi等人，2003年)通过回交连续10代将小鼠繁殖到C57BL/6背景。伊利12a−/−(Mattner等人，1996年)和伊利12b−/−(Magram等人，1996年)C57BL/6背景的小鼠来自Jackson Laboratories。伊利23a−/−老鼠(Cua等人，2003年)在混合C57BL/6×129背景上从突变小鼠区域资源中心（MMRRC）获得。我们在8至12周龄的小鼠上进行了所有实验，每个感染实验的小鼠组年龄和性别严格匹配。所有实验均获得耶鲁动物资源中心动物护理和使用委员会的批准。

病毒感染

我们给小鼠腹膜内接种2000个斑块形成单位（p.f.u.）（LD50)如前所述，将WNV分离物2741放入100μl含有5%明胶的PBS中(Wang等人，2004年). 在感染后21天内观察小鼠，我们每天两次检查其发病率（包括嗜睡、厌食和行走困难）和死亡率。

定量聚合酶链反应

使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）从血液、脾脏、肝脏和脑组织中提取核糖核酸。RNA用于使用ProSTAR第一链RT-PCR试剂盒（Stratagene）合成互补（c）DNA。我们使用的产氟探针和引物已在别处介绍过(Wang等人，2004年). 探针包含一个5′报告子FAM和一个3′猝灭子TAMRA（应用生物系统）。该分析在iCycler（Bio-Read）上进行。热循环包括95°C 3.5 min和48个95°C循环30 s和60°C循环1 min。为了使样品正常化，在Actb公司Q-PCR。扩增基因数量与Actb公司cDNA代表每个样本中的相对数量。

免疫荧光成像

快速分离大脑和肝脏，将其固定在4%多聚甲醛（PFA）中4°C过夜，并在分级系列蔗糖中冷冻保护（10%、20%和30%，每晚在4°C下过夜）。感染后第3天处死的感染小鼠脾脏用作阳性对照，以确保WNV抗体的特异性（数据未显示）。用低温恒温器在25μm处切割副中层矢状切面。组织切片采用PAP笔（Zymed Laboratories），并在室温下在无血清蛋白块（Dakocytomation）中预封闭30分钟。然后在4°C下，将切片与针对CD11b（Serotec；1:200）、CD45（Serotec，1:200）或WNV抗原（来自J.F.Anderson；1:250）的各种主要抗体组合反应过夜。在PBS中进行三次冲洗后，在室温下用适当的二级抗体与Alexa Fluor 488、594或647结合反应1小时。在PBS中进行三次额外冲洗后，用DAPI或TOPRO3（Invitrogen）对切片进行核复染，并将其安装在荧光安装介质（ProLong Gold）中。使用配备蔡司ApoTome的荧光显微镜或蔡司LSM510 META共焦显微镜在独立通道中采集图像。使用蔡司Axiovision软件以盲法计算大脑和肝脏中的免疫细胞以及与WNV感染的靶细胞共定位的免疫细胞数量。

统计分析

我们计算了平均值的标准误差（SEM）和标准偏差（SD），并通过非配对Student t检验（用于单平均值比较）或方差分析（ANOVA）和事后检验（用于多个平均值的比较）对数据进行了分析。生存曲线比较采用log-rank检验（相当于Mantel-Haenszel检验，Prism软件）。

补充材料

2

单击此处查看。（520万，pdf）

致谢

我们感谢A.Ferrandino、D.Beck、X.Liu和D.Gate为我们提供的专家技术援助，以及F.Manzo为我们准备这份手稿提供的帮助。这项工作得到了NIH奖AI055749和AI50031的支持。T.T.得到了阿尔茨海默病协会的资助和美国国立卫生研究院、美国国立老龄化研究所的“独立之路”奖（1K99AG029726-01和4R00AG0029726-02）的支持。F.B.得到了东北生物防御中心（U54-AI057158-Lipkin）颁发的职业发展奖的支持。T.W.由美国国立卫生研究院（5R03AI067409）资助。R.A.F.和E.F.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。T.T.是再生医学Ben Winters捐赠主席的首任主席。

工具书类

  • Adachi O、Kawai T、Takeda K、Matsumoto M、Tsutsui H、Sakagami M、Nakanishi K、Akira S。MyD88基因的靶向性破坏导致IL-1和IL-18介导的功能丧失。免疫。1998;9:143–150.[公共医学][谷歌学者]
  • Alexopoulou L、Holt AC、Medzhitov R、Flavell RA。Toll样受体3对双链RNA的识别和NF-kappaB的激活。自然。2001;413:732–738.[公共医学][谷歌学者]
  • Anderson JF，Rahal JJ。干扰素α-2b和利巴韦林对西尼罗河病毒的体外疗效。突发传染病。2002;8:107–108. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bauer S、Kirschning CJ、Hacker H、Redecke V、Hausmann S、Akira S、Wagner H、Lipford GB。人类TLR9通过物种特异性CpG基序识别对细菌DNA产生反应。美国国家科学院院刊。2001;98:9237–9242. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bekeredjian-Ding I，Roth SI，Gilles S，Giese T，Ablasser A，Hornung V，Endres S，Hartmann G.T细胞依赖性，TLR诱导的人单核细胞产生IL-12p70。免疫学杂志。2006;176:7438–7446.[公共医学][谷歌学者]
  • Bieback K，Lien E，Klagge IM，Avota E，Schneider-Schaulies J，Duprex WP，Wagner H，Kirschning CJ，Ter Meulen V，Schneiter-Schaullies S.野生型麻疹病毒的血凝素蛋白激活toll样受体2信号传导。《维罗尔杂志》。2002;76:8729–8736. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 布林顿马萨诸塞州。西尼罗河病毒复制的宿主因素。Ann N Y科学院。2001;951:207–219.[公共医学][谷歌学者]
  • Campbell GL、Marfin AA、Lanciotti RS、Gubler DJ、西尼罗河病毒。柳叶刀传染病。2002;2：519–529。[公共医学][谷歌学者]
  • Cella M、Jarrosay D、Fachetti F、Alebardi O、Nakajima H、Lanzavecchia A、Colonna M。浆细胞样单核细胞迁移到炎症淋巴结并产生大量I型干扰素。自然医学。1999;5:919–923.[公共医学][谷歌学者]
  • Cooper AM，Khader SA。IL-12p40：一种固有的激动性细胞因子。趋势免疫。2007;28:33–38.[公共医学][谷歌学者]
  • Cua DJ、Sherlock J、Chen Y、Murphy CA、Joyce B、Seymour B、Lucian L、To W、Kwan S、Churakova T等。白介素-23而非白介素-12是大脑自身免疫炎症的关键细胞因子。自然。2003;421:744–748.[公共医学][谷歌学者]
  • Daffis S、Samuel MA、Suthar MS、Gale M，Jr、Diamond MS。Toll样受体3对西尼罗河病毒感染具有保护作用。《维罗尔杂志》。2008;82:10349–10358. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Davis LE、DeBiasi R、Goade DE、Haaland KY、Harrington JA、Harnar JB、Pergam SA、King MK、DeMasters BK、Tyler KL。西尼罗河病毒神经侵袭性疾病。Ann Neurol公司。2006;60:286–300.[公共医学][谷歌学者]
  • Deane JA、Pisitkun P、Barrett RS、Feigenbaum L、Town T、Ward JM、Flavell RA、Bolland S。控制toll样受体7的表达对限制自身免疫和树突状细胞增殖至关重要。免疫。2007;27：801–810。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Debiasi RL，Tyler KL。西尼罗河病毒脑膜脑炎。国家临床实践神经学。2006;2：264–275。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Diamond MS、Shrestha B、Marri A、Mahan D、Engle M.B细胞和抗体在西尼罗河脑炎病毒播散性感染的即时防御中发挥关键作用。《维罗尔杂志》。2003年a月；77:2578–2586. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Diamond MS、Sitati EM、Friend LD、Higgs S、Shrestha B、Engle M.诱导IgM在预防西尼罗河病毒感染中的关键作用。《实验医学杂志》。2003年b；198:1853–1862. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Diebold SS、Kaisho T、Hemmi H、Akira S、Reis e Sousa C.通过TLR7介导的单链RNA识别产生抗病毒反应。科学。2004;303:1529–1531.[公共医学][谷歌学者]
  • Edelmann KH、Richardson-Burns S、Alexopoulou L、Tyler KL、Flavell RA、Oldstone MB。Toll样受体3在病毒感染中起生物作用吗？病毒学。2004;322:231–238.[公共医学][谷歌学者]
  • Gautier G、Humbert M、Deauvieau F、Scuiller M、Hiscott J、Bates EE、Trinchieri G、Caux C、Garrone P。I型干扰素自分泌-嘌呤环参与Toll样受体诱导的树突状细胞分泌白细胞介素-12p70。《实验医学杂志》。2005;201:1435–1446. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gilfoy FD，Mason PW。西尼罗河病毒诱导的干扰素产生是由双链RNA依赖性蛋白激酶PKR介导的。《维罗尔杂志》。2007;81:11148–11158. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Glass WG、Lim JK、Cholera R、Pletnev AG、Gao JL、Murphy PM。趋化因子受体CCR5促进白细胞向大脑的转运，并在西尼罗河病毒感染中促进存活。《实验医学杂志》。2005;202:1087–1098. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Goriely S、Molle C、Nguyen M、Albarani V、Haddou NO、Lin R、De Wit D、Flamand V、Willems F、Goldman M。干扰素调节因子3参与Toll样受体4（TLR4）和TLR3诱导的IL-12p35基因激活。鲜血。2006;107:1078–1084.[公共医学][谷歌学者]
  • Goriely S、Neurath MF、Goldman M。微生物如何打破白细胞介素-12家族成员之间的平衡。国家免疫学评论。2008;8:81–86.[公共医学][谷歌学者]
  • Gould LH，Fikrig E.西尼罗河病毒：越来越令人担忧？临床投资杂志。2004;113:1102–1107. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 西尼罗河病毒在西半球的持续传播。临床传染病。2007;45:1039–1046.[公共医学][谷歌学者]
  • Heil F、Hemmi H、Hochrein H、Ampenberger F、Kirschning C、Akira S、Lipford G、Wagner H、Bauer S。通过类toll受体7和8对单链RNA进行物种特异性识别。科学。2004;303:1526–1529.[公共医学][谷歌学者]
  • Hemmi H、Takeuchi O、Kawai T、Kaisho T、Sato S、Sanjo H、Matsumoto M、Hoshino K、Wagner H、Take da K、Akira S.类Toll受体识别细菌DNA。自然。2000;408:740–745.[公共医学][谷歌学者]
  • Hemmi H、Kaisho T、Takeuchi O、Sato S、Sanjo H、Hoshino K、Horiuchi T、Tomizawa H、Takeda K、Akira S。小型抗病毒化合物通过TLR7 MyD88依赖性信号通路激活免疫细胞。自然免疫学。2002;三:196–200.[公共医学][谷歌学者]
  • Hemmi H、Kaisho T、Takeda K、Akira S。Toll样受体9、MyD88和DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位在两种不同的CpG DNA对树突状细胞亚群的影响中的作用。免疫学杂志。2003;170:3059–3064.[公共医学][谷歌学者]
  • Hornung V、Rothenfusser S、Britsch S、Krug A、Jahrsdorfer B、Giese T、Endres S、Hartmann G。人类外周血单个核细胞亚群中toll样受体1–10 mRNA的定量表达和对CpG寡核苷酸的敏感性。免疫学杂志。2002;168:4531–4537.[公共医学][谷歌学者]
  • Juedes AE，Ruddle NH。常驻和浸润性中枢神经系统APC调节实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生和消退。免疫学杂志。2001;166:5168–5175.[公共医学][谷歌学者]
  • Kattah MG、Wong MT、Yocum MD、Utz PJ。对Toll样受体配体刺激反应而分泌的细胞因子调节人类Th17细胞的分化。大黄性关节炎。2008;58:1619–1629. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kohyama S、Ohno S、Isoda A、Moriya O、Belladonna ML、Hayashi H、Iwakura Y、Yoshimoto T、Akatsuka T、Matsui M。IL-23通过部分涉及IL-17的机制增强宿主对痘苗病毒感染的防御。免疫学杂志。2007;179：3917–3925。[公共医学][谷歌学者]
  • Kulkarni AB、Mullbacher A、Blanden RV。巨噬细胞、B细胞和脾树突状细胞作为抗原提呈细胞在西尼罗河病毒特异性小鼠T淋巴细胞增殖中的功能分析。免疫细胞生物学。1991;69:71–80.[公共医学][谷歌学者]
  • Kurt-Jones EA、Popova L、Kwinn L、Haynes LM、Jones LP、Tripp RA、Walsh EE、Freeman MW、Golenbock DT、Anderson LJ、Finberg RW。模式识别受体TLR4和CD14介导对呼吸道合胞病毒的反应。自然免疫学。2000;1:398–401.[公共医学][谷歌学者]
  • Laouar Y、T镇、Jeng D、Tran E、Wan Y、Kuchro VK、Flavell RA。树突状细胞中TGF-β信号转导是控制自身免疫性脑脊髓炎的先决条件。美国国家科学院院刊。2008;105:10865–10870. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lund JM、Alexopoulou L、Sato A、Karow M、Adams NC、Gale NW、Iwasaki A、Flavell RA。Toll样受体7对单链RNA病毒的识别。美国国家科学院院刊。2004;101：5598–5603。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Magram J、Connaughton SE、Warrier RR、Carvajal DM、Wu CY、Ferrante J、Stewart C、Sarmiento U、Faherty DA、Gately MK。IL-12缺陷小鼠在IFNγ产生和1型细胞因子反应方面存在缺陷。免疫。1996;4:471–481.[公共医学][谷歌学者]
  • Mattner F、Magram J、Ferrante J、Lanois P、Di Padova K、Behin R、Gately MK、Louis JA、Alber G。缺乏白细胞介素-12的遗传抗性小鼠容易感染大型利什曼原虫，并产生极化的Th2细胞反应。欧洲免疫学杂志。1996;26:1553–1559.[公共医学][谷歌学者]
  • Napolitani G、Rinaldi A、Bertoni F、Sallusto F、Lanzavecchia A。所选Toll样受体激动剂组合可协同触发树突状细胞中的T辅助型1极化程序。自然免疫学。2005;6:769–776. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Qureshi ST、Medzhitov R.Toll样受体及其在微生物感染实验模型中的作用。基因免疫。2003;4:87–94.[公共医学][谷歌学者]
  • Rassa JC、Meyers JL、Zhang Y、Kudaravalli R、Ross SR。小鼠逆转录病毒通过与toll样受体4的相互作用激活B细胞。美国国家科学院院刊。2002;99:2281–2286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 关于F，Strominger JL。Toll样受体2（TLR2）和TLR4对人类树突状细胞有不同的激活作用。生物化学杂志。2001;276:37692–37699.[公共医学][谷歌学者]
  • Roeder A、Kirschning CJ、Rupec RA、Schaller M、Weindl G、Korting HC。Toll样受体是先天性抗真菌免疫的关键介质。Med Mycol公司。2004;42:485–498.[公共医学][谷歌学者]
  • Schlaepfer E、Audige A、Joller H、Speck RF。TLR7/8触发在急性和潜在HIV感染中发挥相反的作用。免疫学杂志。2006;176:2888–2895.[公共医学][谷歌学者]
  • Shrestha B，Diamond MS。CD8+T细胞在控制西尼罗河病毒感染中的作用。《维罗尔杂志》。2004;78:8312–8321. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shrestha B，Diamond MS。Fas配体相互作用有助于CD8+T细胞介导的控制中枢神经系统中的西尼罗河病毒感染。《维罗尔杂志》。2007;81:11749–11757. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shrestha B、Samuel MA、Diamond MS。CD8+T细胞需要穿孔素才能从受感染的神经元中清除西尼罗河病毒。《维罗尔杂志》。2006;80：119–129。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shrestha B，Zhang B，Purtha WE，Klein RS，Diamond MS。肿瘤坏死因子-α通过促进单核白细胞进入中枢神经系统，防止致命的西尼罗河病毒感染。《维罗尔杂志》。2008;82:8956–8964. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sitati EM，Diamond MS。从中枢神经系统清除西尼罗河病毒需要CD4+T细胞反应。《维罗尔杂志》。2006;80:12060–12069. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sitati E、McCandless EE、Klein RS、Diamond MS。CD40–CD40配体相互作用促进CD8+T细胞进入大脑并保护其免受西尼罗河病毒性脑炎的侵袭。《维罗尔杂志》。2007;81:9801–9811. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • T镇、Jeng D、Alexopoulou L、Tan J、Flavell RA。小胶质细胞通过TLR3识别双链RNA。免疫学杂志。2006;176:3804–3812.[公共医学][谷歌学者]
  • T镇、拉乌尔Y镇、皮滕格C镇、莫里T镇、加利福尼亚州斯克利镇、谭J镇、杜曼RS镇、弗拉维尔RA镇。阻断TGF-β-Smad2/3先天免疫信号可缓解阿尔茨海默病样病理。自然医学。2008;14:681–687. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Triantafilou K、Vakakis E、Orthopoulos G、Ahmed MA、Schumann C、Lepper PM、Triantafillou M.TLR8和TLR7参与宿主对人类细小病毒1的免疫反应。欧洲免疫学杂志。2005;35:2416–2423.[公共医学][谷歌学者]
  • van de Vosse E、Lichtenauer-Kaligis EG、van Dissel JT、Ottenhoff TH。白介素-12/白介素-23受体（beta1）链的遗传变异，以及对IL-12和IL-23受体结构和功能的影响。免疫遗传学。2003;54:817–829.[公共医学][谷歌学者]
  • Venter M，Myers TG，Wilson MA，Kindt TJ，Paweska JT，Burt FJ，Leman PA，Swanepoel R.感染不同神经毒力西尼罗河病毒株小鼠的基因表达。病毒学。2005;342:119–140.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang T，Anderson JF，Magnarelli LA，Wong SJ，Koski RA，Fikrig E.用重组包膜蛋白对小鼠进行西尼罗河病毒免疫。免疫学杂志。2001;167:5273–5277.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang T、Scully E、Yin Z、Kim JH、Wang S、Yan J、Mamula M、Anderson JF、Craft J、Fikrig E.IFN-γ-δT细胞有助于控制小鼠西尼罗河病毒感染。免疫学杂志。2003年a月；171:2524–2531.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang Y，Lobigs M，Lee E，Mullbacher A.CD8+T细胞介导西尼罗河病毒性脑炎的恢复和免疫病理。《维罗尔杂志》。2003年b；77:13323–13334. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang T、Town T、Alexopoulou L、Anderson JF、Fikrig E、Flavell RA。Toll样受体3介导西尼罗河病毒进入大脑，导致致命性脑炎。自然医学。2004;10:1366–1373.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang R，Town T，Gokarn V，Flavell RA，Chandawarkar RY。HSP70通过与脂筏相关TLR-7相互作用，上调p38 MAPK和PI3K通路，增强巨噬细胞吞噬功能。外科研究杂志。2006;136:58–69.[公共医学][谷歌学者]
  • Yamamoto M、Takeda K、Akira S.TIR域包含适配器定义了TLR信号的特异性。分子免疫学。2004;40:861–868.[公共医学][谷歌学者]
  • Zucchini N、Bessou G、Traub S、Robbins SH、Uematsu S、Akira S、Alexopoulou L、Dalod M。前沿：TLR7和TLR9在先天防御疱疹病毒感染方面的重叠功能。免疫学杂志。2008;180:5799–5803.[公共医学][谷歌学者]