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基因组研究。2009年7月；19(7): 1279–1288.
数字对象标识：10.1101/gr.089417.108
预防性维修识别码：PMC2704428型
PMID：19470664

通过模块化组装构建锌指核酸酶在人细胞中的靶向基因组编辑

Hye Joo Kim先生,1,2,三 Hyung Joo Lee（李贤珠）,1,三 Hyojin Kim先生,1 Seung Woo Cho先生,1和金素金1,2,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

锌指核酸酶（ZFN）技术允许在研究、医学和生物技术中进行靶向基因组编辑，但由于缺乏方便、快速和公开可用的合成功能性ZFN的方法，该技术的广泛应用受到了阻碍。在这里，我们描述了一种高效且易于实践的模块组装方法，使用公开可用的锌指制造ZFN，可以修改人类细胞中预定基因组位点的DNA序列。我们合成并测试了数百个ZFN，以针对人体中的数十个不同部位CCR5号机组一种HIV感染所需的共受体基因，并发现其中许多核酸酶在CCR5号机组顺序。因为人类细胞CCR5号机组空突变是功能性和正常的，这些ZFN可能用于（1）淘汰CCR5号机组在艾滋病患者中产生抗艾滋病毒感染的T细胞，或（2）在基因治疗应用中的“安全部位”插入治疗基因。

锌指核酸酶（ZFNs）是一种人工DNA限制酶，由定制的DNA-结合锌指蛋白和来源于FokI内切酶的非特异性核酸酶域组成(Kim等人，1996年). ZFN可用于哺乳动物、植物和其他高等真核细胞和生物体的有效基因改造(Bibikova等人，2002年,2003;Lloyd等人，2005年;Urnov等人，2005年;Wright等人，2005年;Beumer等人，2006年;Morton等人，2006年;Doyon等人，2008年;Maeder等人2008;Meng等人，2008年;圣地亚哥等人，2008年). 事实上，ZFN技术在细胞工程、动植物生物技术和基因治疗等领域具有广阔的应用前景。

ZFN的锌指（ZF）部分由三个或四个串联排列的ZF模块组成，每个模块可识别3-bp子网站。ZFN既是同源二聚体又是异源二聚体，因此可以识别基因组中18至24 bp的序列元素。各种体外和体内选择方法可用于构建ZF阵列(Rebar和Pabo 1994年;格雷斯曼和巴博1997;Joung等人，2000年;Bae等人，2003年;Hurt等人，2003年;Bae和Kim 2006年;Maeder等人，2008年). 这些基于选择的方法可能产生有效的ZF蛋白，但劳动密集且耗时。

构建ZF阵列的另一种方法是使用标准重组DNA技术对预先表征的ZF进行模块化组装(Bae等人，2003年;Wright等人，2006年;天主教徒和钟2008;Ramirez等人，2008年). Sangamo Biosciences使用自己的模块组装方法高效构建了靶向人类细胞中两个内源性基因组位点和中国仓鼠卵巢细胞中一个位点的ZFN(Urnov等人，2005年;Perez等人，2008年;圣地亚哥等人，2008年). 然而，并非所有用于这些研究的ZF的氨基酸序列都有报道，因此，该方法目前尚不适用于学术界(斯科特2005;威尔逊2008).

最近，Ramirez等人（2008年）报告了模块化组装ZFN的意外高故障率。与Sangamo Biosciences不同的是，Sangamo生物科学公司从其专有的双指模块存档中组装四指ZFN，Ramirez等人（2008年）使用公开可用的单指库来组装三指ZFN。尽管这种方法应该允许任何研究人员通过使用标准重组DNA技术连接ZF模块来容易地组装ZFN，并且已经产生了成功修改基因组序列的ZFN果蝇属(Beumer等人，2006年,2008)和秀丽隐杆线虫(Morton等人，2006年)，值得注意的是，迄今为止，通过这种方法构建的ZFN没有修改过人类或其他哺乳动物细胞中的单个内源性基因组位点。然而，我们对Ramirez等人（2008年）以及重新检查我们自己的数据(Bae等人，2003年)Ramirez等人引用的研究表明，可以修改哺乳动物细胞中特定基因组位点的模块化组装ZFN的成功率可能取决于人们对ZF模块的选择。

在这里，我们报道了通过精心选择的ZFs模块化组装构建的基因组修饰ZFN的成功生产。我们收集了数百个靶向人类细胞中数十个基因组位点的ZFN，发现其中许多ZFN具有基因组编辑活性。我们的方法为ZFN设计提供了一个快速、易于实践且公开可用的平台。

结果

ZFN设计和合成

为了测试我们的ZFN组装方法，我们设计并合成了靶向人类趋化因子（C-C基序）受体5的ZFNs(CCR5号机组)基因。CCR5蛋白是人类免疫缺陷病毒（HIV）用来感染靶细胞的主要共受体，是用Sangamo Biosciences生成的ZFN成功编辑的两个人类基因之一(Urnov等人，2005年;Perez等人，2008年). 失效的ZFNCCR5号机组可以用于产生对HIV感染具有抵抗力的免疫细胞，这为开发治疗艾滋病的新型基因治疗方法带来了希望。此外CCR5号机组基因座可能为插入治疗基因提供一个“安全港”(Camenisch等人，2008年;天主教徒和钟2008)，因为自然发生32-bp纯合缺失的个体CCR5号机组(CCR5Δ32）健康，与CCR5Δ32个杂合或野生型个体(Liu等人，1996年).

为了组装我们的ZFN，我们首先选择了54个具有不同DNA绑定特性的ZF模块。在这54个ZF模块中，31个来自人类基因组中的DNA序列，两个来自果蝇属基因组（称为“ToolGen模块”）。这些天然存在的ZF被反复用于调节细菌、酵母和哺乳动物细胞中的许多基因(Bae等人，2003年;Lee等人，2003年,2004;Park等人，2003年,2005年a,b条;Kwon等人，2006年;Yun等人，2008年). 其余21个ZF模块要么是使用噬菌体展示从ZF变体库中选择的（Barbas模块）(Dreier等人，2000年,2001,2005;Liu等人，2002年)或通过定点突变产生（Sangamo模块）(Liu等人，2001年)和被选为补充ToolGen模块的DNA绑定特性。

接下来，对于多指ZFN的设计，我们使用了一种计算机算法（可在http://www.toolgen.com/ZFNfinder)以确定其DNA序列中潜在的ZFN靶点CCR5号机组编码区域。由于ZFN作为二聚体发挥作用，需要制备两个ZFN单体以靶向单个DNA位点。构成ZFN对的两个单体ZFN中的每一个都与两个由5或6 bp间隔序列分隔的9或12 bp半位点中的一个结合。这些ZFN包含三个或四个ZF模块，每个模块识别一个3 bp的子站点。对于单个半位，可以设计多个单体ZFN，它们由具有相同或类似DNA结合特性的不同组ZFs组成。因此，可以使用许多组合ZFN对瞄准单个站点。我们合成了208个ZFN单体，并在33个基因组位点测试了315对ZFN对。

ZFN活性的体内外检测

首先，使用体外转录和翻译（IVTT）系统制备ZFN，并与含有CCR5号机组编码序列，以评估其体外DNA限制活性。如补充图1所示，许多ZFN对（44%）显示了靶DNA的有效（即>5%）位点特异性切割。然后，我们使用基于哺乳动物细胞的单链退火（SSA）系统测试这些ZFN是否能够在人类细胞中诱导同源重组(Chames等人，2005年). 编码ZFN的质粒被转染到人类胚胎肾细胞（HEK293细胞），其基因组包含稳定整合的部分复制的萤火虫荧光素酶被插入CCR5号机组顺序。有效的ZFN将在CCR5号机组序列，它应该允许荧光素酶通过SSA恢复基因。通过测量荧光素酶活性，可以估计ZFN切割DNA的效率。以巨核酶I-SceI作为阳性对照。

如所示图1，许多ZFN对在此分析中产生了显著的荧光素酶活性。在315对ZFN中，与I-SceI相比，23对显示了15%–57%的荧光素酶活性。活性<15%的ZFN对仍可能在细胞中诱导DSB，但我们将重点放在高活性的23对上进行进一步研究。当我们使用无靶向报告细胞时，这23个ZFN二聚体没有产生显著的荧光素酶活性，其基因组包含部分重复的荧光素酶基因被与CCR5号机组（未显示数据）。这些结果表明ZFN介导的DNA修复是CCR5号机组-具体而言。总的来说，这23个活跃的ZFN对旨在针对CCR5号机组基因。在IVTT试验中，这23对均显示出较强的核酸内切酶活性。

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使用基于细胞的单链退火（SSA）系统评估ZFN活性。(A类)单线退火系统的示意图。将ZFN表达质粒转染到HEK293细胞中，该细胞的基因组含有一个不活跃、部分重复和破坏的基因荧光素酶基因。如果ZFN裂解细胞中的靶点，DNA可以通过SSA机制有效修复荧光素酶基因恢复了。(B类)表达各种ZFN的细胞的荧光素酶活性。p3（灰条）为空质粒，用作阴性对照。目标序列包含I-SceI的识别位点，用作阳性对照。每个ZFN对的活性被报告为相对于I-SceI对照的百分比。指出了ZFN对及其组成单体。进一步研究中使用的ZFN对用三角形标记。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差（误差线）。黑色和白色条分别表示活动和非活动的ZFN。P（P）-使用学生的t吨-测试；(*)P（P）< 0.01; (**)P（P）<0.001（p3对照vs.ZFN）。

ZFNs对HEK293细胞的突变检测

接下来，我们研究了在IVTT试验中显示内切酶活性和在基于细胞的试验中诱导荧光素酶活性的ZFN是否可以修改细胞中的内源性靶序列。由ZFN诱导的DSB可以通过易出错的非同源末端连接（NHEJ）进行修复(Bibikova等人，2002年;Morton等人，2006年). 由此产生的DNA通常在DSB位点附近包含小的插入或缺失（“indel”突变）。通过用错配敏感的T7内切酶I（T7E1）处理扩增的DNA片段，可以在体外检测到这些indel突变(图2A).

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ZFN介导的人类细胞基因组编辑。(A类)使用T7E1分析进行失配检测的原理图概述。从编码ZFN的质粒转染的细胞中纯化基因组DNA。对包含ZFN识别位点的DNA片段进行PCR扩增，并对DNA扩增子进行熔化和退火。如果DNA扩增子同时包含野生型和突变的DNA序列，就会形成异源双链。T7E1识别并裂解异双工，但不识别同双工。琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段；给出了理想凝胶结果的示意图。(B类)T7E1分析显示ZFN介导的基因组修饰。ZFN对显示在顶部琼脂糖凝胶。产生的DNA带的预期位置由箭头（未切割）和括号（切割）表示左边凝胶面板。p3是用作阴性对照的空质粒。桑加莫的CCR5号机组-本试验包括靶向ZFN对（Sangamo CCR5）。(C)Z836 ZFN对靶向基因组位点的DNA序列。（下划线）ZFN识别元素。（破折号）删除；（小写字母）插入基数。在多次检测到突变的情况下，出现的次数显示在括号中。（wt）野生型。(D类)不同ZFN靶向位点的突变类型。每个ZFN对的缺失、插入和复杂突变数（如C对Z836）进行了统计，并绘制了这些事件的百分比。

用编码ZFN对的质粒转染HEK293细胞，72小时后分离基因组DNA。为了评估ZFN的基因组编辑活动，对包含ZFN靶位点的DNA片段进行PCR-扩增，然后用T7E1处理。如所示图2BZFN处理的细胞扩增的DNA的小部分被T7E1切割。每个ZFN对都产生不同的解理模式，反映出这些ZFN针对八个不同的位点（补充图2）。此外，所得DNA条带的大小与预期相符。在T7E1分析中测试的23对ZFN对中，21对显示了预期大小的可检测DNA带（数据未显示）。我们还使用T7E1分析测试了在IVTT分析中未显示显著核酸内切酶活性或在基于细胞的SSA系统中未产生显著荧光素酶活性但通过IVTT测试的代表性ZFN对。这些ZFN对均未诱发可检测到的DNA突变水平（数据未显示）。

我们选择了八个具有代表性的ZFN对进行进一步研究，每一对都针对CCR5号机组基因(表1). 从转染了八对ZFN中每一对的细胞中扩增出的DNA被克隆并测序。在DSB位点附近观察到各种缺失和插入(图2C、D; 补充图3）。这些突变模式是容易出错的NHEJ相关突变的特征，其他人也报道过类似的模式(Bibikova等人，2002年;Morton等人，2006年;圣地亚哥等人，2008年).

表1。

显示人类细胞中高效基因组编辑的ZFN列表

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显示了针对不同站点的代表性ZFN。ZFN对由两个单体组成。例如，Z266对由Z266R4和Z266F4组成。锌手指使用四个字母的代码命名。工程锌指是用小写字母书写的，自然产生的锌指是用大写字母书写的。F1是N端的锌指，F4是C端的锌手指。F2和F3是位于F1和F4之间的手指。F1在3′末端与3-bp子网站相互作用，F4在5′末端与3bp子网站交互作用。锌指通过标准的“TGEKP”序列相互连接，以形成ZFN。指出了每个半位点序列中GNN基序的数量。

针对不同位点的8对ZFN显示2.4%–17%的突变率，这是通过将突变克隆数除以所分析的总克隆数来计算的。ZFN诱导突变的这些高效性表明，只需筛选10–100个单细胞衍生菌落即可分离出克隆突变细胞。

ZFN处理后克隆细胞的分离

其他研究表明，某些ZFN具有非靶向效应，在哺乳动物细胞中表达时具有细胞毒性(Miller等人，2007年;Szczepek等人，2007年). 为了研究携带ZFN诱导突变的哺乳动物细胞是否生长受损，从而被未修饰的细胞生长，我们在ZFN转染后3、6和9天用从细胞中分离的DNA进行了T7E1测定。我们选择Z891对进行此分析，如所示图3A与第3天的DNA片段相比，第6天的断裂DNA片段减少，在ZFN治疗后第9天几乎检测不到。这些结果表明，ZFN介导的突变确实对细胞生长具有细胞毒性作用。

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强制性异二聚体ZFN和突变克隆的分离。(A类)野生型和强制性异二聚体ZFN的时间进程分析。在不同的时间点用从不同形式FokI核酸酶域处理的细胞中分离的DNA进行T7E1错配检测。（WT）野生型核酸酶结构域；（RR/DD或KK/EL）强制性异二聚核酸酶结构域。(B类)TP53BP1染色检测ZFN诱导的DSB。将野生型和强制性异二聚体Z891 ZFN对转染到HEK293T/17细胞中，转染后第2天通过免疫荧光检测细胞内TP53BP1病灶。采用足叶乙甙（1μM）作为阳性对照。绘制了TP53BP1病灶数量的分布图。在两次独立测量中，每个治疗组至少分析100个细胞。(C)突变克隆的DNA序列。通过限制稀释，从用RR/DD ZFN二聚体处理的细胞中分离出7个突变克隆。显示了这些克隆细胞中靶位点的DNA序列。（破折号）删除用破折号表示；（小写字母）插入基数。克隆1a和1b表示由单个克隆中的双等位基因修饰产生的DNA序列。

ZFN的非靶向效应主要是由形成同二聚体和异二聚体的ZFN单体的活性引起的。使用形成异二聚体但不能形成同二聚体的FokI核酸酶变体可以显著降低这些影响(Miller等人，2007年;Szczepek等人，2007年). 因此，为了减少ZFNs的细胞毒性作用，我们在T7E1试验中制备并测试了两种不同类型的这些所谓的强制性异二聚体（显示为“RR/DD”二聚体和“KK/EL”二聚物图3A). T7E1测定显示，当用RR/DD-ZFN对转染细胞而不是用KK/EL对转染细胞时，即使在ZFN处理后9天，切割的DNA片段仍然存在。

为了证实强制性异二聚体ZFN的细胞毒性降低是由于其增强了细胞中DNA切割的特异性，我们使用TP53BP1（也称为53BP1）抗体分析了ZFN处理细胞中DSB的数量，TP53BPl是一种招募到DSB的蛋白质(Schultz等人，2000年). 如所示图3B与相应野生型ZFN对处理的细胞相比，RR/DD ZFN组处理的细胞TP53BP1病灶数量显著减少。

在筛选了225个在96周平板中分别生长的单细胞集落后，随后使用RR/DD ZFN对分离出7个不同的突变克隆HEK293细胞。我们检查了CCR5号机组以确认ZFN诱导的基因组修饰。因为三体染色体(Bylund等人，2004年)，HEK293细胞携带三份CCR5号机组他们基因组中的基因。对修饰细胞基因组的DNA序列分析显示，其中6个克隆显示出单等位基因缺失或插入，1个克隆在CCR5号机组基因(图3C). 在表现出双等位基因修饰的克隆中，观察到两个不同的indel序列以及一个未经修饰的野生型序列。ZFN处理的这种高频率的双等位基因修饰表明，纯合敲除细胞可以在不使用选择标记的情况下一步分离出来。

非目标效应CCR5号机组-针对同源的ZFN中央控制室2地点

这个中央控制室2该基因与CCR5号机组基因，以及许多CCR5号机组ZFN识别元素保存在中央控制室2轨迹。因此，我们检查了为CCR5号机组这些位点也可以在中央控制室2轨迹。三个ZFN对（Z360、Z410和Z430）在中央控制室2在T7E1试验中，该基因能够诱导有效的基因组修饰(图4). 在中央控制室2基因，Z891对的识别元件由一个12 bp的半位点组成，该半位点与CCR5号机组基因和一个12 bp的半位点带有一个碱基错配。正如预期的那样，这对ZFN在中央控制室2现场。（我们还测试了桑加莫的CCR5号机组-以ZFN对为目标，其识别元素位于中央控制室2该位点在每个12-bp半位点中都包含一个碱基错配[Perez等人，2008年]并证实该ZFN在同源基因中央控制室2场地[图4].) 相反，ZFN对（Z30、Z266和Z836）的识别元件位于中央控制室2轨迹显示至少两个不匹配。

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ZFN在中央控制室2轨迹。(A类)ZFN识别元件CCR5号机组和中央控制室2基因座。ZFN对在左边DNA序列。（括号）CCR5号机组和中央控制室2位点；（小写粗体字母）不匹配的基础；（下划线）半位ZFN识别元素。(B类)T7E1分析中央控制室2地点。PCR-扩增DNA对应于中央控制室2来自用ZFN对处理的细胞的编码区（显示在顶部凝胶板的）进行分析。（+）导致修改的ZFN对中央控制室2地点。p3是用作阴性对照的空质粒。桑加莫的CCR5号机组-本试验包括靶向ZFN对（Sangamo CCR5）。

我们还检测了通过转染带有Z891对的HEK293细胞获得的七个突变克隆细胞是否诱导了高度同源的中央控制室2除预期场地外CCR5号机组现场。尽管这一对在中央控制室2现场以及CCR5号机组T7E1分析中的位点，如上所述(图4)，的中央控制室2该位点在这些克隆细胞系中没有突变。这些结果表明，有可能分离出克隆细胞，其中只有预期的靶位点，而不是同源位点在ZFN处理后被筛选细胞突变。

ZFN分析总结

为了瞄准人类体内的不同部位CCR5号机组我们合成了208个ZFN单体，并测试了315对ZFN对的DNA限制和基因组编辑活性。总的来说，这315对目标是CCR5号机组基因。许多ZFN（44%）能够在体外有效地切割靶DNA，但只有一小部分ZFNs（7.3%）能够在基于细胞的SSA系统中有效发挥作用。大多数在基于细胞的分析中显示出显著活性的ZFN（23个中的21个）在预期内源性位点诱导了有效的基因组修饰（补充表1）。这些结果表明，基于细胞的SSA系统，而不是体外DNA消化试验，是评估ZFN基因组编辑潜力的可靠方法。这21对ZFN组合针对八个不同的站点。因此，在33个位点中，有8个位点被至少一个ZFN对成功修改，我们的方法的总成功率为24%。

我们观察到四指ZFN（由两个四指ZFF单体组成的ZFN对）的成功率高于三指ZFNs(P（P）<0.05，学生的t吨-测试；补充表2）。因此，26%的潜在切割位点被四指ZFN成功靶向，而只有9.1%的潜在位点被三指ZFN靶向。由一个四指ZFN和一个三指ZFN组成的ZFN对的成功率（12%）介于上述两类之间。

虽然9.1%到26%的成功率是可以接受的，但我们认为这个范围低估了我们的系统的可能性。首先，我们只选择那些在基于细胞的SSA系统中与I-SceI相比显示至少15%荧光素酶活性的ZFN进行后续分析。未通过此测试的ZFN可能仍在基因组编辑中处于活动状态。其次，使用凝胶电泳，T7E1分析无法确定是否存在<1%的修改序列。允许<1%基因组修饰的ZFN在某些应用中可能仍然有用，但这些ZFN无法在本试验中识别。第三，诱变NHEJ过程通常会产生大量缺失(Morton等人，2006年)T7E1分析可能无法检测到。

模块交换分析

接下来，我们研究了为什么我们通过模块化组装制造ZFN的方法在基因组编辑中获得了高成功率，但其他类似的方法却没有(天主教与Joung 2008;Ramirez等人，2008年). 关键差异可能存在于ZF模块中。此前，我们报道，与通过噬菌体展示或定点突变分离的工程化ZF相比，自然产生的ZF是构建定制DNA结合蛋白的更好构建块(Bae等人，2003年). 在我们的研究中，许多显示高效基因组编辑的功能性ZFN实际上完全由自然发生的模块组成(表1). 为了测试模块源是否是构建功能性ZFN的关键决定因素，我们进行了模块交换实验，将由自然发生的模块制成的ZFN替换为由工程ZFs（即Barbas或Sangamo模块）生成的ZFNs，这些ZFN显示出相同的DNA结合特异性。

为此，我们制备了八种专门由Barbas或Sangamo模块组成的新型ZFN单体，并用它们取代了六种专门由ToolGen模块组成的不同ZFN单体（补充表3）。这些新的ZFN单体中的每一个都与适当的合作伙伴ZFN单体配对，并在SSA和T7E1分析中测试得到的ZFN对。如所示图5，由这些新合成的ZFN单体中的至少一个组成的所有ZFN对在SSA系统中均未表现出任何显著活性(P（P）<0.05，学生的t吨-测试）。此外，在T7E1分析中，这些ZFN均未显示任何可检测的基因编辑活性。

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模块交换分析。使用工程化的ZFs制备了新的ZFN，以测试这些ZFN是否能够在功能上取代仅由识别相同序列的自然发生模块组成的ZFNs。这些ZFN的名称由Z号表示(A类)的底部或(B类)的顶部凝胶面板。名称以“B”开头的ZFN单体（如“BR4”）专门由Barbas模块组成，而名称以“S”开头的单体（例如“SR4”）则专门由Sangamo模块组成。补充表4描述了构成这些ZFN的ZF。这些ZFN使用(A类)基于信元的SSA系统和(B类)T7E1分析。(A类)表达各种ZFN的细胞的荧光素酶活性。（灰条）p3为空质粒，用作阴性对照。靶序列包含I-SceI的识别位点，其被用作阳性对照。每个ZFN对的活性报告为相对于I-SceI对照的百分比。指出了ZFN对及其组成单体。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差（误差线）。(B类)T7E1分析显示ZFN介导的基因组修饰。ZFN对及其组成单体如顶部琼脂糖凝胶。（+）导致阳性基因编辑事件的ZFN对。

这些结果有力地支持了我们之前的结论，即自然发生的ZF构成了比工程ZF更可靠的功能ZF阵列模块化组装框架(Bae等人，2003年). 然而，应该注意的是，Sangamo Biosciences使用的是两个手指而不是一个手指模块(Urnov等人，2005年). Barbas小组证明，通过仅将适当ZF的碱基接触α螺旋接枝到给定的ZF框架上构建的新ZF阵列比通过整个ZF域的模块化组装构建的阵列更有效(Beerli等人，1998年).

评估ZF模块

我们对315对ZFN进行的统计分析可以为设计新的ZFN提供依据，这些ZFN可用于对其他感兴趣的内源性基因进行靶向突变。为此，我们统计了SSA系统中得分为正的23对ZFN中每个ZF的出现次数。然后，我们通过将该数字除以模块在所有208个ZFN单体中的出现次数来确定每个ZF的“活动分数”（补充表4）。某些高度活跃的ZF，例如“QNTQ”和“RSHR”，活动得分分别为50%和38%；这些高分表明，这些模块在预测体内位点特异性核酸酶活性方面是可靠的。其他ZF，如“QSNK”和“rdae”，在我们的分析中被证明是低效模块，活性得分为零。这两种ZF各使用15次，但在我们的分析中，没有一种含有这些模块的ZFN是有效的。可靠的ZF和低效的ZF之间的活动得分差异具有统计学意义(P（P）<0.05，学生的t吨-测试）。

我们还比较了具有相同DNA识别特异性的ZF的活性分数。某些ZF明显优于其他目标等效模块(P（P）<0.05，学生的t吨-测试）。例如，“DSNR”和“HSNK”识别相同的GAC序列。在构建ZFN时使用“DSNR”产生了许多活性核酸酶（活性分数=35%），而加入“HSNK”只产生了非活性ZFN（活性分数=0%）。

根据我们的分析，我们初步推荐37个ZF（24个ToolGen模块、1个Sangamo模块和12个Barbas模块）用于未来的基因编辑研究（补充表4）。这37个模块都至少在活动的ZFN中发现一次。如果我们在实验中只使用这37个模块，我们将合成78个ZFN单体（但不是208个单体），测试82个ZFN对（但不是315对），总成功率可能是53%，这比当前的成功率（24%）有显著提高。37个采埃孚共同承认64个3 bp子公司中的38个。对于给定的1 kb随机DNA序列，我们预测将有88[=（38/64）6三指ZFN二聚体的×1000×2]个潜在靶位点（在半位点之间包含5或6个碱基间隔）和四指ZFN2聚体的31个靶位点。假设我们的方法的成功率为9.1%–26%（如果我们使用37个ZF，而不是其他低效模块，实际成功率可能会明显更高），则平均而言，ZFN介导的基因组编辑可以在1-kb靶序列中的8个位点进行。这表明，即使不是全部，也可以用我们的ZFN组装方法编辑大多数真核基因。

讨论

ZFN已经成为反向基因研究和生物技术的重要新工具。尽管人们对这项技术有着广泛的兴趣，但目前还没有一种方便、稳健、易于实践的方法来生产功能性ZFN，这对于整个研究团体来说都是不可用的。使用ZFN技术的最关键参数是如何制作有效且特异的ZF阵列，以选择性地结合预定的DNA序列。目标站点组成似乎在功能性ZFN的设计中特别关键。事实上，大多数之前的研究(Bibikova等人，2002年;Lloyd等人，2005年;Morton等人，2006年)在模型生物中，使用靶向GNN重复序列的ZFN，例如5′-GNNGNN-3′。然而，这些序列在特定的感兴趣基因中很少出现。例如，可以设计一个三指ZFN对来靶向GNN重复DNA序列5′-NNCNNCNNNNNNNNNNGNNNGNN-3′，该序列在4096-bp（=46)序列。四指ZFN的GNN重复位点更为稀少，平均每65536bp只出现一次（=48)顺序。因此，在许多感兴趣的基因中可能不存在这样的位点。在这方面，我们注意到，我们的大多数ZFN针对的是CCR5号机组无法识别GNN重复序列(表1). 在16种成功改性ZFN单体中CCR5号机组序列，只有两个（Z426F3和Z360R4）识别出GNN重复位点(表1)两个（Z430R3和Z30F4）识别出不含GNN基序的半位点元素，12个识别出包含GNN和非GNN基模的位点。定位GNN重复序列以外的位点的能力大大扩展了ZFN技术的用途。

最近，Ramirez等人（2008年）在仔细分析了数百种ZF蛋白的特性后，适当地提出了对制造ZFN的模块组装方法的关注，并建议使用更耗时和费力的选择系统。乍一看，他们的结论与我们的结果形成鲜明对比。使用模块组装方法，我们获得了四指（26%）和三指ZFN对（9.1%）的高成功率。

经过深入分析，我们确定了我们的方法与Ramirez等人（2008年）首先，Ramirez等人构建并表征了三指阵列，但不是四指阵列，而我们测试了四指和三指ZFN。如补充表1所示，当我们使用四指而非三指ZFN时，我们的成功率明显更高。此外，Sangamo Biosciences报告的所有活性ZFN由四个ZF组成。显然，四指蛋白与12-bp靶位点的结合比三指蛋白与9-bp靶位点结合更稳定、更特异。然而，四指ZFN二聚体的靶点长度为24 bp，这些靶点比结合三指ZFN2聚体的18 bp靶点出现的频率要低得多。在这方面，令人鼓舞的是，我们16种功能性ZFN单体中有6种由3种ZF组成(表1).

第二，Ramirez等人（2008年）在生成ZF数组时，没有混合不同来源的ZF（ToolGen、Sangamo和Barbas模块）。通过混合不同来源的ZFs，我们获得了9个（16个）功能性ZFN单体(表1).

第三，Ramirez等人所描述的大多数ZF阵列仅由通过噬菌体展示或定点突变（分别为Barbas或Sangamo模块）分离的ZF组成。相比之下，我们使用了许多自然出现的ZF（ToolGen模块）。我们的16种功能性ZFN单体中有7种完全由天然存在的ZFs组成，两对ZFN（八对代表性单体中的两对）由完全由自然存在的ZF组成的ZFN单体组成。除Z426R3外，我们研究中的所有其他功能性ZFN单体均含有至少两种天然ZF。模块交换实验证实了使用自然发生的ZF的重要性。我们使用工程化的ZFs合成的所有新ZFN都被发现效率低下，无法在功能上取代完全由自然发生的模块组成的ZFN。综上所述，所有这些发现都与之前的报告一致，即采用工程ZF的模块化组装不会产生功能性ZFN(Maeder等人，2008年;Ramirez等人，2008年).

为什么自然产生的ZF在生产含ZF活性蛋白方面比工程模块表现更好？我们以前讨论过这个问题(Bae等人，2003年). 简单地说，我们在这项研究和其他研究中使用的所有天然ZF(Lee等人2003,2004; Park等人，2003年，2005年a，b；Kwon等人（2005年、2006年）通过严格的基于细胞的检测进行了筛选。这些ZF可能比通过其他方式选择的ZF更适合混合和匹配。然而，我们注意到，当与天然模块一起使用时，Sangamo和Barbas模块有助于扩展ZFN的DNA结合特性，并且我们的许多功能ZFN单体（16个中有9个）包含至少一个此类工程模块。

最近，Joung集团(Joung等人，2000年)和锌指财团成员(网址：www.zincfingers.org)报告了高效大肠杆菌-基于生产ZFN的选择系统（称为“开放式ZFN”）(Maeder等人，2008年). 这些开放式ZFN被证明能成功靶向人类和植物细胞中14个不同内源性DNA位点中的7个；因此，本研究的成功率为50%。（目前，开放式ZFN的目标位点仅限于那些富含GNN基序且不含CNN和ANN基序的位点。）重要的是，开放式QFN是在具有相同DNA结合特异性的ZFs池中选择的，与模块化组装不同，此选择过程可能会考虑相邻ZFs对DNA结合的上下文相关效应。然而，OPEN方法比模块组装方法更耗时且劳动密集，因为OPEN方法需要两轮预选大肠杆菌，结合DNA的ZF阵列，随后必须连接到FokI核酸酶结构域才能形成ZFN。

将我们的结果与Sangamo Biosciences的结果进行比较是有趣的，后者报告了CCR5号机组-由两个四指ZFN单体组成的靶向ZFN对(Perez等人，2008年). 因为我们使用了不同的ZF模块集，所以我们的ZFN针对的是CCR5号机组与Sangamo的ZFN对所识别的一个位点不同（补充图2）。这些ZFN可以为对ZFN介导的基因治疗应用感兴趣的研究人员提供多种选择。有人认为，天然发生的CCR5Δ32不仅是功能丧失突变，而且是功能获得突变(Chelli和Alizon 2001;Agrawal等人，2004年)，并且突变形式可能具有反式-对CCR5和CXCR4表达的抑制作用，这两种宿主共同受体在感染过程中被HIV使用。虽然Sangamo的ZFN靶向Δ32突变的上游，但我们的两个ZFN（Z836和Z891）靶向该突变的下游，使用这些ZFN产生的CCR5蛋白的突变形式可能保留反式-抑制作用，使细胞对HIV感染更具抵抗力。有趣的是，我们的一对ZFN在CCR5号机组这对ZFN可以产生CCR5变异体，该变异体模拟CCR5蛋白的一种自然发生的突变形式，这种突变形式只在亚洲人中观察到，是由+893的单碱基缺失引起的(Shioda等人，2001年).

ZFN的序列特异性在临床应用中特别重要。桑加莫的CCR5号机组-靶向ZFN对显示出在同源位点进行基因组编辑的效率中央控制室2基因，以及在CCR5号机组基因(Perez等人2008). 中断中央控制室2基因功能本身可能并不有害。但是，我们总是希望尽可能减少非特异性效应，以尽量减少基因治疗的潜在不良副作用。在我们尝试将这些试剂用于未来临床应用之前，还必须仔细描述我们的ZFN的非靶向效应。然而，我们确实注意到，我们的一些ZFN在中央控制室2轨迹。这些ZFN应该更适合于在基因治疗应用中靶向插入治疗基因，而不是在中央控制室2轨迹。

在这篇论文中，我们报道了利用模块化组装构建的ZFN在人类细胞的几个内源性位点成功地进行基因组修饰。据我们所知，本报告首次证明使用公开来源的模块化组装ZFN可以靶向哺乳动物细胞中的内源性位点。任何对使用ZFN技术感兴趣的研究人员都可以随时使用我们的方法。本文报告了本研究中使用的ZF模块的所有氨基酸序列，编码这些模块的大多数质粒可从Addgene获得(http://www.addgene.org/zfc). 我们相信，我们的模块组装方法为ZFN技术在研究、医学和生物技术中的广泛应用提供了一个高效、快速和易于实践的平台。

方法

质粒构建

锌指核酸酶结构

FokI内切酶结构域来源于奥氏黄杆菌基因组DNA被克隆到p3中，p3是pcDNA3.0质粒（Invitrogen）的修改版本。编码三指或四指阵列的DNA片段如前所述进行组装(Bae等人，2003年). 补充表5显示了ZFN及其目标序列的列表。补充图4显示了ZFN对的氨基酸序列。

报告质粒在细胞检测中的应用

萤火虫的3′部分荧光素酶使用引物1和2从pGL3对照（Promega）扩增基因（补充表6），并将扩增产物克隆到pcDNA5/FRT/TO的BamHI和XhoI位点（Invitrogen）。The 5′ portion of the荧光素酶使用引物3和4扩增的基因被顺序克隆到产生质粒的HindIII和BamHI位点。使用引物5和6将I-SceI结合位点克隆到报告质粒的BamHI位点。这个CCR5号机组使用引物7和8扩增的编码序列被克隆到报告质粒的BamHI位点。

体外消化试验

使用制造商描述的TnT-Quick-coupled transcription/translation system（Promega）在体外转录和翻译设计的ZFN。简单地说，将编码ZFN的质粒（每个0.5μg）添加到TnT-Quick主混合液（20μL）和1 mM蛋氨酸（0.5μL）中，并在30°C下培养90分钟。含有CCR5号机组首先用限制性内切酶消化编码序列，使其线性化。然后将目标质粒（1μg）与一对ZFN IVTT裂解物（各1μL）在37°C的NEBuffer 4（New England Biolabs）中孵育2小时进行消化。通过加热（65°C）使反应混合物失活，然后以13000rpm离心。上清液用于琼脂糖凝胶分析。

细胞培养与报告细胞系的建立

HEK293T/17（ATCC，CRL-11268TM（TM）)细胞和Flp-In T-REx 293细胞（Invitrogen）保存在添加了100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.1 mM非必需氨基酸和10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。报告质粒编码被破坏的荧光素酶根据制造商的说明，该基因稳定地整合到T-REx 293细胞中的Flp-In中。简单地说，这些细胞与报告质粒和Flp重组酶表达载体pOG44共同转染，并使用潮霉素B进行筛选荧光素酶基因被鉴定并用于SSA分析。

使用SSA系统进行基于细胞的分析

使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将每对ZFN表达质粒（每对100 ng）转染到30000个报告细胞/孔，96周平板格式。48小时后荧光素酶用强力霉素（1μg/mL）孵育诱导基因。培养24小时后，在20μL的1×裂解缓冲液（Promega）中对细胞进行裂解，并使用10μL荧光素酶分析试剂（Promeca）加上2μL细胞裂解液测定荧光素酶活性。

T7E1分析

HEK293T/17电池（3×104)使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将预先培养在96-well平板中的两个质粒转染到编码ZFN对（每个100ng）的质粒上。培养72小时后，使用制造商描述的G-spin基因组DNA提取试剂盒（iNtRON生物技术）从ZFN转染细胞中提取基因组DNA。扩增、熔化并退火包含ZFN靶位点的基因组区域，以形成异源双链DNA。引物9和12用于Z30位点；Z266和Z360站点为10和12；Z410、Z426和Z430站点分别为11和12；Z836和Z891场地分别为13和14（补充表6）。用5个单位的T7核酸内切酶1（New England BioLabs）在37°C下处理退火的DNA 15分钟，然后通过添加2.5体积的乙醇沉淀。用琼脂糖凝胶电泳分析沉淀的DNA。

DSB病灶染色

用HEK293T/17细胞进行TP53BP1核内染色。使用带盖的Lab-Tek室载玻片（NUNC）固定细胞，并用3.7%甲醛固定细胞，制备载玻片。然后在室温（RT）下用0.2%Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中处理10分钟，使细胞渗透。然后用抗TP53BP1兔多克隆抗体（Bethyl Laboratories）在5%牛血清白蛋白（BSA）存在下培养细胞，以阻止非特异性染色，然后用Alexa Fluor 488-共轭二级抗体（Invitrogen-Mollecular Probes）孵育。在DAPI（Sigma）存在下安装载玻片以对细胞核进行复染，并在免疫荧光显微镜下进行检查（Carl Zeiss-LSM510）。

证据中添加的注释

自提交本文以来，Foley等人（2009年）报道了使用开放ZFN对斑马鱼进行基因组编辑。

脚注

[补充材料可在线获取，网址：网址：www.genome.org.]

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.089417.108.

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文章来自基因组研究由以下人员提供冷泉港实验室出版社