自噬需要早期内吞体和内吞体共变异构体

高尔基体解体发生在GFP-LC3脂质化或囊泡形成之前，但不会诱导其形成

β-COP的耗竭已被证明会导致ER、ERGIC和高尔基复合体坍塌成一个包含ERGIC-53（ER-Golgi中间隔室）和GM130（高尔基膜蛋白130 kD）的大球状隔室(Styers等人，2008年). 因此，为了研究高尔基复合体的形态变化、GFP-LC3脂质化和泪点形成之间的关系，我们在siRNA缺失β′-、β-和α-COP后进行了一个时间过程，并监测了GFP-LC3和GM130的定位。在siRNA治疗24小时后，我们发现β′-和α-COP水平均下降(图2 A)以及GM130的分布从网状结构向更紧密的泡状结构的细微变化(图2 C). 48小时后，在siRNA-缺失细胞中，GM130重新分布，在大多数细胞中几乎检测不到(图2 E). 利用透射电子显微镜（TEM），我们观察到高尔基体池的囊泡形成以及核旁区域出现许多小囊泡（参见图S1)，证实了高尔基复合体的破坏。考虑到COPI在从高尔基体前VTC（泡状小管隔室）向高尔基复合体和通过高尔基体的贩运中的作用，这一结果是可以预期的(Lee等人，2004年). 然而，GM130分布的变化先于GFP-LC3阳性结构的出现和GFP-LC3-II的增加(图2 B). 24小时后β′-COP的siRNA缺失(图2、B和C)没有检测到GFP-LC3-II，观察到的GFP-LC3点很少，而在48小时(图2、B和E)GFP-LC3-II和GFP-LC3点均显著增加。这些结果表明，高尔基体碎裂先于GFP-LC3-II的积累和GFP-LC3点的形成，GFP-LC3-点的积累可能是高尔基复合体丢失的结果。

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图2。

COPI耗竭的时间过程表明高尔基体在AV形成之前就已经扩散，但高尔基体的扩散并不会导致AV的形成。（A） 293/GFP-LC3细胞中COPI亚基缺失，并在添加siRNA后24、36和48小时进行分析。β′-和α-COP的免疫印迹证实COP亚基缺失。（B） 在指定的时间，使用抗GFP抗体通过平行裂解液中的免疫印迹监测GFP-LC3-I和-II。（C） 在24小时siRNA处理后，β′-COP的缺失导致了GM130的形态变化和核周细胞数量的减少。方框表示放大区域。（D） 使用siRNAs去除Rab1a/b 48小时。用抗Rab1探针检测裂解产物以确认缺失。（E） β′-COP或Rab1a/b像D一样被耗尽，并使用抗GM130和GFP荧光进行间接免疫荧光分析。在β′-COP面板中，星号表示未显示GFP-LC3阳性AVs积聚的细胞。

然后我们询问高尔基体碎裂本身是否会导致与COPI耗竭导致AV积聚后的表型相似的表型。为了测试高尔基体的分解或裂解是否诱导自噬，我们使用Rab1a/b的siRNA-缺失作为另一种方法来分解高尔基复合体(Haas等人，2007年). 如所示图2 D在293/GFP-LC3细胞中，获得了对Rab1a和b的高效siRNA敲除，正如预期的那样，Rab1缺失导致高尔基复合体断裂(图2 E); 24小时后，ERGIC-53（未描述）和GM130阳性结构都变得支离破碎；然而，即使在Rab1缺失48小时后，Rab1 siRNA-缺失细胞中的GFP-LC3阳性结构也没有明显增加(图2 E). 使用30分钟Brefeldin a处理获得了类似的数据，该处理也将高尔基复合体分割成碎片（未公布的数据）。这些结果支持这样的结论：高尔基体裂解本身并不诱导自噬或导致GFP-LC3阳性结构的积累。此外，在ER中COPII囊泡栓系和COPII货物选择需要Rab1(Haas等人，2007年). 总的来说，我们关于Rab1的数据与COPI亚单位耗竭后对GFP-LC3脂质化和囊泡形成缺乏影响一致，并进一步支持COPI功能在自噬中的特异性

我们推测COPI功能的丧失可能会在细胞中引起“应激”信号，可能是由于蛋白质运输的中断(Styers等人，2008年)，这会导致自噬。在siRNA-介导的GBF-1（一种激活ARF的鸟嘌呤核苷酸交换因子，但不激活相关的GEF BIG1和BIG2）缺失后，蛋白质转运受阻，导致未折叠蛋白反应（UPR）增加(Citterio等人，2008年). 由于BIG1、2和GBF-1都是ARF介导的COPI囊泡形成所必需的，我们询问COPI亚基的缺失是否会导致UPR。这一点也很重要，因为UPR已被证明能诱导自噬(Ogata等人，2006年). 为了监测β′-COP耗竭48小时后的UPR，我们检测了ER伴侣钙网织蛋白的水平，该水平已被证明在UPR期间增加。我们没有发现钙网蛋白水平增加(图S2 A). 最近的一份出版物独立确认了未经改变的钙网蛋白水平(Styers等人，2008年). 此外，β′-COP耗竭后ERGIC-53水平下降，支持我们的假设，即不规则蛋白反应并不参与，因为ERGIC-52在诱导不规则蛋白受体后增加(Nyfeler等人，2003年). 最后，COPI敲低细胞用盐芥碱处理，盐芥醇是一种化合物，通过抑制真核翻译起始因子2亚单位α（eIF2α）的去磷酸化来保护细胞免受内质网应激(Boyce等人，2005年). 我们的结果表明，COPI缺失细胞与柳氮芥醇孵育对LC3-II水平没有影响（图S2 B）。这三个结果强烈表明COPI耗竭不会通过内质网应激的增加诱导自噬。

GFP-LC3脂质化和囊泡形成，但不需要高尔基体碎裂，需要Atg5和Atg7

Atg蛋白是GFP-LC3脂质化和AVs形成所必需的，因此，为了询问COPI缺失细胞中形成的GFP-LC3puncta是否通过Atg依赖性途径发生，我们将COPI siRNA与Atg5或Atg7特异性siRNA共同转染细胞。我们之前已经证明，293/GFP-LC3细胞中Atg5和Atg7的缺失会减少LC3-II和GFP-LC3-阳性AVs的数量(Chan等人，2007年). COPI亚单位与Atg5或Atg7的耗竭降低了COPI耗竭诱导的GFP-LC3-I脂化(图3 A). 荧光显微镜下处理的平行样品显示，这些双转染siRNA-缺失细胞缺乏GFP-LC3阳性AVs；在缺乏Atg5或Atg7的情况下，GFP-LC3保持弥散和细胞溶质状态(图3、C和D)类似于控制siRNA处理的细胞(图3 B).

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图3。

COPI siRNA缺失后的AV形成需要Atg5和Atg7。293/GFP-LC3细胞与β′-、α-COP的siRNA孵育，或与对照siRNA单独孵育或与抗Atg5或Atg7的siRNA联合孵育48 h，然后（A）通过免疫印迹分析Atg5、Atg7、GFP-LC三和微管蛋白（负载控制），或（B）使用抗ERGIC-53抗体或GFP荧光固定用于免疫荧光分析。在A中，星号表示非特定带；在B和C中，星号表示没有显示片段ERGIC-53的细胞。

我们还询问了在缺乏Atg5和Atg7的情况下，COPI耗竭后高尔基复合体的断裂和损失是否发生了改变。我们使用ERGIC-53标记ER-Golgi中间隔室，发现COPI耗竭后，ERGIC-52标记显著减少，且呈分散状态(图3 B). 在对照细胞中ERGIC-53的稳态分布和在COPI耗竭细胞中ERGIC-53的扩散均不受Atg5或Atg7共同耗竭的影响(图3、C和D). 这些结果表明，COPI耗竭后GFP-LC3-II和GFP-LC3点的增加需要自噬蛋白Atg5和7，并且表明Atg7的丢失并不影响正常细胞中ERCIG-53的分布，也不影响COPI siRNA耗竭后ERCIG-52的重新分布和分散。

相关显微镜显示GFP-LC3阳性结构为AV

GFP-LC3-II和GFP-LC3-阳性小泡的积累表明，β′-、β-和α-COP特异性siRNA导致AVs数量增加。尽管GFP-LC3阳性斑点表明存在AVs，但GFP-LC3也可以形成类似于光镜水平的AVs的大聚集体(Kuma等人，2007年). 虽然在我们之前对293/GFP-LC3细胞的研究中，我们没有观察到在喂食或饥饿条件下GFP-LC2聚集成点状结构(Chan等人，2007年)，我们使用相关光电子显微镜（CLEM）来确定光镜下COPI缺失细胞中的GFP-LC3荧光结构是否与膜结合AV相对应。如所示图4，光镜下可见GFP阳性小泡(图4 B)对应于形态学上可识别的AV(图4，D–G). 许多AV只有一层膜，充满了各种隔离的膜结合囊泡和电子致密结构(图4，F和G和图S3 A). 这些结果证实，293/GFP-LC3细胞中COPI缺失导致AV数量显著增加。

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图4。

GFP-LC3点的相关光电子显微镜分析表明它们是AV。（A） α-COP siRNA缺失48小时后293/GFP-LC3细胞相同场的相、（B）荧光和（C）TEM。在B中，图像被反转，以便更好地显示GFP-LC3阳性结构。（D） A和C中带星号的单元格放大倍率较高。E中感兴趣单元格的顶部区域放大，以显示B中箭头指示的两个AV结构。（F和G）E中箭头显示的AV放大倍率更高。

COPI损失导致含p62-和Ub-的骨料堆积

p62/SQSTM1可以与AVs膜上的LC3结合，并被隔离在AVs中(Pankiv等人，2007年). p62的水平和亚细胞分布用于监测自噬流量；p62水平低或不变表示自噬反应和流量正常，而p62水平升高表示流量受阻，这是由于通路受到抑制和AVs积聚所致(Klonsky等人，2008年). 因此，我们决定询问p62的分布是否受到COPI siRNA缺失的影响(图5 A). 在对照siRNA处理的细胞中，p62表现出与细胞溶质GFP-LC3类似的弥散和细胞质模式。然而，在COPI亚单位的siRNA缺失后，p62的信号增加，并在离散的点状结构中发现，其中大多数为GFP-LC3阳性(图5 A). p62也被证明与致密蛋白质聚集体有关(Pankiv等人，2007年); 然而，使用TEM，我们在293/GFP-LC3细胞中没有观察到这些结构。

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图5。

Ub和p62在α和β′-COP缺失的293/GFP-LC3细胞中积聚。（A） 用对照或β′-COP siRNA处理293/GFP-LC3细胞48 h，然后用抗p62和抗泛素抗体固定并标记，与GFP-LC3.共定位。（B） 如A中所述处理并用抗泛素和抗p62抗体标记的HEK293细胞。（C） 用抗Ub抗体标记β′-COP缺失细胞的冷冻切片，然后用10-nm蛋白A-金标记。AV，自噬体。

p62已被证明通过保守的UBA基序结合泛素化蛋白(Pankiv等人，2007年)因此，我们接下来检查了小干扰RNA敲除COPI后泛素（Ub）的分布。有趣的是，在COPI的siRNA缺失后，我们发现Ub分布发生了改变，其行为与p62类似。Ub在对照siRNA处理的细胞中具有弥漫性外观，并且在siRNA介导的COP耗竭后具有点状分布。此外，大量Ub阳性点状结构对GFP-LC3也呈阳性(图5 A). 使用HEK293A亲代细胞，我们还观察到在β′-COP缺失后，p62和Ub重新分布到点状结构中，这些点状结构在很大程度上是共定位的(图5 B).

接下来，我们进行了冷冻免疫EM，以了解GFP-LC3阳性结构的形态，其中包含p62和Ub。不幸的是，我们无法使用商用抗体标记p62，但我们可以在冷冻切片中检测到Ub。在siRNA-介导的β′-COP缺失后，我们观察到两个主要的Ub阳性细胞膜群体：一个群体是AVs，其上的泛素在限制性细胞溶质表面膜和内膜上检测到，另一个群体由小泡（小于100 nm）组成，其外表面用Ub装饰(图5C和图S4). 在β′-COP缺失细胞中，Ub标记结构的形态与GFP标记检测GFP-LC3细胞后的形态非常相似（图S4）。许多类似未成熟自噬体（AVis）的小泡、小管和AVs在其细胞质表面和内膜上被Ub和GFP-LC3修饰。这些结果表明，COPI耗竭后，泛素化蛋白（很可能是p62）出现在小泡和小管的膜上，以及AV的细胞质表面和AV内的内膜上。

COPI耗竭诱导的AVs不呈酸性或降解性

COPI耗竭细胞中大量GFP-LC3 AVs表明，AV形成率显著增加，或AV成熟和消耗受到抑制。自噬速率的增加应导致细胞的降解能力增加，而如果自噬体的消耗或成熟受到抑制，则应减少自噬底物的降解。为了检测COPI缺失细胞中AVs的降解能力，我们测量了作为自噬活性指标的长期蛋白质降解(图6 A). 在siControl未经保护的细胞中，长寿命蛋白质降解发生在较低的基础水平，如预期的那样，饥饿2小时后会增加。然而，在β′-COP缺失后，尽管未切割细胞中GFP-LC3-II和GFP-LC3-阳性AVs大量增加，但蛋白质降解的基础水平没有变化(图6 A). 这一结果表明COP缺失细胞中形成的AV降解能力受损。然而，siRNA COPI缺失的细胞仍然能够对饥饿诱导的自噬作出反应，因为饥饿2小时后蛋白质降解可能加剧。

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图6。

COPI缺失细胞中的AV不会降解。（A） 在293/GFP-LC3细胞中用对照或β′-COP siRNA转染72 h后评估长期蛋白降解。细胞要么缺乏氨基酸2h（St），要么在新鲜生长培养基（Fed）中培养2h。蛋白质降解量表示为平均值±SEM。（B）siControl-处理的细胞和β′-和α-COP耗尽48h，然后在固定前用Lysotracker red（50 nM）培养30min。合并后的图像显示GFP-LC3 AV阳性结构几乎没有共定位。星号表示插图中放大的单元格。（C） β′-和α-COP siRNA缺失后，Magic Red-RR₂用（MR）检测喂食或饥饿（St）2h的细胞中的活性组织蛋白酶B。用流式细胞仪测量活细胞中MR标记的强度。

AVi/d和自溶体是已知的酸性隔间。为了进一步了解COPI耗竭细胞中AV的特性，特别是为什么它们不降解，我们接下来使用Lysotracker red（LTR）询问GFP-LC3阳性AV是否是酸性的，它积聚在酸性细胞中。以前的研究表明，在氨基酸饥饿2小时后，约40%的AVs为LTR阳性，并含有内体标记物(Bampton等人，2005年). 使用生长培养基中培养的β′-和α-COP缺失细胞，我们发现大多数GFP-LC3阳性结构没有积累LTR(图6 B). 使用DAMP染色也获得了类似的结果，DAMP染色也在酸性区室中积累（未示出）。为了进一步证实GFP-LC3和LTR共定位的缺乏并不是由于GFP-tag在酸性细胞室中的猝灭（这将掩盖GFP-LC2的积累），我们使用抗LC3抗体观察了COPI缺失293/GFP-LC4细胞中LC3的总积累。LC3免疫反应对管腔酸度不敏感。我们发现COPI缺失细胞中的两个信号完全重叠，而siControl饥饿细胞中的这两个信号则完全重叠，这表明LC3有两个免疫反应群体，一个与GFP-LC3重叠，而另一个没有重叠（图S3 B）。这些结果证实，在COPI耗尽后，我们可以使用GFP标签检测到所有GFP-LC3阳性AV，并且这些AV没有降解或酸性。

邓恩（1990）假设AVs在溶酶体酶通过与内吞小室融合传递之前就酸化，这可能是通过与不同类型的内吞小体的连续融合发生的；首先融合的是含有液泡（V）质子ATP酶（V-ATP酶）但不含溶酶体酶的内体。为了了解积累的AV中缺乏降解能力是否仅仅是酸化缺陷的结果，或者溶酶体酶靶向性是否也受到COPI缺失的影响，我们通过检测魔红RR的水平来询问COPI缺失细胞是否具有活性溶酶体酶类₂，一种检测活性组织蛋白酶B的荧光底物(图6 C). 通过FACS分析，饥饿对照细胞和siCOPI缺失细胞的组织蛋白酶B水平没有差异。此外，我们通过免疫印迹细胞裂解物证实COPI缺失细胞含有活性组织蛋白酶D；在缺乏β′-、β-和α-COP的对照细胞和siRNA处理细胞以及Rab1a/b中，我们检测到31-kD成熟组织蛋白酶D重链的类似水平(图S5 A).

我们的数据支持这样的结论，即COPI缺失细胞中GFP-LC3 AVs的积累并不是对整个内体-溶酶体途径产生间接影响的结果，因为COPI缺失的细胞仍然具有降解能力和正常水平的溶酶体酶。

GFP-LC3自噬体为LAMP1和2阳性

溶酶体相关膜蛋白1和2（LAMP1和2）存在于晚期内体和溶酶体上，也被证明对AV的成熟至关重要(Saftig等人，2008年). 因此，我们询问COPI耗竭后，LAMP1和2在内膜中的分布是否发生改变，以及它们是否存在于GFP-LC3阳性AV上。COPI耗竭后，LAMP1和2的总体分布没有显著变化。然而，许多GFP-LC3阳性AV含有LAMP1（未描述）和LAMP2(图7 A). 接下来，我们使用EM检测GFP-LC3和LAMP2阳性AV的成熟阶段。我们用抗LAMP2抗体和抗GFP标记β′-COP缺失细胞的冰冻切片，以检测GFP-LC3(图7 B). GFP-LC3在外AV膜、内膜和邻近囊泡上检测到。在双标记切片中，LAMP2的分布与GFP-LC3相似。LAMP2和GFP标记的AV含有内膜，与抗Ub标记的AVs相似（参见图5和图S4）。然而，尽管GFP-LC3阳性AVs上存在LAMP2，表明它们与晚期内体或溶酶体融合，但我们无法通过TEM在siRNA COPI缺失的细胞中检测到许多AVd。

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图7。

GFP-LC3 AV为LAMP2阳性。（A） 293/GFP-LC3细胞与对照或β′-或α-COP siRNA孵育48 h，用抗LAMP2抗体固定并标记，然后用Alexa 555抗小鼠抗体。COPI耗竭后，许多GFP-LC3阳性AV对LAMP2呈阳性。星号表示插图中放大的单元格。（B） 如图所示，用抗GFP（左）或抗GFP和抗LAMP2（右）标记的β′-COP缺失细胞的冷冻切片，然后是蛋白A-金。AV，自噬体，M，线粒体。

GFP-LC3阳性AVs中发现早期内体标记物和TGN46

一种假设是，siRNA-介导的COPI缺失后形成的AV通过与晚期内体融合获得LAMP2。作为另一种假设，LAMP2也可以通过不含MPR的囊泡中TGN的囊泡运输而传递给AVs(Chapuy等人，2008年)或来自早期内吞室，如囊泡内体（VEs）。孵育10分钟后，通过内化电子密度示踪剂识别出的小VE和MVB已被证明优先与AVis融合：约45%的这些内吞VE和LVBs标记Lgp120（LAMP2），但没有组织蛋白酶D标记(Liou等人，1997年). 因此，我们检测了TGN46和CI-MPR的分布，它们通过内胚层在高尔基体/转高尔基体网络（TGN）和质膜之间循环。令人惊讶的是，在COPI耗竭后，TGN46和CI-MPR表现出不同的行为：TGN46重新定位到点状结构，而在对照细胞中观察到的CI-MPR的近颗粒堆积消失(图8 A和图S5 B）。与GFP-LC3共定位的点状TGN46结构(图8 A)这表明TGN46分选所经过的贩运路线可能与COPI耗尽后形成的AV汇合。

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图8。

GFP-LC3阳性AVs在COPI耗竭后共同定位TGN46和早期内吞标记物。（A） 293/GFP-LC3细胞与β′-COP的siRNA或对照siRNA（Cont）孵育48 h，进行免疫荧光处理，并用TGN46抗体标记。在（B）中，siRNA处理的细胞被固定并标记，或饥饿2小时（St），并用EEA1抗体标记。（C） 对照饥饿的HEK293细胞在甲醇固定后通过双重标记标记内源性LC3和EEA1。（D） siRNA处理后，将罗丹明标记的右旋糖酐内化20分钟，然后进行40分钟追踪，然后固定293/GFP-LC3细胞并通过共焦显微镜进行分析。

TGN46最近被证明从早期内体退出，而MPR被认为从晚期内体退出(Ganley等人，2008年)，我们询问COPI耗竭后是否在GFP-LC3 AV中发现早期或晚期内体标记。我们检测了早期内体（早期内体自身抗原1[EEA1]）和晚期内体和MVB（溶血磷脂酸[LBPA]）的标记物。LBPA未发现GFP-LC3共定位（未发表数据），但我们发现一小部分GFP-LC3-阳性、EEA1-阳性Avs；然而，更常见的是GFP-LC3与EEA1并列(图8 B). 我们在饥饿后检查了siControl细胞，发现GFP-LC3和EEA1的共定位非常低(图8 B). 然而，内源性LC3与相邻的EEA1阳性早期内体共定位，并在其上发现(图8 C). 我们得出结论，AVs可以与EEA1阳性的早期内体融合，而在对照细胞中，GFP-LC3与EEA1缺乏共定位是由于EEA1阳性结构中GFP的猝灭。此外，COPI耗竭后，GFP-LC3阳性结构似乎与EEA1阳性早期内体对接。

为了进一步探讨COPI耗竭的影响，我们跟踪了液相标记物罗丹明标记葡聚糖的内化。在siRNA COPI缺失的细胞中，许多GFP-LC3阳性AVs含有Rho-dextran(图8 D)支持内吞小泡可以与AV融合的假说。GFP-LC3阳性AV与EEA1没有实质性重叠这一事实表明，COPI的丢失会抑制AV与EEA1阳性内体的融合，并且抑制这一融合步骤会阻止AV的成熟。

转染和siRNA试剂

按照制造商的方案，用寡效胺转染siRNA。所有siRNA均购自赛默飞世尔科技公司，序列如下：对照非靶向siRNA双链（D-001210-021）、β′-COP（D-019847-01）、β-COP（D-017940-01）和α-COP（M-011835-01）。Rab1a和1b（L-008283-00和L-008958-01）、sec23A和sec23B（M-009582-00和M-009592-00）、附件5（M-004374-01）和附件7（M-020112-01）。EEA1 siRNA已发布(Leonard等人，2008年). 除非另有说明，否则用siRNA转染细胞48–72小时。

免疫印迹法

对在1x SDS样品缓冲液中裂解的细胞进行免疫印迹。使用的抗体是来自Felix Wieland教授（德国海德堡大学）的兔抗-β′-COP（891）和兔抗-α-，-β′-，-γ-COP（883），以及兔抗EAGEβ-COP（STO235）(Duden等人，1991年). 兔抗Atg5（Cosmo Bio Ltd）；抗Atg7（Novus）；兔抗Rab1（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；小鼠抗Sec23（ABR）；兔抗GFP【T.Hunt博士（CRUK）】；单克隆抗LC3（5F10）（纳米工具）；兔抗钙网蛋白（Bioquote）；山羊抗组织蛋白酶D抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；兔抗管蛋白（Abcam）。根据制造商的说明，使用ECL（GE Healthcare）显示HRP结合的二级抗体。

间接免疫荧光

使用标准方案对用3%PFA固定在PBS中的细胞进行间接免疫荧光，在0.2%Triton X-100中渗透，在0.5%BSA中孵育20分钟。对于内源性LC3（使用5F10），我们用−20°C甲醇固定细胞5分钟。然后用一级抗体和含有0.1%BSA的PBS中的二级抗体孵育细胞。小鼠LAMP2（CD107B）抗体来自BD Biosciences，豚鼠抗p62来自Progen，小鼠抗CI-MPR来自Abcam，兔抗泛素来自Dako，小鼠抗ERGIC-53来自Qbiogene，鼠抗GM130来自BD bioscience，和来自AbD Serotec的羊抗TGN46抗体。兔抗EEA1抗体是M.Clague（英国利物浦大学）赠送的礼物。Alexa-conjugated transferrin、次级抗体和Lysotracker red来自Invitrogen。Lysotracker是按照制造商的说明使用的。在生长培养基中以0.5 mg/ml的浓度使用罗丹明标记的右旋糖酐（Invitrogen）。使用配备63x，1.4 NA，Plan Apochro油浸物镜（卡尔蔡司公司）的蔡司LSM 510激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行检查和成像。使用LSM 510软件处理图像。魔法红-（右后）₂将（Immunochemical Technologies，LLC）添加到贴壁细胞中20 min，然后通过胰蛋白酶将其去除，并在LSR II FACS（Becton Dickinson）中使用592 nm的激发和628 nm的发射进行分析。

长寿命蛋白质降解和氨基酸摄取

如前所述进行长期蛋白质降解(Chan等人，2007年). 总之，用抗β′-COP的siRNA转染293/GFP-LC3细胞。48小时后，标记培养基（DMEM，含10%透析FBS[¹⁴C] -缬氨酸[0.2µCi/ml，GE]和65µM未标记缬氨酸）添加到细胞中。18小时后，用追逐培养基（DMEM、10%FCS和2mM未标记缬氨酸）代替标记培养基4小时。追逐后，将细胞在EBSS和2mM缬氨酸中孵育2小时以刺激自噬。收集细胞和培养基，通过添加冰镇TCA至10%，分别进行三氯乙酸（TCA）沉淀。自噬降解的百分比被量化为（培养基中的TCA可溶计数）/（培养基的TCA可溶计数）+（细胞中的TCA-不溶计数）(Gronostawski和Pardee，1984年).

氨基酸摄取使用0.2µCi/ml[¹⁴C] -缬氨酸在标记培养基中放置3小时，以控制细胞或在72小时siRNA转染后的细胞。清洗后测量细胞中的放射性。从重复的孔中测定活细胞数。

EGF内化和降解

使用低聚体胺将siRNA转染HeLa细胞，72小时后将细胞血清饥饿至少1小时，然后用¹²⁵I-EGF（1 ng/ml）在37°C的结合介质（无血清DMEM中0.05%BSA）中放置10分钟。使用0.1 M甘氨酸和0.9%NaCl（pH 3.0）在4°C下对细胞进行表面剥离，用结合培养基清洗，并放置在新鲜的预加热37°C结合培养基中。在每个时间点之后，收集培养基，并在随后的时间点用新鲜培养基替换。收集的培养基为TCA（20%最终），在4°C下沉淀1小时。TCA不溶性蛋白质通过在14000下离心沉淀克并收集可溶性上清液。在1%Triton X-100中对细胞进行裂解，并对追踪培养基、TCA可溶性上清液和细胞裂解液中的放射性进行计数，以确定EGF降解和再循环的百分比。

电子显微镜

将细胞固定在含有2%多聚甲醛和2%戊二醛的0.1 M二甲氨基甲酸盐中，然后使用标准程序将其嵌入(霍普金斯和特罗布里奇，1983年). 对用4%多聚甲醛/0.1%戊二醛固定的细胞（泛素和LAMP2标记的细胞仅用PFA固定）在pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中进行冷冻免疫-EM，注入2.3 M蔗糖并用10%明胶支撑。切片（70 nm）在−120°C下切割，并在1:1蔗糖/甲基纤维素中拾取。主要抗体为兔抗泛素（Dako）、兔抗GFP抗体（Abcam）和鼠抗LAMP2（BD Biosciences）。然后，如前所述，用蛋白A-金标记切片(Slot和Geuze，2007年). 切片在FEI Technai G2 Spirit Biotwin透射电子显微镜和Ultrascan 1000 CCD相机及软件中进行可视化。

我们感谢Giampietro Schiavo博士和Jöelle Movan博士对手稿的评论，感谢Secretory Pathways实验室、Rose Watson、Hannah Armer和伦敦研究所EM部门的帮助和建议。

我们感谢英国癌症研究所的支持。