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国际慢性阻塞性肺病杂志。2007年12月；2(4): 593–598.
2007年12月在线发布。
预防性维修识别码：PMC2699961型
PMID：18268933

收缩性闭塞性细支气管炎患者弹性蛋白表达上调

阿德里安·希夫伦,1 杰森·C·伍兹,2 丹尼尔·罗森布鲁斯,1 苏珊警官,1 乔尔·D·库珀,三和理查德·皮尔斯1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

闭塞性缩窄性细支气管炎是一种小气道纤维化疾病，其特征是气道管腔逐渐闭塞，导致阻塞性肺生理。虽然先前的工作已经证明了收缩性纤维化病变的胶原性质，但该病中弹性蛋白的表达特征尚不明确。弹性蛋白是肺细胞外基质的关键成分，负责肺泡、肺血管和气道的可逆变形特性。弹性蛋白是一种长寿命蛋白质，在儿童早期完成肺部发育后几乎不产生活性蛋白质。我们报告了一例新的隐源性闭塞性细支气管炎病例，其中弹性蛋白基因在受影响的气道中表达上调，并伴有肌成纤维细胞增生和弹性纤维紊乱沉积。此外，肌成纤维细胞在受影响的细支气管周围的肺泡中沉积新的弹性纤维。

关键词：弹性蛋白、闭塞性细支气管炎、肌成纤维细胞

介绍

闭塞性缩窄性细支气管炎（CBO）是一种纤维肺疾病，主要影响肺部的小（直径≤3 mm）传导气道(2003年时装与科尔比). “缩窄性”闭塞性细支气管炎于1973年首次被用作描述性术语(Gosink等人1973年)，并描述了围绕而不是填充气道管腔的纤维化炎症过程(科尔比1998). 这一过程会导致外源性气道受压和管腔闭塞。国会预算办公室在成年人中很少见，而且研究得很少。在大多数情况下，与CBO相关的病原体是已知的，尽管其中一些相关的证据尚不明确(Ryu等人2003年). “隐源性闭塞性细支气管炎”一词于1981年首次用于描述其他原因不明的进行性气流阻塞病例(Turton等人1981年). 然而，已有少量经病理证实的CBO隐源性病例被记录在案(卡夫等人1993年).

由于细支气管具有相当大的横截面积，因此细支气管是肺的一个生理沉默区。从气管分支开始，每一个连续的远端气道的直径逐渐减小。然而，由此产生的总横截管腔面积随着每次连续气道生成而增加，这一特征在细支气管起源远端的传导气道中最为显著(Baraldo等人2003年). 因此，细支气管的广泛损伤可能导致相当大的病理生理后果。在慢性阻塞性肺病（CBO）中，细支气管的渐进性闭塞导致传导气道横截面积减少，伴随的阻塞性生理学发展，并因空气阻塞和过度充气而变得复杂。

弹性纤维是一种复合结构，包含两种主要的形态上可区分的成分，即弹性蛋白和微纤维（参见Kielty等人（2002年）). 弹性蛋白是一种主要的弹性纤维成分，对肺部发育和机械功能至关重要(Mariani等人1997年)弹性纤维分布于整个肺，包括肺泡、气道、血管和胸膜。肺弹性蛋白的合成率在胎儿和新生儿发育期间最高，但在健康成人肺中几乎检测不到(Mariani等人2002年). 然而，在肺气肿或肺纤维化等病理情况下，成人肺中的弹性蛋白表达可能会重新激活，导致过度或异常的弹性蛋白沉积(Snider等人，1991年;Lucey等人1998年;Hoff等人，1999年). 功能性纤维的形成需要所有纤维成分以时间和空间调节的顺序进行协调的重新表达。这在成人组织中被认为是一个低效的过程，因为在受伤的成人组织中重新激发的弹性蛋白沉积通常以新形成的三维纤维的组织缺陷为特征。

CBO主要影响小气道，在病变气道周围的肺泡中观察到很少或没有组织学变化(2003年时装与科尔比). 鉴于CBO既涉及气道损伤又涉及纤维化反应，因此发现气道中细胞外基质成分的增加并不令人惊讶。虽然之前的研究已经证实CBO患者支气管壁存在广泛的胶原纤维化(Markopoulo等人2002年)弹性蛋白基因表达和蛋白质沉积的特征尚不明确。在这里，我们报告了一例隐源性闭塞性细支气管炎，其中弹力蛋白的表达和沉积在受影响的细支气管和周围肺泡中均显著和病理性增加。

病例报告

一名63岁的男性，有5个月的进行性呼吸困难、咳嗽和痰生成不足病史，被转诊进行肺部评估。在出现呼吸困难之前，他功能完全，没有运动限制。他的症状开始与上呼吸道感染的发展相一致。使用抗生素和支气管扩张剂的门诊治疗取得了微小但暂时的改善。在陈述时，患者因淋浴和爬楼梯而呼吸困难。他有5年的雪茄烟病史，在转诊前25年就停止了吸烟，这段社会史非常显著。广泛的询问没有产生任何明显的职业或环境接触史，家族史与肺部疾病无关。患者有胸腺瘤病史，但检测显示没有重症肌无力或胸腺疾病的任何其他全身表现的证据。在没有肺气肿证据的情况下，CXR对双侧过度充气有重要意义。CT扫描再次显示明显的过度充气，几乎没有证据表明肺气肿。双侧支气管扩张和细支气管炎明显，以下叶为主。对继发性支气管扩张的原因进行了广泛的检查，结果并不显著。肺活量测定证实存在部分可逆的严重阻塞性通气缺陷，FEV1=0.67L（预测19%），FVC=2.17L（预测48%），FEV1：FVC比率为39%。TLC=7.84L（预测值为109%）时，肺容积未显示过度膨胀，但RV=5.28L时，空气潴留明显（预测值222%）。静息ABG显示pH=7.38，PaCO2=54，PaO2=50（室内空气，带室内空气SpO）2占88%。6分钟步行测试表明，患者需要在休息时补充氧气2 L/min，在活动时补充氧气3 L/min，以维持SpO2≥90%. 尽管用氧气、支气管扩张剂、间歇性抗生素、抗炎药（皮质类固醇和大环内酯）和康复进行了积极治疗，但他的病情仍在继续恶化。由于严重的临床和生理损伤，患者接受了评估，并被列为肺移植患者。3个月后进行双侧序贯肺移植，无并发症。手术时，发现肺部严重过度膨胀，并且在切除并从胸腔取出后未放气。外植体楔形活检进行病理检查，诊断为闭塞性缩窄性细支气管炎，根据其临床病史，其病因被认为是隐匿性的。肺的其余部分在−80°C下储存，以供进一步研究。在撰写本文时，患者在移植后15个月内仍表现良好。

方法和材料

肺部处理

在取样过程中，移植的病肺被保存在冰上，供肺被排斥用于移植，作为组织对照。外周肺部分1厘米2在石蜡包埋之前，用手术刀切除，并在4°C的4%多聚甲醛中固定一夜，不充气。连续5μm厚的切片被切割、脱蜡，并用苏木精和伊红染色（H和E）。采用相同的切片进行Hart染色、原位杂交和免疫组织学染色。

哈特弹性蛋白染色

将包埋在石蜡中的外周CBO和对照肺组织切片（5μm）脱蜡，并通过分级乙醇重新水化至PBS，然后在0.25%高锰酸钾溶液中浸泡5分钟。在5%草酸中清除载玻片，并将其浸泡在间苯二酚-品红溶液中过夜（美国纽约州湾岸保利科学公司）。在水中洗涤后，切片用柠檬黄（黄色）复染，通过分级乙醇脱水，在二甲苯中清除并安装。

平滑肌肌动蛋白免疫组化

石蜡包埋的外周CBO切片和对照肺切片在二甲苯中脱蜡，然后在下降的乙醇系列中重新水化，并在PBS中静置10分钟。将载玻片用10%胎马血清封闭1小时，在PBS中漂洗，然后在4℃下与原代α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（1A4小鼠单克隆抗体，1:200稀释，Sigma，St.Louis，MO，USA）孵育过夜。在PBS中冲洗后，用二级抗体（荧光素结合山羊抗鼠IgG，1:250稀释，1小时，室温，Jackson Immuno-Research，Westgrove，PA）在黑暗中孵育切片。在PBS中冲洗后，使用Vectashield安装介质（Vector Laboratories，Burlingame，CA）将切片盖上，并在荧光灯下观察以进行图像捕获。

原位杂交

双加氧素标记的反义和正义核糖探针是从狒狒原弹性蛋白cDNA中生成的，该cDNA已线性化用于体外转录（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。将石蜡包埋的外周CBO和对照肺切片脱蜡，重新水化，并用蛋白酶K消化。用三乙醇胺和醋酸酐封闭组织切片，然后在60°C下与变性二恶英标记的核糖探针杂交过夜。杂交后，对组织切片进行一系列清洗，包括用RNase a消化，用阻断剂处理，并用与碱性磷酸酶结合的抗体孵育。在额外清洗后，将载玻片与色原底物孵育1-3天。颜色显影后，用核固红对标本进行复染。

结果

CBO肺的初步分析

切除后，移植的肺保持膨胀，触感牢固。当组织样本约为1 cm时三从肺外围切下，这些也保持膨胀。大体检查显示周围组织切片内无明显肺气肿改变。苏木精和伊红染色（H和E）显示，周围组织有少量细支气管，但没有肺气肿的证据，证实了CXR、CT和正式病理结果。与叶内动脉平行的大气道附近有炎症浸润。一些微粒沉积与炎症浸润有关(图1，箭头）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为copd-2-593f1.jpg

CBO的异常形态、弹性纤维积聚和弹性蛋白mRNA表达CBO感染肺（A和B组）和对照肺（C组）的外周肺组织切片在无充气的情况下固定、嵌入，并在5μM下切片。连续切片用H和E染色(A、 B、C类)对于使用Hart弹性纤维染色的弹性纤维(A类′,B类′,C类′），并原位杂交弹性蛋白mRNA(A类″,B类″,C类″). 在面板A中，一个大容器（每个面板的顶部）的两侧是一个大气道（每个面板左下角），在容器和气道之间积聚有可见的黑色沉积物微粒（用中的白色箭头表示A类和A类’）。A类'显示肺叶内肺动脉的弹性层（染黑），与对照组相比，大气道上皮和周围肺实质下的弹性纤维密度增加(C类’）。A类“表明弹性蛋白mRNA表达（黑色信号）存在于大血管、传导气道，尤其是这些结构之间的组织中，并且与对照肺相比显著增加(C类″). B组显示大量浸润（面板顶部），两侧为周围组织，其中含有闭塞的气道。弹性蛋白染色B类'表示浸润可能包围气道，因为有连续的弹性纤维（用白色虚线勾勒），表明存在管腔结构。同样，与对照肺相比，弹性蛋白密度增加(C类’).B类“显示浸润周围组织中持续、强烈的弹性蛋白mRNA表达高于对照肺组织(C类”）。

过度弹性纤维沉积和mRNA表达

由于肺部表现出异常的机械特性，没有收缩，也没有肺气肿改变的证据，我们接下来用哈特弹性蛋白染色法检查弹性纤维(图1，A′和B′）。评估和表示单个截面中弹性纤维的完整性非常困难。尽管如此，对大量切片的广泛分析显示，组织内嵌入了高密度的弹性纤维，其外观杂乱无章。许多弹性纤维显示出断裂的外观（如图1，B′）。为了确定尽管组织中有弹性纤维积聚，但弹性蛋白的合成是否仍在进行，我们对组织的连续切片进行了弹性蛋白mRNA的原位杂交(图1、A〃和B〃）。这表明弹性蛋白表达活跃，定位于叶内动脉壁、传导气道、末端气道和炎症浸润附近的肺泡。在先前未闭血管周围的炎症浸润中，弹性蛋白表达局限于血管残余物(图1根据其弹性片层和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色进行鉴定。

CBO中平滑肌和肌成纤维细胞增加

肺中的弹性纤维主要是血管平滑肌细胞和导管的产物，以及肺泡壁内的肌成纤维细胞。对CBO肺切片以及正常肺和肺气肿对照肺进行α-SMA染色，以确定表达“肌”表型的细胞数量或分布的改变是否与此成人肺标本中发现的异常弹性蛋白表达有关(图2). 正常成人肺中弹性纤维和肺泡肌成纤维细胞的典型外观和分布如所示图2、A和A′。致密的弹性纤维位于肺泡尖端，表达α-SMA的小肺泡肌成纤维细胞位于此处。在肺气肿肺标本中，一些区域显示与肺泡腔扩大相关的弹性纤维丢失，肺泡肌成纤维细胞的分布发生改变(图2、B和B'）。在CBO肺中，肺泡区有密集、扩大的弹性纤维，位于肺泡尖端，在那里可以发现染色强烈的肌成纤维细胞(图2、C和C'）。在CBO标本中含有广泛重塑区域的多个切片中，单个细胞和成组细胞密集堆积了无组织的弹性纤维，α-SMA染色强烈(图2、D/E和D/E）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为copd-2-593f2.jpg

改变CBO肺中表达α-SMA的细胞的分布和丰度。肺的连续切片用Hart’s弹性蛋白染色（左面板）或a-SMA染色（右面板）。A类：对照肺标本的肺泡切片显示肺泡壁尖端的局灶性弹性纤维（黑色染色）（灰色复染）。A类′：a-SMA连续切片染色显示小的肺泡肌成纤维细胞定位于肺泡尖端。B类：肺气肿肺标本，复杂性降低，空气空间扩大，弹性蛋白染色减少。B类′表示a-SMA的局灶染色丢失。C类：CBO肺的肺泡区显示肺泡隔尖端有大的局灶性弹性纤维C类'显示相同部位的肌成纤维细胞增大，a-SMA染色强烈。D类和电子邮箱：CBO肺的重塑区域显示厚弹性纤维积聚。D类'和E类′：弹性纤维被a-SMA染色强烈的细胞包围。

讨论

在描述的隐源性CBO病例中，呼吸困难和严重气道阻塞的根本原因被怀疑是毛细支气管炎，但直到肺移植后病理诊断才得到确认。对病变的肺进行外植后，观察到肺没有缩小，甚至病理检查时取出的肺组织切片也保持膨胀。这些不寻常的发现导致了对外周肺组织的更详细分析，并将其与正在进行的COPD弹性纤维变化研究中的其他标本进行了比较。与肺气肿形成鲜明对比的是，没有证据表明肺泡隔破坏。此外，与正常肺标本相比，肺泡弹性纤维的数量和密度大大增加。

弹性纤维在CBO中的作用尚未得到很好的表征。肺弹性蛋白是一种非常稳定和长寿命的聚合物(Shapiro等人1991)大多数肺弹性蛋白的表达仅限于肺泡发育阶段(公园1997;Mariani等人2002年). 因此，在正常未受损的成人肺中，弹性蛋白的表达几乎不存在。即使在与广泛重塑相关的肺部病理学中，由于过度胶原沉积导致的纤维化也比弹性组织增生更常见。值得注意的是，CBO气道壁的重塑被认为是无限制胶原纤维化的结果(Markopoulo等人2002年;2003年时装与科尔比;Visscher和Myers 2006)这是一种与转化生长因子β（TGF-β）信号转导增加相关并被证明依赖于这种信号转导的现象(Ramirez等人2004). 许多其他基因也被证明在TGF-β信号转导下发生上调，包括弹性蛋白(Davidson等人，1995年;戴维森2002)和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）(Desmouliere等人1993年;戴维森2002). 大多数在肺发育中表达弹性蛋白的细胞类型，包括气道和血管平滑肌细胞和肺泡肌成纤维细胞，对α-SMA呈阳性反应，α-SMA的上调与成人特发性肺纤维化细胞向肌成纤维表型的转变有关(Willis等人，2005年). 出于这些原因，我们对该病例进行了研究，以确定弹性蛋白mRNA的表达和αSMA阳性细胞的丰度。

取样的肺显示出严重的慢性阻塞性肺病，大部分区域显示出细支气管“消失”的现象，表明支气管完全被收缩过程所堵塞。受影响的细支气管中弹性纤维丰富、致密、粗大且呈粘稠状，弹性蛋白mRNA原位杂交显示，弹性蛋白表达丰富，局限于塌陷和病变的细支气管壁，这是弹性蛋白过度积聚的主要部位。此外，在邻近的肺泡区也观察到弹性蛋白沉积的类似上调，并且比在正常或肺气肿肺标本中观察到的更广泛。

与正常肺相比，弹力蛋白基因表达上调与肌成纤维细胞（α-SMA阳性细胞）增殖相结合，使我们推测支气管和肺泡壁的弹力增生可能是最近弹力蛋白合成的结果。导致肌成纤维细胞丰度和弹性蛋白表达增加的特定信号在本例中尚不清楚。

致谢

这份手稿中报告的研究得到了国立卫生研究院HL54049和HL-P50 084922对R.A.P.以及美国肺脏协会RT-9702-N对A.S.的支持。

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文章来自国际慢性阻塞性肺病杂志由以下人员提供鸽子出版社