d日-柠檬烯增敏多西他赛诱导的人前列腺癌细胞的细胞毒性：活性氧的产生和诱导凋亡
和
塔盖扬·拉比
美国俄亥俄州罗茨敦44号州道4209号东北俄亥俄大学医药学院药学系，邮编：44272
阿努帕姆·比沙耶伊
美国俄亥俄州罗茨敦44号州道4209号东北俄亥俄大学医药学院药学系，邮编：44272
美国俄亥俄州罗茨敦44号州道4209号东北俄亥俄大学医药学院药学系，邮编：44272
通讯作者。 2009年1月5日收到；2009年3月14日接受。
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摘要
背景：
临床试验表明，多西他赛联合其他新药可以提高雄激素依赖性前列腺癌患者的生存率。d日-柠檬烯是一种非营养饮食成分，被发现可以抑制各种癌细胞的生长，且无毒。我们试图确定无毒剂量d日-柠檬烯可能增强肿瘤对多西紫杉醇的反应在体外前列腺癌转移模型。
材料和方法：
人前列腺癌DU-145和正常前列腺上皮PZ-HPV-7细胞用不同浓度的d日-柠檬烯、多西他赛或两者的组合，并通过MTT测定法测定细胞活力。测定细胞内活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸天冬氨酸酶活性。用酶联免疫吸附试验和Western blotting分别研究细胞凋亡和凋亡相关蛋白。
结果：
d日-与PZ-HPV-7细胞相比，柠檬烯和多西紫杉醇联合使用显著增强了对DU-145细胞的细胞毒性。DU-145细胞暴露于联合d日-柠檬烯和多西他赛导致活性氧生成增加，谷胱甘肽耗竭，同时半胱氨酸天冬氨酸酶活性增加。它还引发了一系列涉及细胞色素的效应c（c）caspase-9、3和聚ADP-核糖聚合酶的裂解，Bad:Bcl-xL比率的改变有利于细胞凋亡。使用N个-乙酰半胱氨酸，表明抗肿瘤作用是由ROS生成启动的，caspase级联导致细胞死亡。
结论：
我们的结果首次表明d日-柠檬烯增强了多西紫杉醇对前列腺癌细胞的抗肿瘤作用，但对正常前列腺上皮细胞没有毒性。这种联合的有益作用可能是通过调节线粒体凋亡途径中的蛋白质来实现的。d日-柠檬烯可作为一种有效的无毒药物，用于改善多西紫杉醇治疗激素难治性前列腺癌的疗效。
关键词：细胞凋亡，d日-柠檬烯、多西他赛、DU-145、前列腺癌、活性氧
简介
前列腺癌是美国癌症相关死亡的第二大原因。[1]尽管雄激素替代疗法最初有疗效，但大多数前列腺癌患者从雄激素依赖状态发展为激素抵抗型前列腺癌（HRPC），目前尚无治疗方法。[2]因此，迫切需要开发一种新的有效治疗策略，有效抑制激素和化疗难治性前列腺癌。使用多种药物的联合治疗是癌症治疗的常见做法。多西紫杉醇具有良好的临床活性，促使人们对将该药物与其他抗肿瘤药物（如足叶乙甙、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶和阿霉素）相结合产生了浓厚兴趣。[三,4]目前正在对一些含有多西他赛的联合用药进行临床评估，初步结果似乎令人鼓舞。尽管多西紫杉醇化疗已成为HRPC的一线标准，但根据两项大型随机试验的结果，前列腺特异性抗原应答很少超过50%，中位生存期不到20个月，因此，在该病中使用化疗仍是积极的临床研究课题。[5]多西紫杉醇治疗期间也遇到了一些问题，包括大多数患者的严重副作用。[6——8]联合治疗与一定程度的剂量相关毒性有关。因此，显然需要开发新的治疗策略，以提高基于多西他赛的HRPC治疗的疗效并减少副作用。
d日-柠檬烯是一种非营养性膳食成分，是几种柑橘油和其他一些精油的主要成分，已被发现可抑制癌细胞生长，且无毒。d日-柠檬烯含有90%以上的桔皮油，对啮齿动物的乳腺、肝脏和胰腺肿瘤具有化学预防和化学治疗作用。[9——11]因此，抗癌药物制剂的化疗活性d日-柠檬烯正在进行I/II期临床治疗试验的评估。[12]d日-柠檬烯作为一种药物，在可能具有临床活性的剂量下，对癌症患者具有良好的耐受性。乳腺癌患者在8 g/m剂量下的部分反应2/每天维持11个月，另外三名结直肠癌患者的病情稳定时间超过6个月d日-柠檬烯（0.5或1 g/m）2/天。[13]的化疗活性d日-柠檬烯可能是由于诱导细胞凋亡和再分化，同时甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II受体和转化生长因子B1的表达增加[14]d日-柠檬烯及其体内血浆代谢产物已被证明是小G蛋白（包括大鼠的p21ras）的蛋白异戊二烯化的抑制剂。[15]除了选择性地阻断小G蛋白的异戊二烯化之外，d日-柠檬烯还被证明具有额外的细胞效应，包括抑制辅酶Q的合成，并且它还能够使大多数晚期原发性大鼠乳腺癌完全消退，而无明显毒性。[16]
基于在体外和体内实验数据，我们假设d日-柠檬烯和多西紫杉醇可以克服前列腺癌细胞生长和存活过程中对凋亡信号通路的抑制。在当前研究中，我们评估了在体外抗肿瘤潜力d日-柠檬烯与多西他赛联合使用，使用人类前列腺癌DU-145细胞。我们还提供了数据支持我们的假设，即联合治疗会产生更大的抗增殖和促凋亡活性在体外.
材料和方法
细胞培养和试剂
人类前列腺癌DU-145细胞由Gail C.Fraizer博士（俄亥俄州肯特州立大学）善意提供。DU-145细胞在RPMI 1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中培养，在5%CO中添加1%青霉素/链霉素和5%胎牛血清2大气温度为37°C。PZ-HPV-7细胞保存在补充有5 ng/ml人重组表皮生长因子和5µg/ml牛垂体提取物。谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒购自开曼化学公司（密歇根州安阿伯）。这个N个-乙酰半胱氨酸（NAC）和鱼藤酮购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。6-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）是从分子探针（尤金，OR）中获得的。抗p21、p53、Bcl-2、细胞色素的抗体c（c）caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bax、Bad、Bcl-xL和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。d日-利莫内收到了佛罗里达化学公司（佛罗里达州温特哈文）的慷慨礼物。多西紫杉醇（购自马萨诸塞州沃本市LC实验室）溶于二甲基亚砜（DMSO）中以制备1 mM储备溶液，并将等分样品储存在−80°C下。储备溶液在使用前用培养基稀释至所需的最终浓度。
MTT法抑制细胞生长
以5×10的密度接种DU-145和PZ-HPV-7细胞三96周培养皿中每孔的细胞数。隔夜培养后，取出培养基，用含有不同浓度d日-如前所述，通过测量3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化染料（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）对活细胞的吸光度来测定柠檬烯、多西紫杉醇或两者的组合以及细胞活性。[17]抑制50%细胞群（IC）所需的浓度50)由剂量-反应曲线插值确定。
活性氧（ROS）的测量
通过检测O2和H2O（运行）2.[18]简言之，5×105细胞被放置在60毫米的培养皿中，放置过夜，然后单独或联合暴露于不同浓度的药物中指定的时间间隔。细胞被5µ月H2DCFDA在37°C下保持30分钟。收集细胞，在538 nm的发射波长和485 nm的激发波长下，使用微孔板荧光仪测量与细胞内ROS量成正比的DCF荧光强度。ROS水平表示为与对照样品的荧光相比，处理样品的荧光[（处理细胞的荧光/对照细胞的荧光）×100]。在单独的实验中，在药物暴露和ROS产生分析之前，用NAC预处理细胞。
谷胱甘肽测定
使用Cayman Chemical的试剂盒测定药物对细胞内GSH水平的影响。简单地说，DU-145细胞在37°C的特定时间段内暴露于药物。收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，再悬浮在PBS中，并进行计数。根据制造商的说明，使用来自每个治疗组的等量细胞测定谷胱甘肽。
酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞凋亡
细胞凋亡ELISA检测试剂盒（印第安纳波利斯州罗氏市）用于检测根据制造商的方案单独或联合用药后的细胞凋亡。简而言之，用多西紫杉醇和d日-柠檬烯单独或联合作用0、6、12、24和48小时，然后抽吸培养基，用冷PBS清洗细胞，并在细胞裂解缓冲液中冰上培养30分钟。然后刮除细胞，将裂解液收集在微型离心管中，并旋转以打破细胞聚集。通过在4°C下以5000 rpm离心10分钟来清除裂解液，并将上清液储存在−80°C下。蛋白质浓度由DC Bio-Read蛋白质检测试剂盒（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）测定。细胞用50溶解µ将g蛋白添加到试剂盒提供的裂解缓冲液中。然后将样品用移液管移到涂有链霉亲和素（streptavidin）的96 well微量滴定板上，在该板上添加免疫剂混合物，并在室温下以500 rpm的速度持续摇晃培养2 h。然后用洗涤缓冲液清洗微孔，并通过添加底物溶液显色，在405 nm下对照空白溶液或在参考波长490 nm下10-15分钟后读取底物溶液。通过除以样品吸光度（A405 nm）计算富集因子（指示细胞凋亡）通过未经处理的对照品的吸光度（A490 nm）。
半胱氨酸天冬氨酸酶活性检测分析
M30细胞死亡凋亡检测试剂盒（德国曼海姆罗氏）用于检测凋亡细胞。简单地说，细胞在盖玻片中生长，然后用药物单独或联合处理0、6、12、24和48小时。然后用冷PBS清洗细胞，在−20°C的冰镇纯甲醇中固定30分钟，并用清洗缓冲液清洗两次。取下洗涤缓冲液，在室温下用M30细胞死亡荧光素抗体工作液培养细胞1小时。绿色荧光染色的凋亡细胞用洗涤缓冲液洗涤两次，并根据供应商的方案在荧光显微镜下进行检查。
蛋白质印迹分析
为了测定DU-145细胞中的蛋白质表达水平，我们制备了细胞裂解物、细胞溶质组分，并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分离。电泳后，将蛋白质电转移到硝化纤维素膜上，用每个抗体进行印迹，并使用增强化学发光试剂（Amersham，Piscataway，NJ）进行检测。
统计分析
数据表示为平均值±标准误差（SE）。使用学生的t吨-测试，以及P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
多西他赛和d日-柠檬烯单独或联合作用对细胞生长的影响
增加多西他赛或d日-柠檬烯以剂量依赖的方式抑制DU-145细胞的增殖[图和]. 多西他赛和d日-柠檬烯分别为2.4 nM和2.8 mM。多西他赛和d日-柠檬烯对前列腺癌DU-145细胞的杀伤作用比具有IC的正常前列腺上皮PZ-HPV-7细胞更有效50值分别为4.4 nM和9.4 mM）。低IC40多西他赛剂量-反应曲线得出的浓度（1.9 nM）[]浓度为0.2-2.0 mMd日-在随后的实验中，柠檬烯被用于评估可能的化学增敏作用。d日-柠檬烯剂量依赖性导致多西他赛诱导的DU-145细胞毒性增强[]. docetaxol和d日-柠檬烯对DU-145细胞的增殖抑制作用大于正常前列腺上皮PZ-HPV-7细胞[].
多西他赛和d日-柠檬烯对前列腺癌DU-145和前列腺上皮PZ-HPV-7细胞生长的影响。（A） 细胞要么未经处理，要么用浓度增加的多西紫杉醇或（B）处理d日-柠檬烯；（C） 和（D）用多西紫杉醇单独或多西紫杉醇和d日-柠檬烯48小时，然后按照材料和方法中所述的MTT分析。数据表示三次测定的平均值±SE*P（P）与相应对照组相比<0.05。
多西他赛单独或联合用药的效果d日-柠檬烯对活性氧生成的影响
接下来我们研究了ROS在单一或联合治疗诱导前列腺癌细胞死亡中的作用。多西他赛单独治疗（1.9 nM）或联合治疗d日-柠檬烯（0.2 mM）以时间依赖的方式产生较高水平的ROS[]. 多西紫杉醇和d日-抗氧化剂NAC（浓度为10 mM）可有效阻止DU-145细胞中柠檬烯和ROS水平的增加[]. 抗氧化剂NAC有效抑制多西紫杉醇和联合治疗诱导的ROS生成，表明ROS可能是决定联合治疗对人前列腺癌DU-145细胞敏感性的重要因素。然而，10 mM NAC未能影响DU-145细胞中ROS的基础水平。这些结果表明，DU-145细胞中NAC的活性可能依赖于其抗氧化功能，也可能不依赖于其。此外，我们发现鱼藤酮（200 nM）（一种线粒体ROS阻断剂）的预处理完全减弱了联合处理诱导的DU-145细胞中ROS的产生[]这表明联合治疗产生的活性氧依赖于线粒体。我们推测多西紫杉醇与d日-柠檬烯可能导致谷胱甘肽消耗，加剧氧化应激。因此，我们确定了联合治疗对细胞内谷胱甘肽水平的影响，结果如下所示.多西紫杉醇与d日-与零时间对照组相比，柠檬烯作用6、12和24小时后，谷胱甘肽水平分别快速下降约67.3、77.3和86.4%。在相同的时间点，单用多西紫杉醇治疗导致GSH水平下降约54.5%、72.7%和76.4%。这些观察结果使我们得出结论，活性氧的产生可能涉及非线粒体机制和线粒体介导的现象。
多西他赛单独或联合治疗d日-柠檬烯导致DU-145细胞产生ROS。（A） 多西紫杉醇联合化疗后DU-145细胞的高DCF荧光d日-与单用多西他赛相比，柠檬烯用于指定时间。数据表示三次测定的平均值±SE*P（P）与相应对照组相比<0.05。（B） 用10 mM NAC预处理DU-145细胞2 h，然后单独或暴露于1.9 nM多西紫杉醇单独或与0.2 mM联合d日-柠檬烯12小时NAC预处理可防止多西紫杉醇和多西紫杉醇+d日-柠檬烯诱导DU-145细胞产生ROS。数据表示三次测定的平均值±SE*所示组之间存在显著差异(P（P）< 0.05). （C） 用200 nM鱼藤酮预处理DU-145细胞30分钟，然后单独处理或仅用多西紫杉醇处理或与d日-柠檬烯处理12小时，用于分析ROS生成。多西紫杉醇和d日-柠檬烯联合治疗介导的DCF荧光增强在鱼藤酮预处理中被显著抑制。数据表示三次测定的平均值±SE*所示组之间存在显著差异(P（P）< 0.05). （D） 1.9 nM多西紫杉醇单独或与0.2 mM联合治疗的DU-145细胞中GSH水平d日-柠檬烯用于指定的时间段。数据表示三次测定的平均值±SE*所示组之间存在显著差异(P（P）< 0.05). DOC，多西他赛；D-L、，d日-柠檬烯；NAC、，N个-乙酰半胱氨酸。
多西他赛单独或联合用药的效果d日-柠檬烯对DU-145细胞胞质组蛋白相关DNA断裂的影响
通过ELISA检测细胞质组蛋白相关DNA片段（单核和寡核小体）来研究细胞凋亡。用1.9nM多西他赛处理DU-145细胞6、12、24和48小时，诱导显著的细胞质组蛋白相关DNA断裂，相关富集因子分别为8、26、37和39[]. 这些结果表明，多西他赛以时间依赖性方式诱导DU-145细胞凋亡。我们进一步研究了多西紫杉醇治疗是否与d日-柠檬烯对DU-145细胞的死亡有致敏作用。如所示联合治疗以与单用多西紫杉醇相同的方式增强了凋亡细胞的死亡。为了进一步研究细胞内ROS水平升高与线粒体活化介导的细胞死亡途径之间的直接关系，在单次或联合治疗前用NAC预处理细胞。NAC的预处理显著减弱了联合治疗诱导的凋亡细胞死亡，表明ROS在d日-柠檬烯增强多西他赛诱导的细胞死亡[].
用单独的多西他赛（1.9nM）或多西他赛和d日-柠檬烯（0.2mM）。（A） 与多西他赛治疗组相比，联合治疗组的富集因子更高，表明凋亡反应增加。数据为平均值±SE(n个= 3). *P（P）与相应对照组相比<0.05。（B） 用10 mM NAC预处理DU-145细胞2 h，然后单独或暴露于1.9 nM多西紫杉醇单独或与0.2 mM联合d日-柠檬烯12小时NAC预处理可防止多西紫杉醇和多西紫杉醇+d日-柠檬烯诱导DU-145细胞凋亡。数据为平均值±SE(n个= 3). *所示组之间存在显著差异(P（P）< 0.05). （C） M30抗体染色（a）对照细胞，（b）多西他赛加d日-柠檬烯处理细胞6h、（c）12h、（d）24h、（e）48h和（f）多西他赛处理细胞48h，通过荧光染色测定caspases活性。DOC，多西他赛；D-L、，d日-柠檬烯；NAC、，N个-乙酰半胱氨酸。
多西他赛单独或联合用药的效果d日-柠檬烯对DU-145细胞caspase活性的影响
为了分析凋亡活性，使用荧光素结合小鼠单克隆抗体（克隆M30）评估细胞角蛋白18中特定caspase裂解位点的表达。与DMSO对照组相比，多西他赛+d日-柠檬烯治疗后6到48小时内显示出强烈的荧光素染色。特定治疗后荧光素与凋亡细胞结合的典型照片如所示.
多西他赛和d日-柠檬烯联合治疗对p21、p53、Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、细胞色素c释放、caspases和PARP蛋白表达的影响
以时间依赖性的方式分析了对Bax、Bcl-2、Bad、Bcl-xL、caspases和PARP蛋白表达的影响，以解释d日-柠檬烯对DU-145细胞多西紫杉醇活性的影响。为了确定线粒体途径是否参与诱导联合治疗后观察到的凋亡细胞死亡，我们检测了细胞色素的变化c（c）联合治疗后从线粒体释放到胞浆中。虽然我们没有观察到细胞色素c（c）未处理细胞胞浆中的表达，胞浆细胞色素水平c（c）随着时间的推移，在接受联合处理的细胞中显著增加[]. 当两种药物联合使用时，观察到caspase-9和caspase-3的裂解、p21和Bad的上调、PARP的裂解和Bcl-xL的下调均呈时间依赖性[]. 然而，我们无法检测到caspase-8裂解、Bax上调和Bcl-2下调（数据未显示）。野生型p53对肿瘤变化和肿瘤生长具有保护作用[19]在DU-145细胞中p53抑癌基因发生突变。[20]用d日-柠檬烯和多西他赛联合应用导致p53蛋白表达增加[]. 由于p53介导的转化抑制依赖于p53在Ser 15残基的磷酸化[21]我们用多西他赛和d日-柠檬烯组合。为此，我们使用了一种针对p53的磷酸化特异性抗体Ser 15。我们的Western blot分析显示，暴露于多西他赛和d日-柠檬烯混合物。综合治疗d日-在类似的实验条件下，柠檬烯和多西紫杉醇没有改变正常前列腺上皮PZ-HPV-7细胞凋亡线粒体途径的相关参数（数据未显示）。这些结果表明，多西紫杉醇治疗联合d日-柠檬烯通过线粒体功能障碍依赖性方式诱导DU-145前列腺癌细胞凋亡。
多西紫杉醇和d日-柠檬烯增加p21，p53，Bad，细胞色素c（c）在0-48小时内，Bcl-xL蛋白水平降低，caspase-9、caspase-3和PARP断裂。使用细胞溶质部分（细胞色素）进行免疫印迹c（c）)以及用1.9 nM多西紫杉醇和0.2 mM处理的DU-145细胞的细胞裂解物（用于所有其他蛋白质）d日-柠檬烯用于指定的时间段。剥离印迹，并用抗肌动蛋白抗体重制，以确保负载均匀。
讨论
凋亡在正常前列腺上皮和肿瘤前列腺的更新中起着重要作用，凋亡减少与局部浸润性前列腺癌向转移性疾病的进展有关。[22,23]由于恢复凋亡被认为是一种可能的治疗策略，大量研究致力于了解导致前列腺癌细胞对凋亡产生抵抗的细胞机制的异常。流行病学研究以及广泛的基本实验室发现支持植物化学物质在前列腺癌治疗中的潜在作用，至少是作为常规治疗的辅助剂。[24,25]多西紫杉醇属于紫杉烷类化疗药物，是紫杉醇的半合成类似物。多西紫杉醇的主要治疗模式是抑制微管的动态组装和拆卸，而不是微管捆绑，导致细胞凋亡和阻断Bcl-2表达。[26,27]多西紫杉醇在晚期HRPC的治疗中发挥着重要作用，但当肿瘤对多西紫杉醇产生耐药性时，需要进行积极的二线化疗。因此，包括多西紫杉醇单独或与其他药物联合的一系列试验正在进行中。[28——30]d日-柠檬烯是自然界中常见的萜烯之一，在单次和重复给药长达一年后，已证明其对人体具有低毒性。[31]
在本研究中，我们开发了基于多西他赛的有效联合化疗，用于治疗晚期前列腺癌在体外分析。与d日-柠檬烯致敏多西他赛诱导前列腺癌DU-145细胞在两种药物临床可达到浓度下的细胞毒性[31]这种组合明显显示出对癌细胞的细胞毒性在体外与正常细胞进行比较。细胞有一个精心设计的防御系统，用于防御自由基诱导的损伤，包括生成GSH、半胱氨酸和抗氧化酶，包括GSH过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。[32]进一步分析表明H2O（运行）2在多西他赛诱导的细胞死亡中作为活性氧的主要细胞毒分子。H（H）2O（运行）2被称为多种细胞死亡的细胞死亡介质，包括由肿瘤坏死因子-α、紫外线照射和其他抗癌药物诱导的细胞死亡。[33——35]多西紫杉醇单独诱导一定量的活性氧导致细胞死亡，而添加d日-柠檬烯产生了更多的活性氧，随后是更多的细胞死亡。在治疗期和非治疗期，细胞内ROS水平与多西他赛联合治疗的敏感性密切相关d日-柠檬烯。多西紫杉醇的暴露d日-柠檬烯生成H2O（运行）2-清除系统更快地分解，这通常被观察为GSH量的减少。联合治疗对前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞的不同影响可能是由于正常细胞中比恶性细胞中表达更有效的内源性抗氧化机制。据报道，多西紫杉醇下调前列腺癌细胞增殖、有丝分裂纺锤体形成、转录因子和肿瘤发生的几个基因，上调与诱导前列腺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞相关的其他几个基因，表明多西紫杉醇对前列腺癌细胞具有多效性作用。[36——38]
在这项研究中，我们确定无毒低剂量的d日-柠檬烯与多西紫杉醇联合治疗显示，柠檬烯对激素难治性DU-145前列腺癌细胞的凋亡作用显著增强。本研究表明，多西紫杉醇和d日-柠檬烯可以克服前列腺癌细胞对凋亡的抵抗，ROS的产生、caspase-9和caspase-3的激活可能在增强细胞毒性中起作用。然而，我们没有观察到单用多西紫杉醇或多西紫杉醇和d日-柠檬烯联合治疗DU-145细胞，其Fas表达较低（数据未显示）。
结论
这项研究的结果首次表明d日-柠檬烯增强多西紫杉醇对HRPC的抗肿瘤作用在体外对正常前列腺上皮细胞无任何细胞毒性。这可以通过下调多西他赛诱导的Bcl-xL表达和诱导caspase介导的凋亡来实现，至少部分是这样。这些观察结果值得进一步利用体内模拟人类前列腺癌进展形式的模型，以及对具有生物学意义的药物可达到剂量的估计在体外研究。这样的积极成果体内研究可以为使用d日-柠檬烯作为一种新的佐剂来改善多西紫杉醇对前列腺癌的化疗效果。
致谢
作者想感谢Sanjay Gupta博士（俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学）对这项工作的概念和在其实验室开始的一些实验所做的贡献。作者感谢Gail C.Fraizer博士（俄亥俄州肯特州立大学）提供DU-145细胞，感谢Jeanette Killius协助荧光显微镜工作，感谢Florida Chemical Company，Inc.（佛罗里达州温特哈文）慷慨赠送D-柠檬烯。作者要感谢DTE博士科内利斯·J·范德施伊夫（Cornelis J.Van der Schyf）的不断鼓励和支持，以及Altaf Darvesh博士对手稿的审阅。
参考文献
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