原发性胆汁性肝硬化与肝脏microRNA表达改变相关

2.2. RNA纯化和miRNA分离

冷冻肝组织在-20°C的RNA中孵育过夜后来®-ICE（德克萨斯州奥斯汀市Ambion），在RNA分离开始之前。25至100 mg平衡的肝组织在1 ml TriRegent®（分子研究中心公司，俄亥俄州辛辛那提）中均质，并根据制造商的方案分离总RNA。在-20℃下用1体积异丙醇沉淀RNA 1小时，然后在-20℃用3体积100%乙醇重新沉淀过夜。然后将沉淀的RNA重新悬浮在TE pH 7.0（10 mM Tris，0.5 mM EDTA）中。用纳米滴法测定RNA浓度和纯度。在从每个样本中分离miRNA之前，在15%变性丙烯酰胺凝胶（Invitrogen，Carlsbad，CA）上分析肝脏总RNA的质量。通过flashPAGE™（Ambion）凝胶分馏从10μg总RNA中分离出miRNA部分。

2.3. miRNA阵列

使用Bioanalyzer微流体系统（Agilent，Santa Clara，CA）上的PicoRNA芯片对所有纯化的miRNA组分进行定量，根据mirVana™miRNA标记试剂盒（Ambion）用AlexaFluor®555（Invitrogen）荧光染料标记，并与mirVana™miRNA生物阵列载玻片与1（Ambion）杂交根据制造商提供的协议。使用mirVana miRNA生物阵列基本试剂盒（Ambion）中的溶液进行杂交和洗涤，将标记探针在60°C水溶液中的真空离心机中蒸发至约2-3 ul的体积。然后将蒸发的探针重新悬浮在100 ul盐基杂交溶液中（印第安纳波利斯Ocimum Biosolutions）。所有标记、杂交和扫描步骤均在加州大学戴维斯分校ArrayCore Microarry设施的高效液相色谱和碳过滤洁净室中进行(http://array.ucdavis.edu). 杂交发生在Tecan HS 4800自动杂交站上。将预杂交溶液（5X SSPE/6M尿素/0.5%吐温-20/10X Denhardt’s）施加于50°C的载玻片上，并在培养基上搅拌15分钟。然后在95°C热块上变性三分钟后注入标记探针（探针通过涡流快速混合，以14000 rpm转速旋转，并在注入前冷却至室温）。荧光标记探针的所有步骤均在黑暗中进行。杂交在50°C下以中等搅拌频率进行16小时。杂交后，用预杂交缓冲液将载玻片浸泡15秒，然后用50°C的预杂交缓冲溶液冲洗15秒。然后在37°C下用三种浓度越来越高的Ambion盐缓冲液连续冲洗载玻片。每个缓冲液清洗步骤重复两次，浸泡时间为一分钟，然后搅拌清洗一分钟，共清洗六次。最后的水洗步骤在37°C下进行，浸泡时间为一分钟，然后进行一分钟的清洗。最后的清洗之后，在30°C的恒定氮气流下干燥载玻片。每个mirVana miRNA阵列载玻片用两个相同的阵列打印，作为技术复制品。使用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）在100%激光功率下扫描杂交miRNA阵列载玻片，Alexa 555（Invitrogen）标记探针的光电倍增管（PMT）设置为600nm，分辨率为5μm。使用GenePix Pro 4.0软件（分子器件）量化图像文件，该软件为每个阵列生成原始图像强度的输出文件。

2.4. 实时PCR验证

使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）从总RNA合成cDNA。根据制造商的方案，使用TaqMan MicroRNA检测试剂盒（ABI）中提供的miRNA-特异性干环引物对每个样品中的10 ng总RNA进行逆转录（RT）。RT产物在无核水中稀释6倍。实时PCR反应在最终体积为10μl的条件下进行，包括4μl稀释RT模板、0.5μl无核酸酶水、0.5μl TaqMan MicroRNA检测试剂盒（Applied Biosystems）中的20×引物/探针混合物和5μl 2×TaqMan-Universal PCR主混合物（无AmpErase UNG，Applied生物系统）。所有反应均在Applied Biosystems 7900 HT序列检测系统（Applied biosystem，Foster City，CA）上重复进行，使用384孔光学板格式。在95°C下进行初始10 min酶激活步骤后，在9600模拟模式下，将PCR参数设置为40个周期（95°C 15 s和60°C 1 min）。

2.5. 统计分析

将单色miRNA微阵列的原始表达数据加载到微阵列（limma）的线性模型中[22]开源统计编程环境R中的Bioconductor包(www.bioconductor.org)用于微阵列和基因组数据的综合分析。使用R中的减法校正背景，通过平均探针强度值的limma分位数归一化实现阵列间归一化（Aquantile方法）[23]. 对归一化和log2转换的miRNA表达数据的重复数据进行平均并导入UNIX工作站上运行的Cluster 3.0[24,25]. 数据以每个miRNA的平均值为中心，然后使用非中心相关度量对miRNA和样本进行无监督的质心链接层次聚类（HC）。为了折叠树状图的分支，HC之后是使用欧氏距离相似性度量的自组织映射。树状图和miRNA表达数据在Java TreeView中可视化[26].

对于RT-PCR结果，使用仪器的默认阈值设置来计算循环阈值（C_T型)每次跑步。比较C_T型方法2^-ΔΔC_T型用于计算所有样本相对于指定为校准品的非疾病肝脏RNA样本的miRNA表达变化[27,28]. 以组成性表达的小RNA分子RNU-48作为内源性对照进行分析标准化。确定ΔC_T型我们计算了平均值C_T型RNU-48控制并从平均值C中减去它_T型每个样本中的目标miRNA。ΔΔC_T型然后通过减去ΔC来计算_T型ΔC校准仪_T型样品的质量。将所得值与Mann-Whitney U检验进行比较（Prism与4）。

3.2 miRNA验证研究

我们使用实时PCR（RT-PCR）作为验证方法来验证从微阵列分析中获得的数据。36个差异表达miRNAs中6个的相对表达水平(表2)采用TaqMan microRNA分析（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行分析。我们选择了3个代表上调miRNA的引物/探针集（hsa-miR-299-5p、hsa-miR-328和hsa-miR 371）和3个代表下调miRNA的探针集（hsa-miR-26a、hsa-miR-122a和hsa-miR-99a）。每个引物/探针组的扩增效率通过生成一条标准曲线来确定，该标准曲线是使用10倍稀释系列的反转录miRNA获得的（数据未显示）。只有hsa-miR-371特异性引物/探针组的扩增结果不一致，因此未纳入我们的验证研究。除了miRNA微阵列实验中使用的样本外，我们还包括从PBC患者和非疾病对照组的肝组织中分离的补充RNA样本。我们推断，分析两个实验组额外样本的miRNA表达将使我们能够确定当样本量增加时，miRNA微阵列图谱是否由单独的方法维持。因为我们采用的TaqMan分析是基于RT-PCR的，有一个独立的反转录步骤来生成特定的miRNA，所以输入模板必须归一化为组成表达的内源性对照。为此，我们测试了对照引物/探针对（RNU-44、RNU-48和RNU-19），以确定其中哪些在人类肝组织中表达最一致。全部C_T型将数值标准化为小的内源性RNA物种RNU-48，然后与校准样品进行比较。

使用RT-PCR分析获得的结果证实了从初始微阵列筛选获得的数据(图2). 经TaqMan分析验证的五种miRNAs中，有三种在4期PBC患者的肝脏中与正常对照组相比存在显著差异。虽然hsa-miR-299-5p和hsa-miR99a的表达水平无法进行统计学验证，但其表达谱的总体趋势概括了微阵列实验的结果(表1).

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图2

选定miRNA微阵列结果的验证

使用RNU-48引物/探针对对每个miRNA引物/探测器集的实时阈值周期值进行标准化，并与校准品进行比较[28]. 将最终值导入统计软件Prism（第4版），并使用Mann-Whitney U检验进行分析。RT-PCR验证研究的结果与微阵列产生的结果相关

这项工作得到了国立卫生研究院拨款DK 39588和NCMHD/NIH P60/MD00222的支持。