异步Ca的机理²⁺激动剂诱导的大鼠基底动脉收缩波

摘要

引言

尿苷5'-三磷酸（UTP）是一种有效的脑动脉收缩剂，通过嘌呤能P2Y受体和磷脂酶C途径发挥作用(乌奎拉，1978年;斯特罗贝克等。, 1996;堀内等。, 2001). 脑组织特别富含UTP，与其他血管相比，脑血管对UTP的反应性更强(白泽明等。, 1983;哈德博等。, 1987). UTP可能在生理条件和疾病状态（如蛛网膜下腔出血或偏头痛）的病理生理反应下参与脑血管紧张的调节(德比（Debdi）等。, 1992;Boarder和Hourani，1998年;伯恩斯托克，1998年).

平滑肌收缩是由细胞内钙的增加引起的²⁺（[钙²⁺]_我)从~100 nmol·L的静止水平⁻¹值高达1µmol·L⁻¹一般来说，[Ca²⁺]_我刺激后的曲线是双相的，包括[Ca的快速瞬时上升²⁺]_我来自肌浆网（SR）Ca²⁺释放后进入高原期，由钙介导²⁺从电压门控Ca进入²⁺通道和存储/接收器操作的通道(范·布雷曼等。, 1978;博尔顿，1979年;斯特雷布等。, 1983;普特尼，1986年). 共焦显微镜的出现允许使用生理制剂来检测钙²⁺单个信号就地完整血管的血管平滑肌细胞（VSMC）。从那以后，很明显平均动脉壁[Ca²⁺]_我之前观察到的不代表Ca²⁺单个VSMC内能够产生Ca的信令事件²⁺具有不同空间和时间模式的信号（参见李等。, 2002). 这些信号中有Ca²⁺波，表现为[Ca的变化²⁺]_我它们沿血管平滑肌细胞的长度移动，构成一种特殊形式的激动剂诱导钙²⁺似乎与收缩调节有关的信号。自1994年首次描述以来²⁺在包括脑血管在内的各种完整血管的平滑肌纤维中观察到了波(伊诺等。, 1994;浅田等。, 1999;米丽尔等。, 1999;贾格尔，2001年;李等。, 2001;彭等。, 2001). 虽然钙信号可能有潜在的生理原因²⁺波（相对于稳态[Ca²⁺]_我海拔），Ca²⁺单个VSMC内的收缩信号波仍不清楚。

钙²⁺脑动脉中的波动可以由多种刺激引起，包括血管收缩激动剂，如UTP、压力和碱性pH(Jaggar和Nelson，2000年;贾格尔，2001年;赫普纳等。, 2002). 在脑动脉中，UTP刺激转移Ca²⁺火花到Ca²⁺通过肌醇-1,4,5-三磷酸受体（IP_三Rs）和ryanodine受体（RyRs）(Jaggar和Nelson，2000年). 根据对培养的基底动脉平滑肌细胞的研究，人们普遍认为UTP通过刺激的质膜Ca的组合诱导血管收缩²⁺入口和SR-Ca²⁺释放(司马等。, 1997). 然而，对激动剂诱导的钙之间的潜在机制知之甚少²⁺波及其与脑血管收缩的关系。

在我们目前的研究中，我们研究了UTP诱导Ca的机制²⁺大鼠基底动脉中的波，聚焦于钙的模式²⁺参与维持UTP诱导的钙周期性释放²⁺通过识别Ca²⁺转运分子参与UTP诱导钙的生成和维持²⁺波浪。

方法

结果

UTP诱导的张力收缩与UTP诱导钙的关系²⁺波浪

尿苷5'-三磷酸以浓度依赖性方式产生强直收缩，pEC₅₀4.34±0.13和最大响应（E_最大值)105.5±7.3%(n个=9只动物，图1A、B). 100µmol·L时⁻¹UTP，平均收缩率为70.3±4.5%(n个=12只动物，归一化为60 mmol·L⁻¹KCl）。在平行实验中，共焦显微镜用于观察[Ca的变化²⁺]_我UTP刺激后在VSMC内。在没有UTP的情况下，异步Ca²⁺在小比例（<10%）的细胞中观察到低振幅波，类似于“Ca”²⁺先前在大鼠尾动脉中描述的波纹(浅田等。, 1999). UTP诱导的大瞬态Ca的应用²⁺细胞内[Ca持续重复振荡后的反应²⁺]_我以Ca的形式沿VSMC的长度传播²⁺波浪(图1C和​和2）。2). 钙的频率²⁺波浪以浓度依赖的方式增加，与力的发展密切平行(图1D，pEC₅₀=4.74±0.14，最大频率=0.089±0.007 Hz，来自12只动物的109个细胞）。100µmol·L时⁻¹UTP，Ca的平均频率²⁺波为0.082±0.005 Hz(n个=8只动物的48个细胞）。显示Ca的单元格数²⁺波形也与浓度有关；100µmol·L时⁻¹UTP，91±2.5%的细胞显示至少一个Ca²⁺波浪(n个=来自8只动物的48个细胞，图1E). 波传播速度，如所示图1F也显示出对UTP浓度的强烈依赖性。在最高浓度下，波传播速度达到67.5±3.6µm·s⁻¹(n个=四只动物的10个细胞）。加利福尼亚州²⁺波起源于不同的细胞内病灶并沿单个VSMC的纵轴传播(图2). 它们似乎没有在细胞间繁殖，并在整个实验期间持续存在。

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图2

尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导的钙²⁺大鼠基底动脉的波。（A） [加利福尼亚州²⁺]_我UTP（100µmol·L⁻¹)刺激在Ca中描述²⁺从UTP诱导Ca的稳态中提取的痕迹²⁺波浪。应该注意的是，Ca²⁺波浪以不同的频率出现。实验钙²⁺痕迹是六只动物58个细胞的代表性结果。（B） UTP（100µmol·L）刺激大鼠基底动脉平滑肌细胞⁻¹)显示的Ca²⁺源自不同的细胞内病灶并沿着平滑肌细胞的纵轴传播的波（由AOI1和AOI2指示）。AOI的面积为3×3像素（1.69µm²). 比例尺=10µm。

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图1

尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导钙的性质²⁺大鼠基底动脉紧张性收缩波。（A） UTP（100µmol·L⁻¹)-诱发的紧张性收缩。痕迹代表了六只动物的结果。（B） UTP诱导的紧张性收缩的浓度响应曲线。pEC公司₅₀= 4.24 ± 0.13 (n个=9只动物）（C）在平行实验中，应用UTP（100µmol·L⁻¹)产生持续钙²⁺振荡。实验钙²⁺痕迹是六种动物58个细胞的代表性结果。（D） UTP诱导Ca频率的浓度响应曲线²⁺波pEC₅₀= 4.74 ± 0.14 (n个=来自12只动物的109个细胞）。（E） VSMC生成Ca的百分比更高²⁺信号随着UTP浓度的增加而增加。招募发生在3至1000µmol·L之间⁻¹，最大补充量为300µmol·L⁻¹大学转学分课程(n个=10只动物的90个细胞）。激发细胞的数量表示为对最大浓度作出反应的细胞的百分比。（F） 钙的表观传播速度²⁺波与UTP浓度增加相关(n个=来自11只动物的87个细胞）。

UTP诱导钙的依赖性²⁺细胞外钙上的波²⁺流入，流入

钙有两种潜在来源²⁺有助于生成UTP诱导的钙²⁺波浪：Ca²⁺从细胞内储存和钙释放²⁺从细胞外空间流入。测定细胞外钙的贡献²⁺UTP诱导钙的启动和维持²⁺波，细胞外钙²⁺在100µmol·L之前和期间去除⁻¹分别进行UTP刺激。去除细胞外钙²⁺在UTP刺激前立即降低Ca²⁺仅向少数瞬态Ca发送信号²⁺波浪(n个＝来自6只动物的39个细胞，图3A)，而UTP诱导的钙²⁺细胞外钙缺乏时，波完全消失²⁺治疗后1分钟内(n个=五只动物的34个细胞）(图3B)表明细胞外钙²⁺内流对钙的维持是必要的²⁺波浪。

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图3

细胞外钙²⁺维持尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导的钙需要内流²⁺波浪。（A） 去除细胞外钙²⁺持续UTP期间（100µmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺波在1分钟内消失。显示的痕迹代表了6只动物的39个细胞。（B） 去除细胞外钙²⁺UTP前一刻（100µmol·L⁻¹)刺激极限Ca²⁺向瞬态Ca发送信号²⁺波浪。显示的痕迹代表了五种动物的34个细胞。

为了进一步定义Ca²⁺参与维持UTP诱导的Ca的进入途径²⁺波，硝苯地平，L型钙的选择性抑制剂²⁺使用了通道和SKF-96365，一种受体和存储操作通道的抑制剂。硝苯地平（10µmol·L⁻¹)降低100µmol·L的频率⁻¹UTP诱导的Ca²⁺波动至对照组的59±4%，同时联合应用硝苯地平和SKF-96365（50µmol·L⁻¹)完全废除了Ca²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=8只动物的42个细胞）。同时，应用硝苯地平（10µmol·L⁻¹)显著降低紧张性收缩至对照组的52±4%(P（P）< 0.001,n个=6只动物），而SKF-96365（50µmol·L⁻¹)张力收缩降低至对照组的2.2±1.1%(P（P）< 0.001,n个=5只动物）(图4A、B). 还应注意，硝苯地平（10µmol·L⁻¹)完全消除60mmol·L诱导的收缩⁻¹KCl（未显示数据）。

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图4

L型钙的作用²⁺5’-三磷酸尿苷（UTP）（100µmol·L）的通道拮抗剂硝苯地平和受体/储存型通道拮抗剂SKF-96365⁻¹)-诱导钙²⁺波浪和张力收缩。（A） 钙的频率²⁺硝苯地平（10µmol·L⁻¹)申请，但未废除。添加SKF-96365（50µmol·L⁻¹). 记录中的中断表示间隔2分钟。（B） UTP（100µmol·L⁻¹)-硝苯地平（10µmol·L⁻¹)SKF-96365（50µmol·L⁻¹). ***P（P）< 0.001.

除了传统的质膜钙²⁺可渗透通道，Na⁺/钙²⁺以反向模式运行的交换器也是钙的重要途径²⁺VSMC中的条目(李等。, 2002;波布尔科等。, 2006;法梅利等。, 2007). 反向Na抑制剂KB-R7943⁺/钙²⁺低交换（≤10µmol·L⁻¹)浓度，用于检查反向Na⁺/钙²⁺交换参与支持对硝苯地平不敏感的Ca²⁺波浪(岩本等。, 1996;拉迪洛夫等。, 1999). KB-R7943（10µmol·L）的应用⁻¹)消除硝苯地平不敏感钙²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=6只动物的34个细胞），并将张力收缩抑制至对照的3.6±1.0%(P（P）< 0.001,n个=7只动物）(图5A、B). KB-R7943（10µmol·L）的应用⁻¹)自身也废除了UTP诱导的钙²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=四只动物的29个细胞）和张力收缩(P（P）< 0.001,n个=4只动物），表明Ca²⁺通过反向模式Na进入⁺/钙²⁺交换在钙的维持中起着重要作用²⁺即使在L型钙²⁺通道有效(图5C、D). 尽管KB-R7943（10µmol·L⁻¹)减少60 mmol·L⁻¹KCl诱导的张力收缩率为10.6%±3.0%，该效应不显著(P（P）= 0.08,n个=5只动物）(图6A). KB-R7943也可能抑制存储操作通道(荒川县等。2000年). 为了测试对存储操作通道的可能影响，我们使用UTP（100µmol·L⁻¹)刺激持续钙²⁺然后涂抹CPA（10µmol·L⁻¹)肌（内质网）钙的抑制剂²⁺-ATP酶，抑制SR-Ca²⁺重新摄取。这导致[Ca升高²⁺]_我KB-R7943对其无影响，尽管SKF-96365的添加带来了[Ca²⁺]_我到基线(图6B). 这表明KB-R7943并没有废除Ca²⁺通过阻断储存/受体操作的通道的波。同样重要的是要注意细胞外钠⁺-使用零-Na耗尽⁺PSS还废除了Ca²⁺波，这进一步支持了反向Na的作用⁺/钙²⁺交换（未显示数据）。

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图6

KB-R7943对L型钙的影响²⁺大鼠基底动脉中的通道和储存/受体操作通道。（A） 应用KB-R7943减轻60 mmol·L诱导的紧张性收缩⁻¹KCl增加10.6±3.0%(P（P）= 0.08,n个=5只动物）。（B） 尿苷5'-三磷酸（UTP）（100µmol·L）的应用⁻¹)然后是环己酸（CPA）（10µmol·L⁻¹)导致Ca持续升高²⁺KB-R7943（10µmol·L）的应用⁻¹)没有影响该平台反应，而添加SKF-96365（50µmol·L⁻¹)废除保留的Ca²⁺并恢复到预刺激基线水平。所示的典型痕迹是从四只大鼠的36个细胞中获得的典型反应。

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图5

反向模式Na的影响⁺/钙²⁺交换抑制剂KB-R7943对尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导钙的抑制作用²⁺波浪和张力收缩。（A） 反向封锁（Ca²⁺-入口）模式Na⁺/钙²⁺使用KB-R7943（10µmol·L）进行交换⁻¹)消除硝苯地平耐药UTP（100µmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=来自六只动物的34个细胞）（B）类似地，KB-R7943（10µmol·L⁻¹)也抑制硝苯地平不敏感的紧张收缩至对照的3.6±1.0%(P（P）< 0.001,n个=6只动物）（C）应用KB-R7943（10µmol·L⁻¹)单独降低UTP的频率（100µmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺一波接一波，随后彻底废除(P（P）< 0.001,n个=四只动物的29个细胞）（D）KB-R7943（10µmol·L⁻¹)单独使用还可消除UTP（100µmol·L⁻¹)-诱导性紧张收缩(P（P）< 0.001,n个=5只动物）。

UTP诱导钙的依赖性²⁺SR-Ca上的波²⁺释放

钙的全波或单波性质²⁺大鼠基底动脉信号提示再生钙²⁺从SR释放。如果是这种情况，则阻断SR Ca²⁺摄入应完全抑制钙²⁺波浪。CPA（10µmol·L）的应用⁻¹)持续UTP诱导的钙²⁺波浪导致钙的加宽²⁺海浪之后，它们完全消失，在基线上留下显著的提升[Ca²⁺]_我对应峰值的35±4%[Ca²⁺]Ca的²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=来自六只动物的38个细胞）(图7A). 平行地，CPA（10µmol·L⁻¹)对UTP诱导的紧张性收缩也产生79±2%的抑制作用(图7B，P（P）< 0.001,n个=5只动物）。

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图7

阻断肌（内）质网钙的作用²⁺环己烷酸（CPA）对尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导的钙的ATP酶²⁺波浪。（A） 添加CPA（10µmol·L⁻¹)持续UTP（100µmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺波浪完全消除了振荡，使基线Ca出现了一个小而显著的升高²⁺相当于峰值[Ca的35±4%²⁺]异步Ca的²⁺波浪(P（P）< 0.001,n个=来自五只动物的28个细胞）（B）应用CPA（10µmol·L⁻¹)产生79±2%的UTP抑制（100µmol·L⁻¹)-诱导性紧张收缩(P（P）< 0.001,n个=5只动物）。

钙²⁺SR的释放可以通过IP_三R和/或RyR。2-APB（100µmol·L⁻¹)IP抑制剂_三VSMC中的Rs(密西西比州等。, 2001)，用于检查IP的作用_三UTP诱导Ca中的Rs²⁺波浪。添加2-APB（100µmol·L⁻¹)至正在进行的Ca²⁺海浪立即将其摧毁(n个=5只动物的31个细胞），并将张力收缩抑制至对照水平的3.4±0.7%(P（P）< 0.001,n个=6只动物）(图8A、B). 此外，UTP（100µmol·L⁻¹)未能引出Ca²⁺用2-APB（100µmol·L⁻¹;图8C、D).

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图8

2-氨基乙氧基二苯硼酸盐（2-APB）对尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导钙的影响²⁺波浪和张力收缩。（A） 2-APB（100µmol·L）的应用⁻¹)立即废除UTP（100µmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺波浪(n个=来自五只动物的31个细胞）（B）2-APB（100µmol·L⁻¹)UTP降低（100µmol·L⁻¹)-诱导张力收缩至对照水平的3.4±0.7%(P（P）< 0.001,n个=6只动物）。（C） UTP（100µmol·L⁻¹)用2-APB（100µmol·L）预处理血管后的刺激⁻¹)30分钟内未能激发Ca²⁺响应(P（P）<0.0001时，n个=三只动物的24个细胞）。相反，不含2-APB（100µmol·L⁻¹)预培养，显示Ca²⁺UTP刺激后的波。（D） UTP（100µmol·L⁻¹)用2-APB（100µmol·L）预处理血管后刺激⁻¹)持续30分钟未诱发收缩(P（P）<0.0001时，n个=5只动物）与未经2-APB预孵育的对照血管进行比较。

因此，IP的开放_三UTP介导的血管收缩和钙需要Rs²⁺波浪。然而，由于2-APB的特异性受到质疑，在我们的制备中检查2-APB的选择性是很重要的，特别是在Ca²⁺RyRs、肌（内）质网Ca等易位体²⁺ATP酶、存储操作通道和L型钙²⁺频道。如所示图9A，用2-APB（100µmol·L）预处理⁻¹)对咖啡因（25 mmol·L⁻¹)-诱导钙²⁺释放（控制的103±8%，P（P）= 0.66,n个=5只动物），因此似乎对RyR无效。此外，2-APB对SR再充盈有轻微影响，因为第三种咖啡因诱导的Ca的峰值振幅²⁺瞬态略有下降，但没有显著下降13.4±4.1%(P（P）= 0.11,n个=6只动物）。

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图9

2-氨基乙氧基二苯硼酸盐（2-APB）对ryanodine敏感性肌浆网（SR）Ca的影响²⁺释放通道，肌（内质网）钙²⁺ATP酶，L型钙²⁺大鼠基底动脉的通道和储存通道。（A） 左：三次咖啡因脉冲（25 mmol·L⁻¹)每次脉冲之间间隔5分钟（打破记录）。咖啡因诱导Ca的最大振幅²⁺第一个脉冲的瞬态反射控制SR-Ca²⁺水平（以Ca计）²⁺通过打开的RyR通道从SR释放。添加2-APB（100µmol·L⁻¹)，第二次咖啡因脉冲产生一个钙²⁺最大振幅与第一脉冲相似的瞬态(P（P）= 0.66,n个=6只动物）。第三次摄入咖啡因会产生Ca²⁺与第一次脉冲相比，其最大振幅略微减小但不显著的瞬态(P（P）= 0.11,n个=6只动物）。右图：比较第二次和第三次咖啡因脉冲与第三次脉冲的平均最大振幅的条形图(n个=6只动物）。（B） 2-APB（100µmol·L）的应用⁻¹)60 mmol·L诱导的张力收缩减弱⁻¹KCl增加14.8±4.3%(P（P）=0.041，n个=6只动物）。（C） 尿苷5'-三磷酸（UTP）（100µmol·L）的应用⁻¹)然后是环己酸（CPA）（10µmol·L⁻¹)导致Ca持续升高²⁺（上面板）。2-APB（100µmol·L）的应用⁻¹)没有影响该平台反应，而添加SKF-96365（50µmol·L⁻¹)废除保留的Ca²⁺并恢复到预刺激基线水平（下面板）。所示的典型痕迹是从四只大鼠的30个细胞中获得的典型反应。RyR，ryanodine受体。

测试对钙的直接影响²⁺进入途径，2-APB对L型钙的影响²⁺通道和存储操作通道，这两个质膜通道对UTP介导的钙离子很重要²⁺对波浪进行了检查。2-APB（100µmol·L⁻¹)减少60 mmol·L⁻¹KCl诱导的张力收缩14.8±4.3%(图9B，P（P）= 0.041,n个=6只动物）。然而，这种对L型钙的轻微抑制²⁺通道不能解释2-APB对UTP诱导的紧张性收缩的完全抑制，因为它可以阻断L型钙²⁺含硝苯地平的经络只减少了52%的力量。

除了L-型Ca²⁺通道，存储操作的通道对保持钙也很重要²⁺波浪。据报道，2-APB对商店经营渠道有非选择性影响(布特曼等。, 2002). 首先用UTP（100µmol·L⁻¹)生成持续钙²⁺波，然后是CPA（10µmol·L⁻¹)用于抑制SR Ca²⁺再摄取，导致[Ca保持升高²⁺]_我和SR耗尽(图9C). 2-APB（100µmol·L）的应用⁻¹)不影响[Ca²⁺]_我高原，尽管Ca²⁺在随后添加储存操作的通道阻断剂SKF-96365（50µmol·L⁻¹)，表明在该制剂中，2-APB不会直接抑制存储操作的通道。

尽管IP开放_三UTP介导的钙需要Rs²⁺波浪和收缩，不排除Ca²⁺通过RyR释放，另一种SR-Ca²⁺释放通道在VSMC中具有重要的功能。为了评估RyRs的参与，高浓度ryanodine（200µmol·L⁻¹)和丁卡因（100µmol·L⁻¹)用于将RyR锁定在其闭合配置中。瑞安定和丁卡因对持续UTP诱导的钙离子频率均无影响²⁺波浪(P（P）= 0.67,n个=五只动物的33个细胞；P（P）= 0.71,n个=分别来自四只动物的29个细胞）或强直收缩(P（P）= 0.64,n个=5只动物；P（P）= 0.64,n个=6只动物）(图10A、B、C、D). 这支持了Ca²⁺RyR-相关SR存储的释放不负责钙的生成²⁺波浪。为了进一步探讨这一问题，通过与赖氨诺丁（50µmol·L⁻¹)然后短暂（1分钟）接触咖啡因（25 mmol·L⁻¹). 第一次接触咖啡因导致短暂的钙²⁺反应，而第二次接触会导致钙显著减少²⁺短暂的，而第三次未能激发出任何Ca²⁺完全是瞬态的(图10E). 我们解释了钙的最终缺乏²⁺对咖啡因的短暂反应表明钙的释放²⁺由于SR Ca耗尽，SR上的RyRs不再可能通过²⁺内容和/或在打开状态下锁定RyR。UTP（100µmol·L⁻¹)RyR敏感存储耗尽后立即刺激不再引发Ca²⁺响应。这些结果表明_三Rs和RyRs可以访问公共SR Ca²⁺但RyR的开放似乎对UTP诱导Ca的维持并不重要²⁺波浪。

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图10

兰尼定、丁卡因和咖啡因诱导肌浆网Ca耗竭的作用²⁺储存尿苷5'-三磷酸（UTP）诱导的钙²⁺大鼠基底动脉的波和张力收缩。（A） 应用高浓度（200µmol·L⁻¹)赖氨酸定对UTP诱导的钙无影响²⁺波浪(P（P）= 0.67,n个=五只动物的33个细胞）（B）Ryanodine（200µmol·L⁻¹)也不影响UTP诱导的张力收缩(P（P）= 0.71,n个=5只动物）。（C） 高浓度（100µmol·L⁻¹)丁卡因对持续UTP诱导的钙也没有影响²⁺波浪(P（P）= 0.71,n个=四只动物的29个细胞）（D）丁卡因（100µmol·L⁻¹)对UTP诱导的张力收缩无明显影响(P（P）=0.64，n个=5只动物）。（E） 确定RyR-敏感SR-Ca耗竭的影响²⁺将动脉暴露于三种1分钟的咖啡因（25 mmol·L⁻¹)在连续存在ryanodine（50µmol·L⁻¹)导致SR Ca耗尽²⁺商店。咖啡因的第二次刺激产生了大量减少的钙²⁺短暂，而第三次刺激不产生Ca²⁺响应。SR-Ca耗尽后²⁺储存，UTP刺激（100µmol·L⁻¹)在有ryanodine存在的情况下，未能诱导Ca²⁺响应。记录中的中断表示间隔5分钟。赖氨酸受体。

讨论

强直性血管收缩是基于非同步钙的概念²⁺单个平滑肌细胞中的波对我们关于钙的分子机制的观点产生了深远的影响²⁺平滑肌中的信号。激动剂诱导钙的存在²⁺脑动脉中的波已经被不同的组记录下来(Jaggar和Nelson，2000年;贾格尔，2001年;赫普纳等。, 2002)，但尚未对其潜在机制进行详细调查。我们已经研究了激动剂诱导的钙之间的联系²⁺使用就地制备大鼠基底动脉，并系统研究了这些钙的离子机制²⁺波，似乎与VSM中描述的来自较大导管血管的波相似(李等。, 2002). UTP诱导钙的研究²⁺波在等长拉伸的动脉中进行，这与UTP诱导Ca的条件相似²⁺首先描述了波浪(Jaggar和Nelson，2000年)并可能为基底动脉壁张力的调节提供新的线索。

对UTP的反应以钙的重复瞬时升高为代表²⁺它起源于不同的细胞内病灶，然后以波的形式在平滑肌细胞的长度上传播。细胞相互独立反应，因为钙²⁺波是异步的，细胞对UTP的敏感性不同，因此响应细胞的招募随着UTP浓度的增加而增加。此外，传播速度和频率也随着UTP浓度的增加而增加(图1C，D). 从功能上看，Ca²⁺波是强直收缩的基础，因为它们对硝苯地平、SKF-96365、KB-R7943或2-APB的抑制与完全抑制力量有关(图4，​,55和​和8）。8). 最后，相邻VSMC之间缺乏同步性解释了单个细胞Ca的总和²⁺波浪可以导致强直性收缩，因为Ca的总和²⁺所有细胞中的信号平均为稳态Ca²⁺全船增加(吕尔曼等。2000年;毛班等。, 2001). 钙的明显重要性²⁺当CPA取消强直收缩波后，力量显著减少80%，尽管平均[Ca²⁺]_我仍显著高于基线(图7). 这表明力较高-[Ca²⁺]_我当VSMCs被Ca激活时的比率²⁺与持续[Ca相比的波²⁺]_我表明Ca²⁺波代表了一种更有效的钙传递方法²⁺激活与收缩丝相连的肌球蛋白轻链激酶(李等。, 2001;威尔逊等。, 2002). 然而，最终收缩是由肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化水平决定的，MLC是钙²⁺-依赖性和钙²⁺-独立的，独立的(韦伯等。, 1999). Ca的方式²⁺波浪，与Ca的稳态高程相对²⁺，可能与这种磷酸化水平有关尚不清楚。需要进一步的研究来确定钙是如何在生理学上解释的²⁺波是收缩的信号。

UTP诱导的钙²⁺波似乎是由再生钙传播的²⁺从SR网络中释放，作为SR Ca的消耗²⁺有CPA的商店取消了Ca²⁺波浪(图7). 细胞外钙²⁺内流似乎对钙的维持至关重要²⁺波浪，尽管钙的能力²⁺在没有钙的情况下持续一段时间的波浪²⁺可能是由于几个Ca²⁺运输机制。在平滑肌中，一定比例的Ca²⁺SR释放的物质不可避免地被质膜Ca的作用挤压到细胞外空间²⁺ATP酶和钙²⁺-游离介质全钙²⁺SR的释放不可逆转地丢失到细胞外空间(Leijten和van Breemen，1986年). 然而，钙的去除²⁺朝向细胞外空间与SR-Ca竞争²⁺通过肌（内质网）钙的再摄取²⁺ATP酶，使SR继续释放减少的钙²⁺维持钙²⁺波浪。最后，钙的第三种机制²⁺Ca期间SR卸载²⁺-游离条件是Ca的转移²⁺外围RyR向正向模式（Ca）释放²⁺-挤压）Na⁺/钙²⁺交换，一种在血管平滑肌细胞和内皮细胞中描述的机制(Nazer和van Breemen，1998年;梁等。, 2004). 因此，在不重新填充SR的情况下，所有Ca²⁺最终挤压，导致Ca消失²⁺波浪。

细胞外钙流入²⁺通过L型钙²⁺经络是控制脑血管血管直径的核心(纳尔逊等。, 1990). 然而，有趣的是，UTP诱导的钙²⁺硝苯地平并没有消除电波，只是降低了频率。频率降低的一个机制是缺乏刺激性钙²⁺通过L型钙的流入²⁺通道可能会降低SR-Ca的再填充速率²⁺商店。As SR管腔Ca²⁺可以调节IP_三R通道开放概率，SR-Ca的降低率²⁺重新填充可能导致SR-Ca的频率降低²⁺起浪点释放(Meldolesi和Pozzan，1998年). 类似地，阻断L型钙²⁺加压小鼠肠系膜动脉中的通道消除了肌源性张力，也降低了苯肾上腺素诱导的Ca的频率²⁺波浪(扎卡里亚等。, 2007). 然而，压力诱导Ca²⁺地尔硫卓可完全消除小鼠脑动脉中的波(贾格尔，2001年). 虽然较大的脑血管，如基底动脉，具有阻力血管的某些特性(丰田章男等。, 1996)这些不同的观察结果可能是组织差异的结果，与各种钙的相对参与有关²⁺进入机制。此外，这些明显的机械差异也可能归因于不同的生理条件，例如加压与张力。例如，肌原性张力的发展可能影响钙²⁺激动剂诱发的信号(扎卡里亚等。, 2007). 因此，Ca的机制之间的比较²⁺波浪必须考虑到血管床和实验准备的差异。

本研究的另一个主要发现是UTP诱导的钙²⁺波被KB-R7943（一种反模式钠的抑制剂）消除⁺/钙²⁺交换介导钙²⁺穿过质膜进入(岩本等。, 1996;拉迪洛夫等。, 1999). 质膜Na⁺/钙²⁺交换器是一种跨膜蛋白，通常与钠的内流耦合⁺钙流出的离子²⁺3:1比例的离子(菲利普森和尼科尔，2000年). 然而，Na⁺通过功能上与Na耦合的受体和存储操作通道进入⁺/钙²⁺交换器可能影响钠的动力学⁺/钙²⁺交换，作为Na⁺在表面SR和质膜之间的有限的质膜下间隙中局部积聚(阿诺等。2000年;波波科等。, 2004;莱莫斯等。, 2007). 亚细胞钠的积累⁺假设改变电化学梯度以利于钙²⁺Na反转流入⁺/钙²⁺换热器，换热器反过来重新填充SR-Ca²⁺商店(李等。, 2001). 这可以解释我们的发现，硝苯地平抗性钙²⁺波和紧张性收缩对SKF-96365和KB-R7943同样敏感，SKF-96365是储存和受体操作通道的抑制剂。

然而，为了实现Na的逆转⁺/钙²⁺交换剂，质膜下钠⁺浓度（[Na⁺]_{子项目经理})必须至少达到K级_米换热器。尽管[Na⁺]_{子项目经理}我们从我们对大鼠主动脉平滑肌细胞的研究中预测到，在这种制剂中没有进行测量⁺/钙²⁺当[Na⁺]_{子项目经理}超过23–25毫摩尔·升⁻¹，假设E_米=−60毫伏，E_NCX公司=3E_纳−2E_钙，[钙²⁺]_o（o）=1.2毫摩尔·L⁻¹，[钙²⁺]_{子项目经理}=500µmol·L⁻¹和[Na⁺]_o（o）=145毫摩尔·L⁻¹（其中[Ca²⁺]_o（o）=细胞外[Ca²⁺]，[钙²⁺]_{子项目经理}=质膜下[Ca²⁺]，和[Na⁺]_o（o）=细胞外[Na⁺]) (波波科等。, 2006). 最近，波波科等。首次直接证明了钠的局部亚细胞增加⁺通过接收器操作/存储操作通道至≥30 mmol·L⁻¹(波布尔科等。, 2007)，这与Na的估计一致⁺范围为24至40 mmol·L⁻¹心室肌细胞内(温特·加里特利等。, 1993;伊森伯格等。, 2003). 此外，质膜下Na的空间常数⁺心室肌细胞的梯度为28 nm，这与大鼠基底动脉准备中PM-SR连接处的膜间分离（～20 nm）高度一致（未发表的观察结果）。此外，鉴于大鼠基底动脉的静息膜电位约为−43 mV(Haddock和Hill，2002年)去极化膜减少[Na⁺]_{子项目经理}需要反转Na⁺/钙²⁺交换，似乎似乎反向模式Na⁺/钙²⁺交换是钙的一种生理途径²⁺进入大脑动脉。这一点尤其重要，因为我们发现KB-R7943可以消除钙²⁺波表明SR再填充严重依赖于反向Na⁺/钙²⁺UTP刺激期间的交换(图5C). 尽管仍需调查，但这可能是钙的特权递送的一个例子²⁺从位于一个膜中的转运点到第二个Ca²⁺反膜中的转运位点，是一个绕过细胞质自由扩散的过程(波波科等。, 2004;法梅利等。, 2007). 除了抑制反向Na⁺/钙²⁺交换，KB-R7943也被报道对L型钙有影响²⁺和存储操作通道、神经元烟碱乙酰胆碱受体、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和去甲肾上腺素转运体(和田野等。, 1996;Sobolevsky和Khodorov，1999年;荒川县等。2000年;岩本，2004年). 然而，在我们的制剂中，KB-R7943并不显著抑制L型钙²⁺通道或存储操作通道，支持这是反向Na的概念⁺/钙²⁺交换，这对重新填充SR以保持Ca很重要²⁺波浪。

尿苷5'-三磷酸对代谢性嘌呤能P2Y受体产生影响，并被证明增加钙²⁺通过增加细胞质肌醇1,4,5-三磷酸[Ins（1,4,5）P释放_三] (斯特罗贝克等。, 1996;司马等。，1997年). 调查IP的作用_三Rs，我们使用了2-APB，一种IP的小分子量膜渗透调节剂_三R（右）(密西西比州等。, 2001). 然而，它用于阻止IP_三Rs因其对其他离子传输机制的非特异性影响而受到批评，尤其是其对存储操作通道的抑制(广泛等。, 2001;妈妈等。, 2001;Ratz和Berg，2006年). 重要的是，在我们的准备工作中，2-APB立即废除了正在进行的Ca²⁺波和张力收缩，不影响咖啡因释放钙²⁺存储，这与2-APB阻止IP的操作一致_三卢比(图9A). 此外，与2-APB预孵育并没有诱导Ca²⁺反应或收缩。它对SR Ca也只有轻微的非显著影响²⁺重新摄取。2-APB对储存操作的通道没有显著抑制作用，尽管它确实影响L型钙²⁺通道，观察到的轻微抑制不可能解释Ca的消除²⁺波浪(图9B、C). 因此，我们的研究结果支持知识产权开放的概念_三R通道不仅负责初始Ca²⁺释放，但随后的钙再生释放也需要²⁺钙的传播²⁺波浪。乙酰胆碱诱导的钙²⁺大鼠门静脉肌细胞中的波也依赖于IP的激活_三Rs，尽管有趣的是IP_三R2亚型，对钙最敏感²⁺似乎对钙的繁殖至关重要²⁺波浪(莫雷尔等。, 2003;弗里茨等。, 2008). 还应注意的是，Ca²⁺波由IP的固有灵敏度维持_三R2亚型到细胞溶质[Ca²⁺]_我，而不是由于Ins（1,4,5）P的振荡_三水平(弗里茨等。, 2008). 大鼠基底动脉的一种可能情况是UTP诱导Ca²⁺波浪始于Ins（1,4,5）P的高程_三.Ins（1,4,5）P_三使IP敏感_三R到Ca²⁺，以及当Ca²⁺达到阈值浓度，释放通道打开(斯特雷布等。, 1983;费里斯等。, 1992). 随着UTP浓度的升高，Ins（1,4,5）P的浓度_三和基底[Ca²⁺]_我也会增加，从而缩短钙所需的时间²⁺达到触发下一波的阈值。再生性质取决于Ca增加的正反馈²⁺关于Ins（1,4,5）P_三IP灵敏度_三R.这种机制，结合InsP_三使IP敏感_三R到Ca²⁺，确保频率和速度随UTP浓度的增加而增加。然而，对Ins（1,4,5）P的了解_三在建立这一机制之前，我们需要在准备过程中进行动态分析。

观察到的2-APB效应表明IP的重要作用_三UTP诱导Ca的启动和维持中的Rs²⁺但不排除RyR的参与。虽然人们普遍认为，振荡和波的启动是对激动剂作用于肌膜受体释放钙的反应²⁺通过IP从SR_三Rs，Ca与否仍有争议²⁺从IP中释放_三然后，Rs激活RyRs以通过Ca产生进一步释放²⁺-诱导钙²⁺-释放并传播波，或者整个释放过程是否来自IP_三Rs无重大RyR参与(麦克卡伦等。, 2003). 前一项建议得到了研究的支持，研究表明阻断RyRs的药物通常会消除Ca²⁺由Ins（1,4,5）P引发的振荡_三-生成激动剂(海韦林等。1998年;布瓦坦等。, 1999;Jaggar和Nelson，2000年). 这可能是由于RyR和IP的共同本地化_三Rs，允许Ca²⁺由IP本地发布_三Rs通过Ca激活RyRs的相邻簇²⁺-诱导钙²⁺释放(Gordienko和Bolton，2002年). 另一方面，一些缺乏钙的制剂²⁺-诱导钙²⁺释放机制仍显示Ca²⁺波浪(DeLisle和Welsh，1992年;Lechleiter和Clapham，1992年). 此外，在受压的大鼠肠系膜动脉中，RyRs似乎在激动剂刺激的Ca中不起作用²⁺波浪(拉蒙特和维尔，2004年). 值得注意的是，许多利用药理学工具抑制RyRs的研究，如植物生物碱ryanodine，因不同组织中的浓度依赖性效应而变得复杂。例如，低浓度（<100µmol·L⁻¹)赖氨酸定引起持续的通道开放，可能导致存储耗尽(卢梭等。, 1987，坎穆拉等。, 1988，徐等。, 1994)而据报道，较高的浓度会将RyRs锁定在闭合状态以抑制Ca²⁺释放(Fill和Copello，2002年). 此外，这些药物还可以阻断Ins（1,4,5）P_三-介导的钙信号本身（直接或间接），而RyR不参与钙²⁺增加。

在我们的制备过程中，RyR敏感Ca的耗尽²⁺使用咖啡因和低浓度ryanodine组合将RyRs锁定在亚导电状态的商店消除了UTP诱导Ca的能力²⁺波浪(图10). 兰尼定浓度（50µmol·L⁻¹)我们使用的浓度大于已知的浓度，可以将RyRs锁定在平滑肌的开放状态(伊诺等。, 1988;坎穆拉等。, 1988). 这表明IP_三R和RyR都访问一个公共SR-Ca²⁺储存，使RyR储存耗尽，防止Ca²⁺波浪，正如已经证明的那样(Leprete和Mironenau，1994年;McCarron和Olson，2008年)，但不能证明RyRs参与Ca的传播²⁺波浪。因此，我们使用高浓度的兰尼定（200µmol·L⁻¹)将RyR锁定在闭合配置中，发现UTP诱导的Ca²⁺波浪没有受到影响(图10). 此外，我们使用了丁卡因（200µmol·L⁻¹)它不依赖RyRs的开放来发挥其作用，并且还发现Ca²⁺波浪没有受到影响(约克等。, 1997). 这与大鼠大脑动脉形成对比，其中赖氨酸定（10µmol·L⁻¹)抑制UTP诱导的钙²⁺波浪(Jaggar和Nelson，2000年). 然而，应该注意的是，在相同的制剂中，ryanodine也抑制Ca²⁺火花，很可能是SR Ca引起的²⁺存储耗尽。此外，另一种可能性是，在我们的准备工作和其他工作中，RyR没有发挥作用，因为它们没有定位在IP附近_三Rs.然而，严格控制IP的双重标签_三在得出这样的结论之前，需要电子显微镜分辨率下的Rs和RyRs。

值得注意的是，UTP诱导的异步Ca的机制²⁺本研究中引发的波与钙的机制有一些相似之处²⁺依赖于功能性SR的硝苯地平不能消除自发血管运动引起的振荡，而IP拮抗剂可以消除这些振荡_三(Haddock和Hill，2002年;2005). 鉴于异步Ca²⁺波通常先于血管的节律性收缩或血管运动，这种收缩或血管收缩是自发发生的，或是对高浓度激动剂刺激的反应，可能具有生理和病理生理学意义(格拉顿等。1998年;哈德茨等。1998年，岛村等。, 1999;吕克尔等。2000年). 在激动剂刺激的血管运动中，异步钙²⁺波浪首先在没有产生张力的情况下开始。存在内皮细胞时，[Ca的周期性增加²⁺]_我激活cGMP依赖性钙²⁺-敏感氯离子^-导致Cl的通道^-周期性地使膜去极化的电流。去极化迅速扩散至邻近细胞并激活L型钙²⁺通道，促进钙²⁺促进钙的内流²⁺-诱导钙²⁺-释放以启动下一个Ca²⁺波，然后在所有邻近的平滑肌细胞中同时发生，并产生振荡的血管运动(彭等。, 2001;拉赫曼等。, 2005).

同样，对于自发血管运动，钙同步性的触发因素²⁺波被认为是由于氯化物依赖性钙的激活²⁺通道(哈多克和希尔，2002年). 由此产生的去极化迅速扩散到邻近细胞，如L型钙²⁺通道同时激活。生成的Ca²⁺然后流入促进钙²⁺-诱导钙²⁺释放以启动同步Ca²⁺释放和收缩。在研究中Haddock和Hill（2002年)，同步Ca²⁺阻断L型钙后，波消失²⁺硝苯地平通道，但异步钙²⁺振荡持续存在于单个细胞中，这支持了以下假设：L型钙的夹带²⁺通道在同步钙中很重要²⁺振荡。钙的同步²⁺血管舒缩的血管平滑肌细胞之间的振荡严重依赖于钙的协调²⁺单个VSMC内的信号导致同步Ca²⁺反应和沿血管长度同时收缩的发展(天哪等。, 1996). 在小血管中，这种协调可能依赖于完整的内皮细胞，这可能是我们没有观察到同步钙离子的原因之一²⁺我们的准备中UTP刺激后的波(Haddock and Hill，2005年).

总之，本文中的数据表明²⁺转运蛋白参与钙的生成²⁺UTP中的波刺激大鼠基底动脉的平滑肌细胞。这些Ca²⁺波似乎是由SR-Ca的重复循环产生的²⁺由IP介导的释放_三Rs，其次是肌（内质网）Ca²⁺-ATP酶介导的SR Ca²⁺钙的再摄取²⁺涉及L型钙的条目²⁺通道、受体/存储操作通道和反向Na⁺/钙²⁺交换。一般来说，钙的作用机制²⁺基底动脉中的波类似于大导管血管中的波，这可能表明常见的钙²⁺启动和维持钙的信号机制²⁺脉管系统中的波动。

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