肿瘤。2009年7月；11(7): 637–650.
基于吉西他滨的Ad-dCK:：UMK-GDEPT和TS/RR siRNA策略的胰腺癌化疗1
消化癌研究所，肿瘤生物学和基因治疗部，IRCAD-INSERM 701单元，F67091，法国斯特拉斯堡
2009年1月2日收到；2009年3月26日修订；2009年4月20日验收。
版权©2009 Neoplasia Press，Inc.版权所有 摘要
吉西他滨是晚期胰腺癌治疗的一线药物。然而，其疗效往往受到其细胞内代谢不良和化疗耐药性的限制。为了发挥其抗肿瘤活性，吉西他滨需要转化为其活性的三磷酸形式。因此，我们的目的是通过基于吉西他宾与脱氧胞苷激酶：：尿苷单磷酸激酶融合基因（dCK:：UMK）的基因导向酶前药疗法来提高吉西他汀的活性以及针对核糖核苷酸还原酶（RRM2）和胸苷酸合成酶（TS）的小干扰RNA。体外，用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-3,5-二苯基四唑溴和[三H] 胸苷分析。通过逆转录聚合酶链反应、Western blot和ELISA分析凋亡相关基因的表达和活性。对于体内研究中，在皮下和原位胰腺肿瘤模型上评价了其治疗效果。我们的数据表明，与BxPc3-和HA-hpc2-敏感细胞相比，细胞暴露于吉西他滨诱导Panc1耐药细胞中dCK表达下调，TS和RR表达上调。TS/RRM2小干扰RNA与Ad-dCK:：UMK联合使用可使吉西他滨IC降低40倍50在Panc1细胞中。这种强烈的致敏性与凋亡诱导有关，TRAIL表达显著增加，吉西他滨诱导的核因子-κB活性降低。体内以吉西他滨为基础的三种疗法显著减少了肿瘤体积，并显著延长了小鼠生存期。此外，我们观察到接受三种治疗方案的肿瘤细胞凋亡明显增加，细胞增殖减少。总之，这些发现表明，同时沉默TS/RRM2-基因和过度表达dCK:：UMK基因显著提高了吉西他滨的治疗活性。显然，这种综合战略值得进一步调查。
介绍
胰腺癌是最致命的癌症之一。胰腺癌的5年生存率仅为3%，中位生存期不到6个月，诊断对患者来说是致命的。这种趋势是高度侵袭性的局部区域，导致无法进行治疗性手术[1]. 常规化疗和放疗单独或联合对胰腺癌患者的总体生存率影响有限[2]. 最近，吉西他滨（2′，2′-二氟脱氧胞苷）已成为局部晚期和转移性胰腺癌的一线治疗药物[3–5]. 它是固体肿瘤（包括卵巢癌、非小细胞肺癌和胰腺癌）的单一药物或与其他细胞毒性药物联合治疗的选择[6–8].
吉西他滨的抗肿瘤活性是通过其磷酸化代谢产物发挥的。核苷转运蛋白跨细胞膜移位后[9]吉西他滨通过脱氧胞苷激酶（dCK）在速率控制步骤中磷酸化为单磷酸（dFdCMP）形式。然后，其他核苷激酶进一步磷酸化dFdCMP，使其形成两种活性的二磷酸和三磷酸（dFdCTP）形式[10–12]. dFdCTP与天然脱氧胞苷三磷酸类似物竞争掺入DNA和RNA[13,14]，导致屏蔽链终止[11,12]，并抑制CTP合成酶。此效果会阻止从头开始DNA合成途径。
不幸的是，尽管吉西他滨具有对抗癌细胞的活性，但其在胰腺癌中的反应率仍然很低，在临床病例中的客观反应低于20%[3–5]. 注射后，吉西他滨的活性三磷酸代谢物磷酸化不良，迅速失活，出现化疗耐药性。在吉西他滨治疗期间或之后获得的众多耐药机制中，由于细胞摄取效率低、吉西他宾活化水平降低或药物降解增加，导致细胞内dFdCTP浓度不足[15].
在本研究中，我们假设直接参与吉西他滨代谢的酶的表达/活性改变是化疗耐药的重要形式。dCK活性不足被认为是导致吉西他滨耐药的主要机制之一。几位作者描述了获得性吉西他滨耐药细胞中dCK活性与吉西他宾敏感性之间的关系[16–18]. 在这种情况下，基因治疗可以增强吉西他滨的代谢，从而提高肿瘤细胞对该前药的反应性。一些研究强调了通过在缺乏这种酶的肿瘤细胞中过度表达dCK来限制吉西他滨磷酸化的第一步，显示出对吉西他宾敏感性的恢复[15,19,20]. 此外，过表达尿苷单磷酸激酶（UMK）可以改善吉西他滨的磷酸化。UMK将CMP、UMP和dCMP磷酸化为各自的二磷酸形式[21]UMK在脱氧胞苷类似物的激活中起着重要作用[22,23]. 结合dCK和UMK的融合基因被证明能有效地使仓鼠胰腺癌细胞对吉西他滨治疗敏感[24].
同时，一些数据支持吉西他滨耐药也可能依赖于核糖核苷酸还原酶（RR）和胸苷酸合成酶（TS）过度表达的假设[25,26]. 因此，以TS和RR为靶点的小干扰RNA（siRNA）对特异性TS和RR-基因沉默具有重要意义。最近，研究表明，靶向RR活性亚单位的RRM2 siRNA增强了吉西他滨诱导的细胞毒性在体外和体内[26,27]. 显然，TS和RR表达的同时抑制将以不同方式促进对吉西他滨的敏化，包括逆转dCK活性抑制，以及竞争性地将dFdCTP并入DNA。
本研究的目的是通过增加吉西他滨的合成代谢，尤其是对dCK、TS和RR酶的作用，提高吉西他宾的疗效。我们研究了dCK、TS和RR表达的潜在变化，并检查了吉西他滨治疗的改善是否可以通过抗癌基因导向酶前药治疗（GDEPT）策略来实现，该策略提供增强的dCK:：UMK融合基因表达，并与特异性TS与RR基因沉默相关。为此，使用一种表达dCK:：UMK融合蛋白的腺病毒和针对TS和RRM2的siRNA，以促进吉西他滨转化为其毒性磷酸化代谢产物，并规避现有的化疗耐药性。评估吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA对细胞存活和凋亡的影响在体外和体内皮下和原位胰腺肿瘤模型。
目前的研究表明，同时dCK:：UMK过度表达和TS/RRM2基因沉默显著提高了吉西他滨的抗肿瘤活性。此外，凋亡似乎是潜在诱导肿瘤细胞死亡的主要机制。
材料和方法
细胞培养
来自ATCC的人类胰腺细胞系BxPc3和Panc1（法国LGC Promochem）、HA-hpc2（我们实验室从人类胰腺转移中开发）和人类胚胎肾AD293细胞系（法国斯特拉赫纳）在含5%CO的潮湿大气中保持在37°C2Panc1、HA-hpc2和AD293细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基-Glutamax培养基中生长，而BxPc3细胞在RPMI 1640-Glutamax培养基中培养。培养基中添加10%热灭活胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100µg/ml）。所有试剂均购自Invitrogen（法国Cergy Pontoise）。
载体构建与腺病毒生产
对于融合基因dCK:：UMK，将自切割FMDV 2A肽插入dCK和UMK之间（Cayla，Toulouse，France）。用特异性引物分别从pVIVOTKSh-dCK和pVIVOTKSh-DU质粒（Cayla）中通过聚合酶链反应（PCR）获得与人dCK和dCK:：UMK相对应的cDNA。PCR片段被转换成钝端，其5′端被T4多核苷酸激酶磷酸化（新英格兰生物实验室，Ozyme，Saint Quentin en Yvelines，法国）。然后将每个插入物结扎到生态使用T4连接酶的pShuttle CMV的RV位点（新英格兰生物实验室）。随后，两个重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α和根据Stratagene说明书获得相应的重组腺病毒。简单地说，得到的克隆用线性化个人电脑并在BJ5183-AD-1细菌中与pAdEasy-1重组。纯化的重组质粒通过派克靴限制性内切酶并随后转染到腺病毒中E1级基因产生AD293细胞产生腺病毒。重组病毒在AD293细胞中繁殖，用CsCl梯度超速离心纯化，并用标准方法滴答[28,29].
siRNA转染
根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将100 nM TS和/或RRM2 siRNA转染肿瘤细胞（70%的融合细胞）。
表达式分析
吉西他滨治疗48小时后进行基因表达分析。事实上，我们在初步实验中观察到，虽然需要72小时的治疗才能观察到细胞毒性效应的显著差异，但24至48小时的吉西他滨治疗诱导了显著的基因表达。
半定量逆转录-PCR分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，并用无RNase Dnase I处理。总RNA通过PCR进行反转录和扩增。用作PCR引物的寡核苷酸概述如下.聚合酶链反应hENT1、dCK、dCK:：UMK、TRAIL、和Survivin公司基因执行如下：94℃下3分钟，然后30个循环（94℃下40秒，55℃下40秒钟[dCK公司]，58摄氏度[hENT1，dCK:：UMK、和Survivin公司]或62°C[踪迹]，以及72°C下1分钟）和最后一个延伸步骤（72°C时7分钟）。胸苷酸合成酶扩增条件如下：94℃下4分钟，30个周期（94℃下30秒，58℃下1分钟，72℃下2分钟），72℃延长7分钟。对于Bax和Bcl2扩增，条件如下：94℃下3分钟，94℃下30次循环1分钟，Bax和Bcl2分别在58℃和60℃下1分钟，72℃下1 min和72℃下10分钟。关于右后基因，PCR显示：94℃下3分钟，94℃下30个循环1分钟，58℃下40秒，72℃下1分钟，72℃时7分钟。对于GAPDH公司PCR培养如下：94℃培养3分钟，94℃培养1分钟，60℃培养45秒，72℃培养45秒钟，重复34次，最后72℃培养5分钟。每次试验重复三次。
表1
| 基因 | 正向引物（5′-3′） | 反向底漆（5′-3′） |
| hENT1型 | gctgtctgaccgttgtat | ctgtacagggtgcatgatgg |
| DCK公司 | atggtaccccaccatggcccccg | atgtcgactcaaaagtactca公司 |
| 主控：：UMK | atggtaccccaccatggcccccg | atgcggccttagcctcttg |
| TS公司 | aaacgtgttctgagagggg公司 | ccatactctgtattctc |
| 右后 | atgaaacttggtcgagcgat | tggcaatttggaagccataga公司 |
| 踪迹 | ctgagcaaccagactcgctgtcac | tccaagcaccggacagcctgtgtccat |
| Bax公司 | tgcttcagggttcatccagg | tggcaaagtagaaagggcga公司 |
| Bcl2公司 | aatggcaacccatcctggca | ttctcctggatcaaggctc |
| Survivin公司 | atgggtgccccgacg | ctcaatccatggcagcc |
| GAPDH公司 | accacagtccatcatcatcac公司 | tccacccctgttgctgta |
蛋白质印迹分析
收集细胞，用冰镇PBS洗涤，并用RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich，法国）溶解。总蛋白浓度使用比钦酸检测试剂盒（Sigma）进行测量。在NuPAGE Novex 4%至12%双三凝胶（Invitrogen）上分离等量的蛋白质，并使用BioRad半干转移系统转移到Hybond-P聚（偏二氟乙烯）膜（法国莱斯乌利斯Amersham Biosciences）上。然后用兔多克隆抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（1:2000）、小鼠单克隆抗多聚（ADP-核糖）聚合酶（1:250）或小鼠单克隆抗体β-肌动蛋白（1:2000；所有抗体均来自法国特布比奥的圣克鲁斯。在与辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育后，使用增强化学发光增强化学发光试剂开发免疫印迹。
细胞增殖与细胞毒性
[三H] 胸腺嘧啶掺入
将细胞接种在96-well板上，让其粘附过夜。然后，用Ad-dCK或Ad-dCK:：UMK感染细胞（感染多重性，100）和/或转染TS/RRM2 siRNA（100 nM）。24小时后，用不同浓度的吉西他滨（法国礼来）进一步处理细胞72小时。为了测定DNA合成水平，1µl[三H] 在治疗结束前24小时，将胸苷（1µCi/ml；Amersham Biotechnologies，France）加入每个孔中。第二天，用PBS清洗细胞，将其固定在冰镇的10%三氯乙酸中，并在0.34N NaOH中溶解。使用带β计数器的液体闪烁光谱法对DNA中的放射性进行了三次测量（法国康特隆）。
MTT法
使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-3,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）试验评估细胞活力。在如上所述的处理期后，取出培养基，用100µl含有MTT（0.2 mg/ml）的新鲜培养基交换，并将细胞在37°C下培养3小时。去除培养基，并用150µl二甲基亚砜溶解formazan晶体。使用微孔板阅读器（法国BioRad）测量570 nm处的吸光度，一式三份。
细胞凋亡检测
赫斯特染色
细胞以2 x 10的密度接种在四孔板中5每个孔的细胞数。处理后，用PBS清洗细胞，并在4°C下用4%多聚甲醛固定1小时。然后在室温下用Hoechst试剂（1µg/ml；Sigma）在暗室中对细胞染色1小时，并分别使用348 nm和480 nm的激发和发射滤光片进行检查。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性
通过离心收集处理后的细胞，并用PBS洗涤两次。使用Caspase-3比色分析试剂盒（法国研发系统公司）检测Caspase-3活性。在裂解缓冲液中回收细胞颗粒，并在405nm波长下通过比色反应测定蛋白酶活性。实验一式三份，重复三次。
核因子-κB转录分析
DNA结合分析
使用EpiQuick提取试剂盒（法国斯特拉斯堡Euromedex）对处理过的细胞进行核提取。随后，他们被提交至NoShift核因子-κB（NF-κB）转录分析，这是一种基于比色分析的电泳迁移率变化分析的替代方法，根据方案说明（法国诺瓦根，VWR）。为了量化活性，使用微孔板阅读器在450 nm处测量光密度（法国BioRad）。
NF-κB启动子活性
转录调控核因子-κB该基因是使用NF-κB启动子/荧光素酶构建物（由日本东京东吴大学医学院Shinichi Kawai教授善意提供）测定的。在24孔板中放置过夜后，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）瞬时转染细胞NF-κB-luc质粒（1µg）。第二天，肿瘤细胞接受不同的治疗。此后，通过轻轻刮取细胞，在PBS中清洗一次，然后再悬浮在适当的溶解缓冲液中进行后续分析。使用光度计（LUMISTAR BM6）根据制造商的方案（法国夏波尼埃省普罗米加）进行荧光素酶分析。
胰腺肿瘤模型
动物
从Elevage Janvier（法国le Genest）购买6周龄雌性裸鼠，在实验期间饲养在适当的动物护理设施中，并按照动物实验所需的机构指南进行处理。
皮下胰腺肿瘤异种移植模型
在小鼠肩胛间区皮下接种BxPc3（1 x 107)或Panc1（2 x 107)肿瘤细胞。当肿瘤可触及时（100 mm三)，只小鼠被随机分为7组(n个= 8). 小鼠接受肿瘤内注射1 x 109在第10天和第17天，Ad-dCK（G3）或Ad-dCK:：UMK（G4和G6）的斑块形成单位（PFU）。此外，在第12天和第19天将TS和RRM2 siRNA（每100µg；G5、G6和G7）注入肿瘤内。G2至G6组在1周内腹膜内注射吉西他滨（15mg/kg）三次。对每组两只小鼠的肿瘤活检进行逆转录PCR（RT-PCR）实验。肿瘤用卡尺进行三维测量，每周两次，持续约1个月。使用以下公式计算肿瘤体积：v=π/6 x长x高x宽。
原位胰腺肿瘤异种移植模型
肿瘤细胞植入是在手术无菌条件下进行的。用碘溶液清洁腹部，并在中线上开一个1厘米的切口，露出胰腺。Panc1电池（2 x 107使用30号针头和1 ml一次性注射器将100µl PBS）注射到胰腺尾部。腹部伤口用6-0尼龙外科缝线分两层缝合。允许肿瘤生长，然后将小鼠随机分为五个（G1–G5）治疗组(n个= 14). 小鼠接受瘤周注射1 x 109在第10天和第17天，Ad-dCK:：UMK（G3和G5）的PFU。此外，在第12天和第19天，他们瘤周注射TS和RRM2 siRNA（每100微克；G4和G5）。G2至G6组在1周内注射吉西他滨（15 mg/kg）IP三次。在第30天，每组6只小鼠被杀死，并解剖胰腺肿瘤。如上所述测量体积，然后将肿瘤固定在Boin’s溶液中，用于随后的组织学诊断和免疫组织化学分析。每天观察其余动物的存活情况。
肿瘤形态学、Ki-67免疫组化染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记
将肿瘤异种移植物的样本解剖，固定在Boin溶液中，然后将石蜡包埋。取5µm切片，进行苏木精/伊红染色进行形态学检查，Ki-67染色进行增殖研究（法国巴黎Abcam），或DeadEnd荧光TUNEL系统（Promega）进行就地细胞凋亡研究。
统计分析
结果代表平均值±SEM。通过方差分析和/或Student-Newman-Keuls检验检查组间差异的统计显著性。P（P）<0.05表示存在统计显著差异。
结果
胰腺肿瘤细胞对吉西他滨的化疗敏感性不同
首先，我们用MTT法测定了人类胰腺细胞对吉西他滨的敏感性。将细胞置于0.01至100µM的吉西他滨浓度范围内72小时。HA-hpc2细胞对吉西他滨的敏感性最高，抑制浓度为最大值的一半（IC50)等于0.01µM。BxPc3和Panc1细胞表现为中间产物（IC50=2µM）和低（IC50=40µM）灵敏度(). 因此，我们将HA-hpc2和BxPc3定义为敏感肿瘤细胞；和Panc1，作为耐药肿瘤细胞。为了研究TS/RRM2 siRNA和Ad-dCK:：UMK组合策略对吉西他滨抗肿瘤作用的改善，本研究的其余部分是在Panc1耐药细胞上进行的。BxPc3是吉西他滨敏感的肿瘤细胞，对联合策略高度敏感，被用作阳性对照。
胰腺肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性。（A） 吉西他滨的细胞毒性。用增加浓度的吉西他滨（0.01–100）处理Panc1、BxPc3和HA-hpc2细胞72小时µM） 。使用MTT试验测量细胞活力，并以未处理细胞对照值的百分比表示。每条曲线代表了一式三份的四个实验。（B） 的表达式hENT1（输入1）核苷转运蛋白。细胞未经处理或用吉西他滨处理48小时，提取RNA并用特异性引物进行RT-PCR分析hENT1（输入1）和GAPDH公司家政基因。（C） 的角色hENT1（输入1）吉西他滨转运。同时用吉西他滨和hENT1抑制剂NBTI（10和100 nM）处理BxPc3和Panc1细胞。三天后，通过MTT分析评估细胞存活率。（D） 的表达式dCK，右后、和TS公司.肿瘤细胞未经治疗或在IC接受吉西他滨治疗5048小时后用半定量RT-PCR和特异性引物评估浓度和mRNA水平。
吉西他滨敏感性的变化与其代谢基因表达有关
一些研究表明，肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性可能与吉西他宾转运缺陷有关[30]尤其是赤字hENT1（输入1）主要核苷转运蛋白。为了验证此选项，我们确定了hENT1（输入1）吉西他滨处理和未处理的BxPc3和Panc1细胞中的表达及其相应活性。我们的数据表明hENT1（输入1）在Panc1耐药细胞中，信使RNA（mRNA）水平出乎意料地稍显显著()经过48小时的吉西他滨治疗后，两种细胞系的细胞数均增加。之后，为了验证hENT1型参与吉西他滨的细胞毒性，hENT1（输入1）-使用硝基苄硫肌苷（NBTI）抑制相关的转运活性。在吉西他滨浓度增加的情况下，用NBTI（10和100 nM）培养肿瘤细胞72小时。如中所示，BxPc3吉西他滨相关细胞死亡受到剂量依赖性抑制。相反，NBTI处理不影响Panc1细胞的存活率。同时，我们研究了不同吉西他滨相关代谢基因的表达。尽管dCK的基础表达在HA-hpc2和BxPc3细胞中更重要，但在Panc1细胞中TS和RR的表达更高(). 经过48小时的吉西他滨治疗后，BxPc3和HA-hpc2中的基因表达谱保持不变，相反，Panc1中的表达谱更为显著dCK公司mRNA和右后和TS公司mRNA。因此，Panc1肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性似乎至少部分归因于药物代谢的改变。
Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA增加吉西他滨细胞毒性体外试验
考虑到dCK表达的减少、TS的急剧增加以及在较低程度上Panc1细胞中RR表达的增加，这是一种过度表达dCK:：UMK和siRNA的腺病毒TS公司和右后基因被用来支持吉西他滨磷酸化。与未感染的对照细胞相比，Ad-dCK:：UMK感染BxPc3和Panc1细胞48小时会导致dCK和dCK:：MUK过度表达。同样，在用适当的siRNA处理48小时的细胞中，在未转染的对照细胞中观察到RR和TS的内源性表达下调(). 生长抑制研究使用[三H] 胸腺嘧啶掺入试验表明，在预感染Ad-dCK:：UMK的BxPc3和Panc1细胞中，吉西他滨对DNA合成的抑制作用增强(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）或用TS和RRM2 siRNA组合预处理(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞），尤其是Panc1细胞。这种更显著的细胞增殖抑制导致吉西他滨具有更好的细胞毒性。事实上，dCK:：UMK融合基因的过度表达导致吉西他滨IC减少约5倍和7倍50在BxPc3中(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）和Panc1(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）。同样，抑制TS/RR表达可降低吉西他滨IC50在BxPc3中分别从2和40µM到0.5和5µM(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）和Panc1细胞(P（P）< .001与吉西他滨处理细胞；). IC50的数据[三H] 胸腺嘧啶掺入试验似乎略低于MTT试验中所述的试验。观察到的差异可以用DNA合成停滞的时间进程和细胞死亡机制的实施之间的延迟来解释。
吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA可提高吉西他宾的细胞毒性凋亡效应。（A） 重组腺病毒转导和siRNA转染的疗效。BxPc3和Panc1细胞用表达dCK或dCK:：UMK的腺病毒感染，或用TS和/或RRM2 siRNA转染。在48小时处理后，使用特异性引物对总RNA进行RT-PCR分析。将dCK、dCK:：UMK、RR和TS的表达与未经处理的对照细胞进行比较。非特异性干扰（Sc）siRNA被用作siRNA的阴性对照。（B）Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA对吉西他滨细胞毒性的影响。如上所述处理细胞，并进一步接受浓度增加的吉西他滨72小时。在[三H] 胸腺嘧啶掺入和MTT分析、吉西他滨联合治疗的结果与Ad-dCK:：UMK、TS和/或RR siRNA治疗相关。在单独用吉西他滨处理的细胞中获得的平均百分比值相对于未处理的细胞的平均百分比值。数值表示一式三份进行的四个实验的平均值。星号表示显著差异(*P（P）< .05, **P（P）<.01，以及***P（P）<.001），与单独使用吉西他滨相比，在各种联合治疗后观察到。
Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA治疗有利于吉西他滨诱导的细胞凋亡，并且主要与TRAIL表达增加相关
吉西他滨失败可能是由于凋亡途径的缺陷。因此，我们接下来研究了Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA是否会影响胰腺癌细胞对吉西他滨诱导的凋亡的反应性。Western blot分析显示，吉西他滨治疗后观察到轻微的85-kDa PARP裂解产物就其本身而言在用Ad-dCK:：UMK或TS/RR siRNA预处理的BxPc3和Panc1细胞中增加(). 感染Ad-dCK:：UMK或转染TS/RRM2 siRNA的Panc1细胞显示吉西他滨介导的caspase-3活化增加，348 AU(P（P）< .001与吉西他滨处理细胞）和375 AU(P（P）< .001与吉西他滨处理细胞）(). 此外，这些caspase-3活性的增加比在BxPc3敏感模型中观察到的更为重要，在该模型中，吉西他滨相关的caspase-2活性从小于150 AU增加到275 AU(P（P）< .01与吉西他滨处理的细胞）在Ad-dCK:：UMK过度表达和298 AU的情况下(P（P）< .01与吉西他滨处理的细胞）TS/RRM2型基因沉默。Western blot分析证实了这些结果，caspase-3裂解形式的强度较高(). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性受凋亡蛋白抑制剂的调节，而凋亡蛋白抑制剂决定了它们的降解。在这些抑制剂中，Survivin公司与未经处理的对照细胞相比，接受吉西他滨治疗的肿瘤细胞增加。用Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA预处理均能显著抑制吉西他滨相关上调Survivin公司().
吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA可提高吉西他宾的细胞毒性凋亡效应。（A） 增强PARP和caspase-3的激活。为了评估PARP和caspase-3的激活，对从经Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA处理并经吉西他滨（IC50剂量）。上部面板代表PARP的116-kDa原生形式和85-kDa-激活形式。下部面板显示了caspase-3的天然形式和裂解形式（17和20 kDa）。（B） 半胱天冬酶-3活性的定量测量。Caspase-3的活化也通过比色测定进行了评估。数据是三个独立实验的代表。星号表示显著差异(**P（P）<.01和***P（P）<.001），与单用吉西他滨比较，在各种治疗后观察。（C） 不同凋亡基因的表达研究。处理后的细胞接受吉西他滨治疗48小时，然后用于TRAIL、Bax、Survivin、和Bcl2公司使用RT-PCR分析测量mRNA水平。GAPDH公司被用作内部控制。
接下来，我们寻找外源性和内源性凋亡途径的主要介体的参与。因此，我们检测了在吉西他滨诱导的细胞凋亡中TRAIL和Bax的表达是否发生了改变。预感染Ad-dCK:：UMK或转染TS/RRM2 siRNA导致TRAIL表达增强，这在BxPc3和Panc1细胞中似乎是等效的。相反，在这些处理过的细胞中观察到Bax表达略微增加，Bcl2表达轻微减少().
TS/RRM2 siRNA与Ad-dCK:：UMK联合促进吉西他滨在肿瘤细胞培养中的疗效最大化提高
为了获得吉西他滨的最佳疗效，我们最终研究了同时使用Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA。正如预期的那样，MTT分析显示，在同时接受Ad-dCK：：UMK与TS/RRM2siRNA的肿瘤细胞中，吉西他宾IC50在BxPc3和Panc1细胞中分别进一步降至0.1和1µM(). 1µM的吉西他滨导致先前用Ad-dCK:：UMK加TS/RRM2 siRNA处理的Panc1细胞中54%的细胞死亡(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞），而单独使用时无效。Ad-dCK:：UMK治疗(P（P）< .05与吉西他滨处理细胞）或TS/RRM2 siRNA(P（P）< .01与吉西他滨处理的细胞）在较低程度上增加了吉西他宾的细胞毒性作用。在相同浓度下，吉西他滨在Ad-dCK:：UMK加TS/RRM2 siRNA处理的BxPc3中诱导78%的细胞死亡(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）。然而，吉西他滨对BxPc3细胞的这种增强的细胞毒性作用与Ad-dCK:：UMK几乎相当(P（P）< .001与吉西他滨处理细胞）或TS/RRM2 siRNA(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）。在细胞凋亡分析中，Hoechst染色显示细胞核收缩、染色质浓缩和断裂增加(). ELISA实验表明，在经过三种疗法处理的BxPc3敏感细胞和Panc1耐药细胞中，caspase-3的激活更显著(P（P）< .001与吉西他滨处理的细胞）比吉西他宾与Ad-dCK:：UMK联合产生的细胞更高(P（P）< .01与吉西他滨+Ad-dCK:：UMK处理细胞）或TS/RRM2 siRNA(P（P）< .001与吉西他滨+TS/RRM2 siRNA-处理细胞；). 17和20 kDa的两种半胱氨酸蛋白酶-3裂解亚型的较高水平证实了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性的增加。此外，我们观察到踪迹表达和对Survivin公司和Bcl2公司表达式。关于Bax公司促凋亡基因，联合治疗（Ad-dCK:：UMK+TS/RRM2 siRNA+吉西他滨；). 几位作者报道，吉西他滨耐药细胞表现出高的基础和诱导的NF-κB活性[31]. 因此，我们接下来想通过关联Ad-dCK:：UMK+TS/RRM2 siRNA来确定NF-κB在增强吉西他滨疗效中的作用。因此，使用NoShift NF-κ的B分析和荧光素酶报告基因分析来确定NFκB的作用。如所示，单独使用吉西他滨可增加NF-κB活性，特别是在Panc1细胞中(P（P）< .05与未处理的细胞）。有趣的是，Ad-dCK:：UMK与TS/RRM2 siRNA的结合显著降低了吉西他滨诱导的活性NF-κB(P（P）< .001与吉西他滨处理的Panc1细胞）。
吉西他滨与Ad-dCK:：UMK和TS/RR siRNA联合使用可最大限度地优化其疗效。增加吉西他滨浓度治疗72小时后，通过MTT法测定Ad-dCK:：UMK感染和/或TS/RR siRNA-转染细胞的细胞活力。吉西他滨处理的细胞中获得的MTT值的平均百分比与未处理的细胞相对。关于吉西他滨联合治疗，结果表示吉西他宾联合治疗与Ad-dCK:：UMK、TS/RR siRNA或Ad-dCK：：UMK加TS/RR siRNA治疗的相对值。数据是三个独立实验的结果。星号表示显著差异(*P（P）< .05, **P（P）<.01，以及***P（P）<.001），与单用吉西他滨比较，在各种治疗后观察。（B） Hoechst染色。按照材料和方法一节中的说明处理细胞。用荧光显微镜观察凋亡细胞。（C） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活。通过Western blot分析和比色活性测定，对接受Ad-dCK:：UMK+TS/RRM2 siRNA并在IC处用吉西他滨进一步处理48小时的细胞进行caspase-3活性研究50剂量。星号表示显著差异(**P（P）<.01和***P（P）<.001）与吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK和TS/RR siRNA治疗的细胞相比，吉西他宾联合Ad-dCK:：UMK或吉西他汀联合TS/RRM2 siRNA治疗细胞后观察到。（D）凋亡介质的表达。在同一个实验中，拖车，Bax，Bcl2、和Survivin公司利用各自的特异性引物，通过RT-PCR实验评估凋亡基因的表达。的表达式GAPDH公司显示为内部控制。
NF-κB在肿瘤细胞对吉西他滨单独或联合Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA敏感性中的作用。BxPc3和Panc1肿瘤细胞与Ad-dCK：UMK及TS/RR siRNA共处理。一天后，细胞进一步接受2和40µ48小时后分别研究吉西他滨的M和NF-κB的活化。（A） NoShift NF-κB比色分析。收集细胞，并根据制造商的建议评估NF-κB活性。（B） NF-κB荧光素酶基因报告子分析。在此，在NF-κB反应元件的控制下，用表达荧光素酶的质粒对细胞进行原代转染。然后根据制造商的方案进行荧光素酶分析。所有实验均一式三份，并至少重复三次。星号表示显著差异(**P（P）<.01和***P（P）<.001），与单独用吉西他滨处理的细胞相比*P（P）<0.05表明吉西他滨处理的Panc1细胞与未处理的Panc 1细胞之间存在显著差异。
在体内实验
已经证明，使用Ad-dCK:：UMK和TS/RR siRNA的联合方式可以提高吉西他滨的活性和有效性在体外特别是在耐药的Panc1肿瘤细胞中，我们接下来检测体内在免疫缺陷小鼠中使用BxPc3和Panc1肿瘤异种移植模型的疗效。
吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK加TS/RRM2 siRNA抑制皮下移植瘤生长
为了比较三种治疗策略对吉西他滨敏感和耐药肿瘤模型的疗效，建立了BxPc3和Panc1皮下肿瘤模型。在BxPc3和Panc1荷瘤小鼠（约100 mm三（如“材料和方法”部分所示）。首先，为了确定重组腺病毒转导和siRNA转移的效果，我们进行了RT-PCR实验，并分析了第21天恢复的肿瘤活检中目标基因的表达。如所示,主控：：UMK融合基因在Ad-dCK:：UMK单独或与TS/RRM2 siRNA联合治疗的小鼠肿瘤组织中高表达TS公司和右后TS/RRM2 siRNA和TS/RRM2siRNA加Ad-dCK:：UMK处理小鼠的活检中基因被抑制。第二，关于治疗效果，正如预期的那样，BxPc3肿瘤模型对吉西他滨有效(P（P）< .01与未经治疗的BxPc3荷瘤小鼠），这不是耐化疗的Panc1肿瘤模型（NS；). 实验结束时，Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA与吉西他滨的联合作用使肿瘤体积减少了66%和78%(P（P）分别在BxPc3和Panc1肿瘤模型中与单独使用吉西他滨治疗的小鼠进行比较。此外，与双重治疗方案相比，三联疗法产生了57%(P（P）<.05）和48%(P（P）与分别用吉西他滨加Ad-dCK:：UMK和吉西他宾加TS/RRM2 siRNA治疗的小鼠相比，Panc1肿瘤体积减少<.05）。重要的是，在同一时间内，这些抑制高于在BxPc3敏感肿瘤模型中观察到的抑制，其中39%（NS与吉西他滨+Ad-dCK:：UMK治疗小鼠）和31%（NS与观察吉西他滨+TS/RRM2 siRNA-处理小鼠的抑瘤作用。
dCK:：UMK的过度表达和TS/RR的下调提高了吉西他滨在皮下胰腺肿瘤模型中的治疗效果。裸鼠皮下接种BxPc3或Panc1细胞，当肿瘤大小达到100 mm时三，他们接受瘤内注射Ad-dCK:：UMK（1 x 109PFU）±TS/RR siRNA（100µg） ●●●●。经腹腔注射吉西他滨（15 mg/kg体重）。对照组给予0.9%氯化钠治疗。（A） Ad-dCK:：UMK和TS/RR siRNA功能。每组从两只小鼠中回收肿瘤，并进行RT-PCR实验，以证明分别在siRNA和Ad-dCK:：UMK治疗后内源性TS和RR表达降低以及dCK和dCK:：UMK过度表达。GAPDH公司被用作内部控制。（B） 肿瘤生长。通过每周两次肿瘤体积测量来跟踪BxPc3和Panc1肿瘤的生长演变。NS公司表示不重要**P（P）<.01和***P（P）< .001与控件。
基于吉西他滨的联合治疗延缓肿瘤生长并延长原位胰腺癌异种移植小鼠的生存期
考虑到适当的肿瘤微环境体内这项研究扩展到了一个预测性更强的原位胰腺癌Panc1模型。通过剖腹探查确定肿瘤的范围(n个=6）肿瘤形成后30天。总结了肿瘤生长的演变，结果表明，仅用吉西他滨治疗的小鼠平均肿瘤体积为839mm三 与1260毫米三对照组小鼠（肿瘤生长减少33%，NS与未经处理的对照小鼠）。吉西他滨联合TS/RRM2 siRNA治疗使肿瘤体积降至398mm三相当于肿瘤体积平均减少68%(P（P）< .01与吉西他滨治疗小鼠）。吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK治疗导致肿瘤体积平均减少65%（446mm）三,P（P）< .01与吉西他滨治疗小鼠）。不出所料，接受吉西他滨联合TS/RRM2 siRNA和AddCK:：UMK治疗的小鼠表现出最大的肿瘤生长抑制作用，平均肿瘤体积为151.02 mm三导致肿瘤生长平均下降82%(P（P）< .001与吉西他滨）。此外，联合治疗显著延长了小鼠的生存期。接受吉西他滨和Ad-dCK:：UMK联合治疗的半数小鼠存活，外观健康。此外，TS/RRM2 siRNA与吉西他滨联合治疗使小鼠的生存期延长了62%(P（P）< .01与吉西他滨治疗小鼠）。吉西他滨联合Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA治疗的小鼠生存期延长最为重要，8只小鼠中有7只在3个月实验结束时仍存活(P（P）< .001与吉西他滨治疗小鼠；). 肿瘤组织受到就地细胞凋亡检测(). 与单独使用吉西他滨治疗的小鼠相比，在使用Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA联合吉西他宾治疗的动物身上获得的肿瘤活检中，末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）阳性细胞最为显著。蛋白质印迹分析的蛋白酶活性表明，在接受联合治疗的小鼠肿瘤中，暴露于吉西他滨后caspase-3的激活显著增加（数据未显示）。健康胰腺活检中未发现凋亡，其中未观察到caspase-3裂解（数据未显示）。此外，我们评估了肿瘤的增殖活性。如所示与吉西他滨治疗的动物肿瘤相比，使用“三疗法”方案治疗的小鼠肿瘤活检中Ki-67阳性肿瘤细胞数量减少。
吉西他滨联合治疗后抑制原位肿瘤形成并提高荷瘤小鼠的存活率。开始治疗30天后，每组6只小鼠(n个=14）死亡；他们的胰腺肿瘤得以恢复。（A） 肿瘤生长。对恢复的活组织检查进行三维测量。星号表示显著差异(**P（P）<.01和***P（P）<.001）在吉西他滨联合治疗后与单用吉西他宾进行比较。（B） 胰腺的宏观表现。照片显示了未经治疗的小鼠和接受三种疗法的小鼠切除的胰腺肿瘤。（C） 代表性免疫组织化学检查。随后将活检标本进行苏木精-伊红染色（左面板）、TUNEL染色（中面板）和Ki-67染色（右面板）。（D） Kaplan-Meier生存曲线。对其余小鼠进行存活曲线测定。结果采用log-rank检验进行统计分析。星号表示显著差异(*P（P）< .5, **P（P）<.01，以及***P（P）<.001）在吉西他滨联合治疗后与单用吉西他宾进行比较。
讨论
本研究的重点是研究吉西他滨代谢的分子调控，提高其抗肿瘤细胞毒作用。因此，为了对胰腺癌的治疗提供新的见解，我们实施了一种结合GDEPT系统和基于siRNA的方法学的策略。我们的研究方法是基于以下假设：吉西他滨耐药可能依赖于dCK公司和/或过度表达右后和TS公司最近的研究表明，这些基因的表达比例可能与胰腺癌细胞对吉西他滨获得性和固有的化疗耐药性有关[32].
在当前的研究中，不同胰腺癌细胞系对吉西他滨的敏感性证实了其他地方报道的其他数据，并将Panc1和BxPc3细胞分别描述为耐药细胞和敏感细胞[33,34]. 然而，IC的变化50由于不同实验室的实验条件不同，我们观察到了。在许多研究中，核苷类似物的化学耐药机制是与药物转运有关的低水平蛋白质或负责其代谢的细胞内酶（例如激酶、脱氨酶和核苷酸酶）的失调[15,21,26]. 因此，从逻辑上讲，我们接下来试图分析吉西他滨转运体，尤其是hENT1（输入1）转运蛋白缺乏与吉西他滨转运缺乏和耐药性相关[30]. 我们的研究结果表明hENT1（输入1）-NBTI介导的转运适度地改变了吉西他滨对BxPc3的活性，并且不会改变吉西他宾对耐药Panc1细胞的细胞毒性。此外，RT-PCR实验表明hENT1（输入1）吉西他滨治疗后在BxPc3和Panc1细胞中的表达。因此，BxPc3和Panc1对吉西他滨的敏感性似乎不涉及hENT1（输入1）运输工具。
接下来，我们讨论了涉及吉西他滨代谢的细胞酶表达的调节及其与化疗耐药机制的相关性。众所周知，dCK对吉西他滨的磷酸化是吉西他宾前药激活的速率控制步骤，因为dCK缺乏与获得性耐药密切相关[16–18]. 一些数据表明，dCK活性与人类肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性之间存在明显的相关性。在本研究中，与BxPc3-或HA-hpc2-敏感细胞相比，Panc1-耐药细胞中的基础dCK表达显著降低，并且在接触吉西他滨后进一步下调。为了克服这种情况，人们普遍实现了dCK在耐药肿瘤细胞中的再表达。然而，仅转移dCK并不能完全恢复吉西他滨的敏感性[19,20]. 因此，我们认为设计一种表达主控：：UMK融合基因可能对吉西他滨的胰腺肿瘤化疗增敏更有效。正如预期的那样，我们证明dCK:：UMK的表达导致细胞对吉西他滨的敏感性比单独表达dCK更显著地增加。这些数据通过显著抑制DNA合成和细胞毒性作用来说明。我们证明，设计的Ad-dCK:：UMK使吉西他滨IC降低了6倍和8倍50分别在BxPc3和Panc1细胞中。此外，关于吉西他滨代谢和肿瘤敏感性，转录组分析也表明RR和TS在化疗耐药机制中的预测价值。事实上，有越来越多的数据表明临床反应与dCK、TS、和右后治疗患者的基因表达水平[27,32,35]. 在目前的研究中，我们发现吉西他滨治疗诱导了右后和TS公司在Panc1耐药肿瘤细胞中表达，同时在BxPc3和HA-hpc2中无明显改变。因此，TS和RR表达的增加可能是Panc1肿瘤细胞对吉西他滨治疗反应低的部分原因。TS表达增加并不奇怪，因为实验和临床研究观察到接触TS抑制剂后诱导TS表达，这一过程导致细胞对这些药物产生耐药性[36]. 根据这些发现和其他地方的报道，我们尝试使用TS/RRM2 siRNA阻断TS和RR的表达TS/RRM2型基因沉默与吉西他滨诱导的细胞毒性作用增加有关。似乎TS/RRM2 siRNA在降低吉西他滨IC方面与Ad-dCK:：UMK一样有效50如统计分析所示，实现了与吉西他滨治疗的比较。这些发现明确证实了TS和RR在吉西他滨化疗疗效中的关键作用。此外，据报道，抑制TS和RRM2表达可能会刺激dCK活性，这可能与抑制DNA合成和DNA损伤的反馈激活相一致[37].
因此，最终为了加强其代谢并尽可能优化其抗肿瘤活性，吉西他滨与Ad-dCK:：UMK和特异性TS/RRM2 siRNA结合使用。这两种基于基因治疗的治疗策略的结合导致吉西他宾IC降低40倍50在Panc1细胞中（1与在Panc1未处理的细胞中为40µM），与吉西他滨与Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA处理组合后分别降低7倍和8倍相比。尽管Panc1细胞仍然比BxPc3细胞（吉西他滨IC50在Panc1电池中等于1µM与BxPc3细胞中0.1µM），吉西他滨IC的减少50三种疗法产生的细胞数优于BxPc3敏感细胞（IC减少20倍50).
一些研究已经提供了化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的证据。最近的研究表明，凋亡减少在肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性中起着重要作用[38,39]. 很少有研究描述了对吉西他滨相关凋亡的理解，并且对吉西他滨细胞毒性作用中涉及的凋亡介质知之甚少。因此，在当前的研究中，为了验证吉西他滨对肿瘤的化疗敏感性与诱导凋亡之间的任何相关性，我们寻找了外源性和内源性凋亡途径的一些主要介质的参与。我们的数据表明，与单用吉西他滨相比，联合使用吉西他宾和其他两种策略诱导PARP裂解和caspase-3活化显著增加。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性的增强可能是由于凋亡蛋白表达的Survivin抑制剂减少所致，该蛋白在抗Panc1肿瘤细胞中几乎完全被抑制。同样，联合治疗与抗凋亡介质Bcl2表达降低和Bax表达增加相关。关于死亡受体途径，Fas/FasL死亡受体途径在吉西他滨诱导的细胞凋亡中的作用一直存在争议[40,41]. 为了进一步了解三种疗法促进细胞凋亡的机制，我们研究了踪迹配体途径。已经证明踪迹基因治疗和化疗已被证明对各种癌症有效[42,43]. 我们的发现表明，使用Ad-dCK:：UMK、TS/RRM2 siRNA或两者对吉西他滨的肿瘤细胞敏化导致TRAIL表达的显著增强。这些数据表明，提高肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性涉及TRAIL对凋亡诱导的作用。最后，另一种可能参与吉西他滨化疗耐药的凋亡途径是NF-κB途径。事实上，以前的报告已经证明，大约70%的人胰腺癌和一些胰腺癌细胞系中存在构成性NF-κB活性[31,44–46]. 在此，我们证实了NF-κB活性参与了肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性。此外，三联疗法的疗效是通过降低吉西他滨相关NF-κB转录活性的诱导而实现的。凋亡信号分子在胰腺癌化疗增敏和治疗效果中的作用有待进一步研究。
验证的结果在体外实验中，在裸鼠体内建立皮下和原位异种胰腺癌模型。在皮下肿瘤模型中广告：：UMK过度表达和TS/RRM2型基因沉默提高了BxPc3和Panc1肿瘤对吉西他滨的敏感性，其方式高于单独使用Ad-dCK:：UMK或TS/RRM2 siRNA。这种联合治疗使耐药Panc1肿瘤模型以及BxPc3敏感模型对吉西他滨敏感，表明我们的三种治疗方法适用于耐药和敏感肿瘤模型。此外，仅用TS/RRM2 siRNA治疗的小鼠显示出无显著疗效，因此表明在TS/RRM2siRNA加吉西他滨治疗的小鼠中观察到的抗肿瘤作用实际上与吉西他宾有关。这个体内使用Panc1原位胰腺肿瘤模型进行的肿瘤治疗研究表明，通过同时使用Ad-dCK:：UMK和TS/RRM2 siRNA治疗吉西他滨，肿瘤致敏可显著降低肿瘤生长。所有动物均具有统计学意义的肿瘤体积抑制，三分之一的动物表现出完全的肿瘤消退。接受这种联合治疗方案的小鼠的存活率得到了提高。同时给予吉西他滨和Ad-dCK:：UMK加TS/RRM2 siRNA的小鼠的肿瘤活检结果显示，肿瘤TUNEL分析显示凋亡细胞增加，增殖细胞数量减少。由于活性和/或非活性吉西他滨通过转运蛋白的细胞间转移，肿瘤生长的显著减少可能涉及旁观者效应。它还可能涉及凋亡信号的传递，尤其是TRAIL配体，它将附着在邻近细胞上的相应受体上。事实上，尽管还不完全清楚哪些信号参与了这些重要的过程，但有人认为，在垂死的细胞中特异性产生的代谢产物，如尿酸[47]或者在凋亡过程中被激活的凋亡代谢物可能被转移为旁观者死亡[48]. 结果更加有趣；因为吉西他滨在相对低剂量给药方案（15 mg/kg，1周内三次）后进行IP给药，而文献中报道的常规高剂量给药（45–380 mg/kg）[49]. 然而，对治疗方案的肝毒性进行了评估。结果显示，与吉西他滨治疗组相比，联合组的天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和胆红素水平只有轻微的非显著性变化（数据未显示）。
综上所述，我们的发现首次表明，将吉西他滨与TS/RR siRNA和dCK:：UMK相结合的基因治疗可能确实提供了一个治疗吉西他宾敏感和耐药胰腺肿瘤的机会，这些肿瘤对传统吉西他比治疗相对难治。
致谢
作者感谢Tiraby Gerard提供pVIVOTKSh-DU。作者还感谢Pasupathy Shanker对手稿的批判性评论。
脚注
1这项工作得到了“癌症康复协会”和“弗朗西斯俱乐部”的支持
工具书类
1Yeo TP、Hruban RH、Leach SD、Wilentz RE、Sohn TA、Kern SE、Iacobuzio-Donahue CA、Maitra A、Goggins M、Canto MI等。胰腺癌。当前潜在癌症。2002年；26:176–275.[公共医学][谷歌学者] 2Kollmannsberger C，Peters HD，Fink U。晚期胰腺癌的化疗。癌症治疗Rev。1998;24:133–156.[公共医学][谷歌学者] 三。Burris HA、Moore MJ、Andersen J、Green MR、Rothenberg ML、Modiano MR、Cripps MC、Portenoy RK、Storniolo AM、Tarassoff P等。吉西他滨作为晚期胰腺癌一线治疗药物对生存率和临床效益的改善：一项随机试验。临床肿瘤学杂志。1997;15:2403–2413.[公共医学][谷歌学者] 4Burris H，Storniolo AM。评估胰腺癌治疗的临床益处：吉西他滨与5-氟尿嘧啶的比较。《欧洲癌症杂志》。1997;33（补充）：18–22。[公共医学][谷歌学者] 5Rothenberg ML、Moore MJ、Cripps MC、Andersen JS、Portenoy RK、Burris HA、III、Green MR、Tarassoff PG、Brown TD、Casper ES等。吉西他滨治疗5-FU难治性胰腺癌患者的II期试验。安·昂科尔。1996;7:347–353.[公共医学][谷歌学者] 6Abratt RP、Bezwoda WR、Falkson G、Goedhals L、Hacking D、Rugg TA。吉西他滨治疗非小细胞肺癌的疗效和安全性。第二阶段研究。临床肿瘤学杂志。1994;12:1535–1540.[公共医学][谷歌学者] 7Lund B，Hansen OP，Theilade K，Hanssen M，Neijit JP。吉西他滨（2′，2′-二氟脱氧胞苷）治疗卵巢癌患者的II期研究。美国国家癌症研究所杂志。1994;86:1530–1533.[公共医学][谷歌学者] 8海涅曼V.吉西他滨：胰腺癌治疗进展。肿瘤学。2001;60:8–18.[公共医学][谷歌学者] 9Heinemann V，Schulz L，Issels RD，Plunkett W.健择：细胞内核苷酸和脱氧核苷酸代谢的调节剂。塞明·昂科尔。1995;22:11–18.[公共医学][谷歌学者] 10Bouffard DY，Lalibert J，Mompaller RL。2′，2′-二氟脱氧胞苷（吉西他滨）与纯化的人脱氧胞苷激酶和胞苷脱氨酶的动力学研究。生物化学药理学。1993年；45:1857–1861.[公共医学][谷歌学者] 11Plunkett W，Huang P，Xu YZ，Heinemann V，Grunewald R，Gandhi V。吉西他滨：代谢，作用机制和自我增强。Semin肿瘤。1995;22（补充）：3–10。[公共医学][谷歌学者] 12Heinemann V，Hertel LW，Grindey GB，Plunkett W.2,2-二氟脱氧胞苷和1-β的细胞药代动力学和毒性比较-d日-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶。癌症研究。1988;48:4024–4031.[公共医学][谷歌学者] 13Huang P，Chubb S，Hertel LW，Grindey GB，Plunkett W.2′，2′-二氟脱氧胞苷对DNA合成的作用。癌症研究。1991;51:6110–6117.[公共医学][谷歌学者] 14Ruiz van Haperen大众、Veerman G、Vermorken JB、Peters GJ。2′，2′-二氟脱氧胞苷（吉西他滨）掺入肿瘤细胞株的RNA和DNA中。生物化学药理学。1993年；46:762–766.[公共医学][谷歌学者] 15Bergman AM、Pinedo HM、Peters GJ。2′，2′-二氟胞苷（吉西他滨）耐药性的决定因素抗药性更新。2002年；5:19–33.[公共医学][谷歌学者] 16Beausejour CM，Gagnon J，Primeau M，Monmarler RL.用脱氧胞苷激酶基因转导的细胞中2′，2′-二氟脱氧胞嘧啶，5-氮杂-2′-脱氧胞甙和阿糖胞苷的细胞毒性活性。生物化学与生物物理研究委员会。2002年；293:1478–1484.[公共医学][谷歌学者] 17Galmarini CM、Clarke ML、Jordheim L、Santos CL、Cros E、Mackey JR、Dumontet C。人类滤泡性淋巴瘤细胞系对吉西他滨的耐药性是由于脱氧胞苷激酶基因的部分缺失所致。BMC药理学。2004;4:8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Bergman AM、Giaccone G、van Moorsel CJ、Mauritz R、Noordhuis P、Pinedo HM、Peters GJ。2′，2′-二氟脱氧胞苷（吉西他滨）耐药人卵巢癌细胞株AG6000对标准药物和试验药物的交叉耐药性。《欧洲癌症杂志》。2000;36:1974–1983.[公共医学][谷歌学者] 19Manome Y、Wen PY、Dong Y、Tanaka T、Mitchell BS、Kufe DW、Fine HA。人脱氧胞苷激酶cDNA的病毒载体转导使胶质瘤细胞对阿糖胞苷的细胞毒作用敏感在体外和体内。自然医学。1996;2:567–573.[公共医学][谷歌学者] 20Van der Wilt CL、Kroep JR、Bergman AM、Loves WJ、Alvarez E、Talianidis I、Eriksson S、Van Groenigen CJ、Pinedo HM、Peters GJ。脱氧胞苷激酶在吉西他滨细胞毒性中的作用。高级实验医学生物。2000;486:287–290.[公共医学][谷歌学者] 21Van Rompay AR，Johansson M，Karlsson A.哺乳动物核苷单磷酸激酶对核苷和核苷类似物的磷酸化作用。药物治疗学。2000;87:189–198.[公共医学][谷歌学者] 22Galmarini CM、Mackey JR、Dumonet C.核苷类似物：耐药性机制和逆转策略。白血病。2001;15:875–890.[公共医学][谷歌学者] 23Galmarini CM、Mackey JR、Dumonet C.核苷类似物和碱基在癌症治疗中的应用。柳叶刀Oncol。2002年；三:415–424.[公共医学][谷歌学者] 24Vernejoul F、Laurent Ghénassia L、Souque A、Lulka H、Drocourt D、Cordelier P、Pradayrol L、Pyronet S、Buscail L、Tiraby G。基于吉西他滨化疗增敏的基因治疗抑制胰腺癌生长。分子热学。2006年；14:758–767.[公共医学][谷歌学者] 25Goan YG，Zhou B，Hu E，Mi S，Yen Y。核糖核苷酸还原酶的过度表达是人类KB癌细胞系对2，2-二氟脱氧胞苷耐药的机制。癌症研究。1999;59:4204–4207.[公共医学][谷歌学者] 26Eriksson S、Martin DW.、。，培养的小鼠淋巴瘤细胞中的Jr核糖核苷酸还原酶。亚单位蛋白M2活性的细胞周期依赖性变化。生物化学杂志。1981;256：9436–9440。[公共医学][谷歌学者] 27Duxbury MS，Ito H，Zinner MJ，Ashley SW，Whang EE。针对核糖核苷酸还原酶M2亚单位的RNA干扰增强胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性。致癌物。2004;23:1539–1548.[公共医学][谷歌学者] 28Graham FL，Prevec L.腺病毒载体的操作。作者：Murray EJ，编辑。分子生物学方法。基因转移和表达协议。第7卷。新泽西州克利夫顿：Humana出版社。；1991年，第109-128页。[公共医学][谷歌学者] 29Peng HH，Wu S，Davis JJ，Wang L，Roth JA，Marini FC，III，Fang B.用RGD修饰纤维快速高效纯化重组腺病毒的方法。分析生物化学。2006年；354:140–147. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Mackey JR、Mani RS、Selner M、Mowles D、Young JD、Belt JA、Crawford CR、Cass CE。功能性核苷转运体是吉西他滨流入和癌症细胞系毒性表现所必需的。癌症研究。1998;58:4349–4357.[公共医学][谷歌学者] 31Arlt A，Vorndamm J，Breitenbroich M，Fölsch UR，Kalthoff H，Schmidt WE，Schäfer H。抑制NF-kappaB使人胰腺癌细胞对依托泊甙（VP16）或阿霉素诱导的凋亡敏感。致癌物。2001;20:859–868.[公共医学][谷歌学者] 32Nakano Y、Tanno S、Koizumi K、Nishikawa T、Nakamura K、Minoguchi M、Izawa T，Mizukami Y、Okumura T、Kohgo Y、Gemcitabine化疗耐药性以及与人类胰腺癌细胞中吉西他滨转运和代谢相关的分子标记物。英国癌症杂志。2007;96:457–463. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Duxbury MS，Ito H，Zinner MJ，Ashley SW，Whang EE。抑制SRC酪氨酸激酶会损害人类胰腺癌细胞的固有和获得性吉西他滨抵抗。临床癌症研究。2004;10:2205–2207.[公共医学][谷歌学者] 34Giroux V、Malicet C、Barthet M、Gironella M、Archange C、Dagorn JC、Vasseur S、Iovanna JL。p8是吉西他滨在胰腺癌细胞中的新靶点。临床癌症研究。2006年；12:235–241.[公共医学][谷歌学者] 35Bergman AM、Eijk PP、Ruiz van Haperen VW、Smid K、Veerman G、Hubeek I、van den Ijssel P、Ylstra B、Peters GJ。体内吉西他滨耐药诱导导致核糖核苷酸还原酶亚基M1的表达增加，M1是主要决定因素。癌症研究。2005;65:9510–9516.[公共医学][谷歌学者] 36Van der will CL、Pinedo HM、Smid K、Peters GJ。在小鼠结肠肿瘤中添加亚叶酸可防止5-氟尿嘧啶治疗后胸苷酸合成酶升高。癌症研究。1992;52:4922–4928.[公共医学][谷歌学者] 37Csapo Z、Sasvari-Szekely M、Spasokokotskaja T、Talianidis I、Eriksson S、Staub M。通过抑制人类淋巴细胞中的DNA合成激活脱氧胞苷激酶。生物化学药理学。2001;61:191–197.[公共医学][谷歌学者] 38Shrikhande SV、Kleeff J、Kayed H、Keleg S、Reiser C、Giese T、Büchler MW、Esposito I、Friess H。沉默X连锁凋亡抑制剂（XIAP）可降低胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。抗癌研究。2006年；26:3265–3273.[公共医学][谷歌学者] 39Denlinger CE，Rundall BK，Keller MD，Jones DR。蛋白酶体抑制使非小细胞肺癌对吉西他滨诱导的细胞凋亡敏感。Ann Thorac外科。2004;78:1207–1214.[公共医学][谷歌学者] 40Pace E、Melis M、Siena L、Bucchieri F、Vignola AM、Profita M、Gjomarkaj M、Bonsignore G。吉西他滨对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系细胞增殖和凋亡的影响。癌症化疗药理学。2000;46：467–476。[公共医学][谷歌学者] 41Ferreira CG、Tolis C、Span SW、Peters GJ、van Lopik T、Kummer AJ、Pinedo HM、Giaccone G.Drug诱导的肺癌细胞凋亡不受Fas/FasL（CD95/APO1）信号通路介导。临床癌症研究。2000;6:203–212.[公共医学][谷歌学者] 42Wack S、Rejiba S、Parmentier C、Aprahamian M、Hajri A.诱导物端粒酶转录靶向Bax/TRAIL公司基因治疗提高了吉西他滨治疗胰腺癌的疗效。分子热学。2008;16:252–260.[公共医学][谷歌学者] 43Lin T，Zhang L，Davis J，Gu J，Nishizaki M，Ji L，Roth JA，Xiong M，Fang B.组合踪迹基因治疗和化疗增强了化疗敏感性和化疗耐药乳腺癌的抗肿瘤和抗转移作用。分子热学。2003;8:441–448.[公共医学][谷歌学者] 44Arlt A，Schäfer H.NFkappaB在实体肿瘤中依赖化疗耐药。国际临床药物治疗杂志。2002年；40:336–347.[公共医学][谷歌学者] 45Wang W、Abbruzzese JL、Evans DB、Chiao PJ。尿激酶型纤溶酶原激活物在胰腺癌中的过度表达受组成性激活的RelA调节。致癌物。1999;18:4554–4563.[公共医学][谷歌学者] 46Dong QG、Sclabas GM、Fujioka S、Schmidt C、Peng B、Wu T、Tsao MS、Evans DB、Abbruzzese JL、McDonnell TJ等。多种IkappaB:NF-kappaB复合物在肿瘤细胞抵抗紫杉醇诱导的凋亡中的作用。致癌物。2002年；21:6510–6519.[公共医学][谷歌学者] 47Mattson MP、Goodman Y、Luo H、Fu W、Furukawa K。NF-kappaB的激活可保护海马神经元免受氧化应激诱导的凋亡：锰超氧化物歧化酶诱导、过氧亚硝酸盐生成和蛋白质酪氨酸硝化抑制的证据。神经科学研究杂志。1997;49:681–697.[公共医学][谷歌学者] 48Krysko DV、Leybaert L、Vandenabeele P、D’Herde K。缝隙连接与细胞存活和细胞死亡信号的传播。细胞凋亡。2005;10:459–469.[公共医学][谷歌学者] 49Pratesi G、Petrangolini G、Tortoreto M、Addis A、Belluco S、Rossini A、Selleri S、Rumio C、Menard S、Balsari A。吉西他滨和CpG-寡核苷酸在原位人胰腺癌异种移植中的治疗协同作用。癌症研究。2005;65:6388–6393.[公共医学][谷歌学者] 
