动物中反向重复基因的长短

摘要

介绍

动物中三类高度保守的小RNA与精氨酸（Ago）蛋白相关。¹小干扰RNA（siRNAs）是约21 nt，3'甲基化RNA，位于专门用于靶裂解的“切片”Ago蛋白中。这些物种介导经典定义的RNA干扰（RNAi），其中外源性长双链RNA被加工成siRNA，切割完全互补的转录物。^2,三microRNAs（miRNAs）是具有2'，3'羟基末端的内源性~22 nt RNA，来源于含有反向重复的内源性转录物。^4-8大多数miRNA存在于具有适度或无切割活性的Ago类蛋白质中；相反，它们通过翻译抑制和/或靶向二烯基化发挥其主要作用。⁹miRNAs通过与miRNA的2-8个核苷酸的7 nt“种子”配对来共同调节数千个内源性靶转录物。Piwi相互作用RNA（piRNAs）是约24-30 nt，3'甲基化RNA，位于苍蝇和脊椎动物的Piwi类精氨酸中，其测试成员均为切片器。¹⁰piRNAs主要存在于生殖系中，其基本功能之一是限制自私遗传元素的转座。

直到最近，人们还认为siRNAs和piRNAs是由分子间双链RNA（dsRNA）产生的，而miRNAs则是由分子内双链RNA产生的；¹¹一条特殊的线虫途径也通过RNA依赖的RNA聚合酶在切割转录物的3'端进行非启动合成来生成次级siRNA。^12,13piRNA的产生涉及一个前向循环，其中piRNA退火为互补转座相关转录物。^14-16来自piRNA主转录物的“反义”piRNA引导Piwi类复合物裂解活性转座子转录物并生成“义”piRNAs；这些相互作用通过piRNA主转录物的裂解产生更多的反义piRNA。（请注意，粗线期哺乳动物精子中存在大量非传递衍生piRNA的生物生成机制尚不清楚。它们的生成涉及长单链前体，但它们的反义对应物（如果有的话）仍有待发现）。相反，miRNA是由分子内dsRNA以反向重复转录的形式产生的。因此，miRNAs通常被认为是唯一一种可以由常规转录单位生成的Argonaute-bound小RNA，而无需跨退火机制（即通过互补转录物）或复制机制（即，通过能够合成互补链的RNA依赖性RNA聚合酶）。

最近，在苍蝇中发现了一种通过长反转重复转录产生siRNAs的新途径^17-19和老鼠，^20-21被称为发夹RNA（hpRNAs）。最典型的是果蝇，这些miRNA转录物的长表兄弟通过一条独特的途径进行处理，该途径包括许多典型的RNAi因子，但也包括一个典型的miRNA因子。该途径的实现模糊了miRNA和RNAi途径之间的区别，并对动物体内反向重复RNA基因的起源和功能提出了新的问题。

典型miRNAs和mirtrons的生物发生和功能

动物miRNAs是由短发夹（称为前miRNA）加工而成的，前miRNA本身是长得多的前体（称为pri-miRNAs）的产物。²²核RNAse III酶Drosha负责从pri-miRNA中“剪断”前miRNA发夹(图1和​和2A2安培).²³大多数前miRNA是非编码转录物，前miRNA可以来自这些转录物的内含子或外显子。然而，大约三分之一的前miRNA位于蛋白质编码基因的内含子中。²⁴

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图1

果蝇中典型miRNAs、mirtrons和hpRNAs的生物发生模型。这三种转录物都起源于细胞核，RNA聚合酶II转录物包含反向重复，可能是有盖的多聚腺苷酸物种。典型的miRNA首先被Pasha/Drosha复合物切割，以释放前miRNA发夹。Mirtrons是短的内含子发夹，通过剪接和去分支产生前miRNA模拟物。这两种类型的前miRNA都通过Exportin-5输出到细胞质，在那里它们被Dicer-1/Loqs复合物切割。产生的小RNA双链的通常命运是，一条链优先作为成熟miRNA加载到AGO1中，而其伙伴miRNA*链优先降解。然而，一部分miRNA物种被转移到AGO2中，并在其3'端甲基化；一部分miRNA*链也被转移到AGO蛋白中。发夹RNA处理不依赖Exportin-5，因此相关因素未知（？）；它可能通过传统的mRNA输出途径。在细胞质中，Dicer-2和Loqs是hpRNA成熟所必需的，但尚不清楚它们是否作为离散复合物发挥作用（？）。由此产生的小RNA双工体的典型命运是作为成熟siRNA优先加载到AGO2和3'甲基化。然而，一些hpRNA产物与AGO1相关。Dicer-2/R2D2复合物将外源性衍生的siRNA加载到AGO2中，但尚不清楚hpRNA衍生的siRNA是否如此（？）。

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图2

果蝇典型microRNA、mirtron和发夹RNA前体的示例。（A） 典型的miRNA前体包括一个由Pasha/DGCR8结合并被Drosha RNAse III酶裂解的下双链茎。合成的前miRNA发夹在末端环侧被Dicer RNAse III酶（特别是果蝇中的Dicer-1）裂解，产生miRNA/miRNA*双链。一条双链（在本例中为矮脚类，绿色阴影）优先加载到精氨酸蛋白中，从而使其具有更高的稳定性和克隆频率。克隆的bantam/bantam*读取数来自Ruby等人。⁵⁸（B） mirtron是一个短发夹内含子；所示为CG6695基因的一个示例。发夹末端与剪接的内含子重合，因此左侧RNA以剪接供体（此处为GUGGU）开始，右侧RNA以剪贴受体（此处为CAG）结束。典型的miRNAs和mirtrons都是由Dicer-1在其环侧进行处理的。然而，虽然成熟的miRNA共同来自左右发夹臂，但果蝇mirtrons的成熟miRNA几乎总是来自右臂（绿色阴影）。阅读来自Ruby等人。²⁶（C） 发夹状RNA是一种反向重复转录物，其双链区通常比典型的miRNA大得多；在这种情况下，约为400 bp。与其他一些hpRNA位点一样，hp-CG18854也包含一个大的非结构环，并且也是剪接的。因此，双链区域被基因组序列的大量间隔分隔开。hpRNAs产生3'悬垂的小RNA双链，就像典型的miRNAs和mirtrons一样。然而，仅hpRNAs就产生了多个相控的克隆双工体，这可能是因为它们是由Dicer-2处理的。给定复合体的优势种可以来自左臂或右臂（如绿色阴影所示）；阅读来自Okamura等人。¹⁸

miRNAs的一个子集来自短发夹内含子，称为“mirtrons”(图1).^25,26剪接机械直接定义mirtron末端，并通过落叶松脱枝酶将其线性化，然后采用典型的前miRNAs发夹结构(图2B). Mirtrons占无脊椎动物miRNA基因的5-10%^25,26和脊椎动物，^27,28但由于典型mirtrons的表达水平远低于典型典型miRNAs，因此推测其调节作用相对较窄。

由典型前体和mirtrons产生的Pre-miRNA发夹均通过Exportin-5从核中出口。在细胞质中，前miRNAs被RNase III酶Dicer切割，产生~21-22nt双链。双链的一条称为miRNA，优先选择进入含有精氨酸（AGO）蛋白的沉默复合物。^29,30miRNA将AGO复合物引导到靶转录物上的互补位点，这些位点大多（尽管不是唯一）位于3'UTR中。双链的伴侣链，即miRNA*物种，优先降解；然而，最近人们认识到，许多miRNA*物种也可以访问AGO复合物并调节靶点。³¹

如果引入一个与内源性miRNA完全互补的人工靶点，则通常会在miRNA 5'端测量的与核苷酸10和11相对的位置将其切片，³²正如mRNA与人工siRNA完全互补一样。^33,34在果蝇中，miRNAs优先被分类到较差的切片器AGO1中，而一小部分miRNAss被分类到主切片器AGO2中。^17,19,35-37目前尚不清楚miRNAs切片功能的内源性调节目的，因为除了少数例外，^38,39动物miRNAs与内源性mRNAs不完全配对。事实上，Watson-Crick碱基配对到5'端2-8位的7个核苷酸（miRNA“种子”）就足以指导实质性抑制。^40-43具有高度保守的种子匹配的转录物被推断为维持与同源miRNA的功能调节相互作用，并且至少占哺乳动物转录物的30%。⁴⁴其他功能性miRNA靶点可能具有不完美的种子匹配^40,45,46或者保存得很差。^47-49miRNAs抑制不完全配对靶点的机制目前存在争议，近年来发表的许多模型都得到了实验支持。这些包括核糖体的隔离（通过重定域进入P小体）、翻译起始的阻断、起始后的翻译抑制、共翻译降解以及与转录降解耦合的靶向去烯基化。⁹

miRNA基因发现策略

虽然一些miRNAs是纯粹通过基因手段发现的，但大多数是通过克隆和/或计算手段发现的。在克隆方法中，短RNA是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的大小分级制备的，^4,6,7或与含精复合物共同免疫沉淀。^50-52在逆转录和测序之后，人们尝试将克隆的~21-24 nt RNA映射到局部基因组反向重复序列。在计算方法中，我们确定了进化上保守的发夹，这些发夹表现出核苷酸发散的特征模式，即末端环的进化速度比发夹臂更快的候选者。^53,54考虑一些结构和/或序列细节可以进一步丰富可能的miRNA，尽管特异性的提高总是在敏感性的某些权衡中实现的，因为一些真正的miRNA发夹不可避免地无法通过某些标准。^55-59

当前的计算方法利用了强大的比较分析，现在可以对数十个组装好的动物基因组进行比较分析，克隆方法极大地受益于下一代测序策略的能力，该策略能够在一次运行中产生数百万个短RNA序列。这些联合方法现在已经产生了数千个miRNAs。⁶⁰这种miRNA分析的深度是否意味着我们能够很好地处理miRNA基因的外观？事实上，我们没有。与蛋白质编码基因发现者相比，目前没有有效的方法在不考虑比较基因组学的情况下跨复杂基因组进行miRNA基因发现。另一个严重的问题是，大多数计算工作都依赖于基于最初克隆的miRNAs的一组相当狭窄的标准。⁶¹例如，最近的一项研究使用深测序数据，确信果蝇体内一些出乎意料的长miRNA发夹，其长度是典型前miRNA的两倍，⁵⁸几乎被大多数miRNA注释器忽略的范围。此外，最近发现miRNAs可以来源于mirtrons，mirtron的发夹太短，不符合标准miRNA的资格，^25-27进一步表明，非典型结构的miRNA基因可能仍有待鉴定。

果蝇发夹RNA从长反转重复转录物生成siRNA

几年前，使用反向重复快速回复构建体在苍蝇中诱导转基因RNAi，^62-64尽管它们很难克隆，而且在某些情况下敲除的次数是可变的。后来人们意识到发夹茎之间的间隔物⁶⁵可以提高细菌和转基因动物中这种反向重复序列的稳定性，⁶⁶尽管在某些情况下击倒仍然是可变的。第三个创新是包含了一个内含子⁶⁷或跨内含子的基因组片段的掺入；⁶⁸有人认为这些促进了它们的击倒活性。有趣的是，一项旨在注释果蝇中假定的非编码mRNA-like（pncr）分子的早期研究发现了一个剪接的多聚腺苷化转录物，命名为pncr009。⁶⁹虽然当时没有报道，但在某些方面它与典型RNAi转基因的设计非常相似：它有约400 bp的茎和一个长的、拼接的末端环。唯一的区别是它的茎是不完全配对的，类似于一个长的miRNA发夹。

计算方法可用于识别长倒转录本的其他潜在示例。该策略在拟南芥中被有效地用于鉴定miRNA基因。^70,71然而，在缺乏支持性实验证据的情况下，基因组反向重复序列的列表用处有限。很容易找到数千个长的倒置重复，但它们不一定包含在一个定义的转录单位中。绝大多数涉及转座子的长末端重复，并且大量剩余的基因座包括以会聚或发散方向排列的串联重复tRNA或蛋白质编码基因。¹⁸然而，其中一些包含在测序、剪接的cDNA中，表明它们可能也属于pncr009类。事实上，其中一些基因与pncr009聚集在基因组中。¹⁸

最近，克隆果蝇小RNA的大目录的可用性使得基因组反向重复序列列表得以合理评估。这表明产生小RNA的反向重复数有限，并且没有映射到转座元件或卫星序列。¹⁸其中，通过检查映射到每个位点的RNA的大小分布，评估了其中一些位点被降解为克隆的分解片段而不是生成加工的小RNA的可能性。通过要求大多数克隆的小RNA的长度相对于所有其他大小为21-22 nt，该分析将其归结为7个基因组位点，这些位点被预测为长反向重复，并主要生成21-22 ntRNA（例如。，图2C); 其中一个位点（hp-CG4068）由20个串联重复序列组成。¹⁸其中几个位点由全长聚腺苷化cDNA表示，表明它们来自常规RNA聚合酶II转录物；其中一些也进行了拼接。这些被统称为发夹RNA（hpRNAs）。

尽管miRNA前体和hpRNAs都是不完美的反向重复，但这些RNAs被导入不同的生物发生途径。与人工底物产生的外源性siRNA类似，hpRNAs由Dcr-2而不是Dcr-1处理，加载到AGO2中，并在其3'端被Hen1甲基转移酶修饰(图1).^17-19就像来自人工长倒置重复序列的siRNA一样，⁷²来源于hpRNAs的siRNA双链也具有阶段性(图2C). 人工底物和内源性底物的测试表明，hpRNAs可以抑制并直接切割靶点。^17,18因此，hpRNAs产生siRNAs。奇怪的是，hpRNA-衍生的siRNAs的积累需要Loquacious（Loqs），Loqs是dsRBD蛋白，协助Dcr-1裂解前miRNA发夹(图1).¹

果蝇体内内源性hpRNA靶点

在植物中，大多数miRNAs表现出对一个或几个mRNAs的扩展互补性。现在已经有相当一部分人被证实可以直接切割这些靶点，⁷⁰尽管应该指出，植物miRNAs也可以介导高度互补靶点的翻译抑制。⁷³miR-196是一个罕见的动物miRNA的例子，它与靶点基本上是完全互补的(霍克斯B8)并引导其分裂。^38,39一些果蝇hpRNA-衍生的siRNAs与内源性转录物几乎完全互补。例如，hp-CG4068的一个siRNA产物与缪斯308一种参与DNA损伤反应的DNA聚合酶。这是迄今为止表征最好的hpRNA靶点，已通过培养细胞中的传感器测试和测试内源性hp-CG4068和内源性hp-CG4068的切割试验得到验证缪斯308.^17,18另一种hpRNA，hp-CG18854是CG8289号，编码一个色域蛋白。^17,18在培养细胞中检测到hp-CG18854衍生的siRNAs的内源性调节活性，升高的hp-CG118854可以抑制CG8289-GFP标准传输中的融合目标。¹⁸

这些观察结果表明，hpRNA-衍生的siRNAs可以通过切割内源性转录物来靶向内源性转录。然而，目前尚不清楚hpRNA衍生的siRNA是否可能靶向互补性有限的内源性靶点。在迄今为止进行的一项测试中缪斯308-靶向hp-CG4068 siRNA似乎并没有实质性地抑制种子匹配的靶点。¹⁸然而，由于果蝇siRNA能够切割互补性不足的靶点，⁷⁴可以想象，可能存在额外的hpRNA靶点。

哺乳动物假基因的类似siRNA系统

同时对小鼠卵母细胞的研究显示，有四个位点被指定为发夹RNA。事实上，最丰富的siRNA位点之一是由一个长倒位重复序列假基因组成的hpRNA距离1基因，^20,21与hp-CG18854:CG8289的情况类似果蝇属与果蝇hpRNAS一样hp-Rangap1型（也称为Au76（澳大利亚）)依赖于Dicer，并且Dicer公司-突变卵母细胞表现出同源基因的显著上调距离1抄本。目前尚不清楚这种调控策略是保守的还是收敛的，但这些发现表明，从长倒置重复序列生成siRNA的类似系统在果蝇和哺乳动物中都起作用。

奇怪的是，哺乳动物卵母细胞展示了一个更复杂的伪基因衍生siRNA网络，其中至少涉及20-30个反义转录假基因及其同源祖细胞。有人提出，siRNAs是由退火基因形成的dsRNA生成的：假基因互补对，它们的调节作用通过上调许多siRNA互补转录物来证明Dicer公司-突变卵母细胞。^20,21因此，虽然假基因通常被认为是非功能位点，但分子内和分子间机制都可以从假基因中产生调节性siRNA。

hpRNA研究的未来问题

hpRNA通路的发现引发了许多问题，这些问题无疑将使小RNA研究人员忙碌多年。一个关键问题是关于hpRNA和miRNA前体是如何分离的。正如最矮的巨人和最高的矮人在高度上重叠一样，也有“短”的hpRNAs¹⁸和“长”miRNA⁵⁸看起来难以区分的。然而，这些被分为不同的生物发生途径，因为长的miRNA发夹仍然只产生一个小RNA双链，而短的hpRNA产生多个小RNA双链。在缺乏仅仅依赖于大小的机制的情况下，可能有一种更复杂的策略，可以防止hpRNAs被Dcr-1处理，和/或防止前miRNAs受到Dcr-2切割。任何一种假定的排序机制的性质仍有待更好地理解。

然而，更典型的是，hpRNA干环比miRNA干环长得多。hpRNA茎长度的上限是多少？是否存在跨重复的反向重复基因的直读转录本，这些重复基因可能会产生长达数千个碱基的hpRNA-like折叠？这种途径可能产生部分转座子衍生的siRNA吗？^17,19,36,75这可能类似于通过Tc1元件的转录读取产生线虫siRNAs，通过末端反向重复序列形成分子内dsRNA。⁷⁶最后，一些hpRNAs来自剪接的初级转录物。^17,18他们的内含子大小有限制吗？如果没有，可能存在其茎被长内含子分隔的hpRNAs，长度可能有几十千个碱基？这些问题的答案有待于未来的研究。

经典miRNA因子Loquacious（Loqs）在hpRNA加工中起着重要作用，这一发现引发了另一个谜团。Loqs是一种dsRBD蛋白，通常被描述为核心miRNA生物发生因子，帮助Dicer-1切割前miRNA发夹。^77-79然而，仔细审查后勤保障最近的无效突变动物和生化重建实验表明Loqs仅起辅助作用。⁸⁰虽然它肯定与miRNA的生物发生有关，但在缺乏Loqs的情况下，大量miRNA位点的成熟是相当正常的。令人惊讶的是，Loqs被证明是许多hpRNA-衍生siRNAs积累的强烈需求(图1).^17,18Loqs是否与Dicer-2直接合作生成某些类型的siRNAs？要解决这一问题，可能需要在体外用特定因子重建hpRNA处理。

先前研究表明，由完全双链底物产生的siRNA需要dsRBD蛋白R2D2，该蛋白指导Dicer-2将siRNA加载到AGO2中。^81,82R2D2直接绑定Dicer-2，就像Loqs直接绑定Diker-1一样。人们可能会认为，前miRNAs和hpRNAs中发现的不完善的dsRNA可能解释了它们对Loq的共同需求。然而，情况似乎并非如此，因为一些转座siRNAs和顺-NAT-siRNAs同样需要Loq进行积累。^17,75,83虽然早期的蛋白质相互作用研究没有揭示，但Dicer-2复合物的蛋白质组学分析表明可能存在Dicer-2/Loqs复合物。¹⁷这些蛋白质是否直接作为一个团队来处理内siRNA，是这样吗，它们在切割或装载siRNA时需要吗？显然，关于RNAse III酶及其dsRBD伙伴的功能性伙伴关系还有很多需要学习的地方。

也许最重要的是，hpRNAs的内源性功能是什么？hpRNAs的最佳特征靶点编码色域蛋白(CG8289号)和核酸酶(音乐308).^17,18hpRNA缺失突变体的产生和分析将有助于解决这些调节相互作用的内源性意义。奇怪的是，果蝇产生siRNAs的顺-天然反义转录物也富含各种核酸酶和转录辅因子。⁸³也许这些发现表明果蝇内切siRNA网络有一个共同的分子轴。

致谢

参考文献