脯氨酰3-羟化酶P3H2和P3H3是乳腺癌表观遗传沉默的新靶点

表达式分析

使用RNeasy试剂盒提取总RNA（英国西苏塞克斯郡Qiagen有限公司）。RNA（500 ng）用于cDNA合成（ImProm-II逆转录系统；英国南安普敦Promega）。的表达式第3H1页,第3H2页和第3页3通过RT-PCR进行分析，并归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。引物是使用Primer3软件（美国新泽西州Totowa）设计的。RT-PCR引物序列为：

第3H1页：5′-CTGCACCACACCTTCTTC-3′（正向）；5′-ACAGCTTCCTGTGGCTGTTC-3′（反面），产品尺寸，183 bp；

第3页第2页：5′-TGATGACTTGAAGGAGAA-3′（向前）；5′-AGAGCCACAGCACACCTCT-3′（反向），产品尺寸，165bp；

第3页3：5′-GACTGGCCTGACCCAGTGC-3′（正向）；5′-CTGCCAATCACGCTTCTTC-3′（反向），产品尺寸，153bp；

GAPDH公司：5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGAGTT-3′（正向）；5′-GCCATGGAATTTGCCATGGGTGG-3′（反向），产物大小，143bp。

PCR在20μl体积，使用1.8×ReddyMix PCR Master Mix（Abgene，Epsom，UK）。反应产物在用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上分解，并在UV下可视化。

对于western blotting，细胞用RIPA裂解缓冲液进行裂解。蛋白裂解物（40μg） 在8%SDS–PAGE凝胶上溶解，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，与一级抗体孵育1h。

兔抗P3H2抗体如前所述(贾纳姆等, 2004)并以1:1000的稀释度使用。针对肽CHQRVQDKTGRAPRVREEL（Biogenes，Berlin，Germany）制备抗P3H3的多克隆兔抗体，并以1:100的稀释度进行使用。二级抗体是亲和纯化的HRP-结合羊抗兔抗体，以1:2000年（英国剑桥郡达科）。使用抗增殖细胞核抗原（1:10000）作为负载对照。

亚硫酸氢盐改性

使用DNeasy试剂盒（Qiagen有限公司）从细胞颗粒中提取基因组DNA（gDNA）。基因组DNA（500 ng）用于使用Zymo EZ DNA甲基化试剂盒（英国汉普郡Genetix）对亚硫酸氢盐进行修饰，并于200年洗脱μl分升₂O.每个亚硫酸氢盐修饰物中都包含非甲基化人类DNA和CpGenome Universal甲基化DNA（Chemicon International，Temecula，CA，USA），它们分别用作阴性和阳性对照。

甲基化分析第3H2页和第3页3CpG群岛

甲基化通过甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸氢盐测序进行分析。底漆是使用MethPrimer软件设计的(http://www.urogene.org/methprimer网站/).

甲基化特异PCR引物第3H1页为：5′-GTTTTTAAGTCGAGGTCGATCTC-3′（甲基化前体）；5′-ACTAAATAGACAACGCAAACG-3′（甲基化逆转），产品尺寸，180 bp；5′-TTTTTAAGTTGAGGTTGAGTTTGA-3′（非甲基化前体）；5′-CACTAAAATACACACACAAAAAA-3′（非甲基化逆转），产品尺寸，172 bp。甲基化特异PCR引物第3页第2页为：5′-AGAGGGTTTCGGGGTATTTC-3′（甲基化前1）；5′-TAAAACGACTAACAACCAACACGAC-3′（甲基化逆转1），产品尺寸，158 bp；5′-GAGAGGTTTTGGGGTATTT-3′（非甲基化前1）；5′-CTTAAAAACTAACAACCAAACAAACC-3′（非甲基化逆转1），产品尺寸，162 bp。5′-TTTTTT CGTTTTGTTGGGGC-3′（甲基化前2）；5′-CGAAAACGCTAAATCACACACGAT-3′（甲基化反向2），产品尺寸，60 bp。5′-TTTTTGTTTTTTTGGGGTGG-3′（非甲基化正向2）；5′-CCCAAAAACTAACTAATCACAACTAC-3′（非甲基化逆转2），产品尺寸，61 bp。甲基化特异PCR引物第3页3分别为：5′-GAGGTAGGTTGGGGTTTC-3′（甲基化前）；5′-CAACCACGTAAAACAACTACGAT-3′（甲基化逆转），产品尺寸97 bp；5′-AGGTAAGGTTGGTTTTTTTG-3′（非甲基化前体）；5′-CCCACACACACATAAAACACACTAC-3′（非甲基化逆转），产品尺寸，98 bp。

甲基化特异性PCR在20μl体积，使用Thermo-Start PCR Master Mix（Abgene）。标准热循环条件是8个循环的初始“热启动”，然后再进行30个循环，最后延长。PCR产物在用溴化乙锭（Promega）染色的2%琼脂糖凝胶上解析，并在UV下可视化。

测序法

以亚硫酸氢修饰的gDNA为模板进行PCR反应。底漆是使用MethPrimer软件设计的。底漆第3H2页设计跨越整个预测的CpG岛，在5′端和3′端再增加200 bp。

P3H2的引物序列为：

5′-ATTTGTAATTAGAGGAGTTTTA-3′（向前）；5′-AACAACAAAAAAAAACTCAAAAAAC-3′（反向），产品尺寸，937 bp。

用于亚硫酸氢盐序列分析第3页3在CpG岛上设计了三组引物，分别在5′端和3′端扩增200 bp。

引物序列第3页3是：

5′-TTGTGTTATTGTGTTTTT-3′（正向1）；5′-CCCACCTTAATAAAAACCCTCTAC-3′（反向1），产品尺寸，482 bp。

5′-ATTGTTAGAGGTTTATTAGGTGG-3′（向前2）；5′-AACCCTAAAACTAAAAATAAATACAACC-3′（反向2），产品尺寸，585 bp。

5′-GAGGTTAAGGTTGGGGTTT-3′（正向3′）；5′-CTCAATTTAAAAAACCAAATAAAAATAATA-3′（反向3），产物大小，230bp。

反应在50μl体积，使用Thermo-Start PCR Master Mix（Abgene）。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行解析，从凝胶中取出正确分子量的产物，使用凝胶提取试剂盒（Qiagen Ltd.）进行纯化，连接到pCR2.1 TA载体（Invitrogen）并转化为One Shot Top10化学活性大肠杆菌（Invitrogen）。通常情况下，每个细胞系挑选八个菌落，并使用BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequenting kit（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）用反向引物测序。

临床组织

在Tayside组织银行地方研究伦理委员会批准后，使用M48 Qiagen DNA提取机器人从184例原发性、以前未经治疗的乳腺癌中提取基因组DNA。在用于DNA提取之前，对癌症进行组织病理学检查，以确保肿瘤细胞具有足够的代表性。作为常规临床护理的一部分，对雌激素受体、孕酮受体和HER2的表达进行了测量（使用抗体CB11，针对2阳性癌症补充FISH以确认扩增）。临床和病理数据包括肿瘤分级、肿瘤类型、病理节点状态、无复发和总生存率。

集落形成分析

异位表达的质粒第3H2页和第3页3如下：pEGFP-N1-第3H2页如前所述(Jarnum公司等, 2004). pCMV6-XL6载体中的全长P3H3 cDNA购自Origene（Rockville，MD，USA），插入物被亚克隆到pcDNA3.1中，作为不是1个碎片。通过对多个质粒克隆进行测序确定正确的方向。评估异位表达对细胞增殖的影响第3H2页和第3页3，细胞系转染4μg以上表达克隆或空载体单独使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。转染24小时后更换培养基，并在G418（800）中选择转染细胞μ克毫升⁻¹). 16天后，存活的菌落被固定在4%多聚甲醛中，用磷酸盐缓冲盐水和dH清洗₂O、 干燥，然后用液晶紫染色（英国多塞特Sigma-Aldrich）并计数。实验一式三份。

甲基化异常第3H2页和第3页3在乳腺癌细胞系中

我们在5′序列中确定了CpG岛第3H1页,第3H2页和第3页3基因(网址：http://genome.ucsc.edu). 为了确定启动子甲基化是否是基因表达缺失的原因，我们对第3H1页,第3H2页和第3页3在每个乳腺癌细胞系中。CpG岛第3页第1页在每个细胞系中均未甲基化，与表达分析一致(图1C). 在以下情况下第3H2页甲基化，初始分析使用位于CpG岛中心的引物，这些引物检测到MDA MB 453和T47D细胞系中的甲基化，这两种细胞系均缺乏可检测的第3H2页然而，使用该引物集进行的分析并没有在一些缺乏P3H2表达的细胞系中检测到甲基化。因此，我们设计了位于CpG岛进一步3′的第二组引物。使用此引物集对细胞株面板进行分析，发现MDA MB 361、MCF7、BT474和SKBR3以及MDA MB 453和T47D中还存在甲基化(图1C)，与mRNA的下调建立了良好的相关性第3页3使用单一引物集的CpG岛检测到细胞株MDA MB 231、MDA MB 361、MDA MB 468、MCF7、BT474和SKBR3的甲基化(图1C)，证实了MSP检测到的甲基化与mRNA下调之间的明显相关性。

为了更详细地描述甲基化第3H2页和第3页3CpG岛，我们使用亚硫酸氢盐测序，在之前由MSP分析的一组细胞系中绘制了每个岛(图2和​和3）。三). 这些研究与MSP分析密切相关。例如，在第3H2页通过MSP引物对1取样的CpG岛区域仅在MDA MB 453和T47D细胞系中甲基化。相反，通过MSP引物对2取样的CpG岛区域在所有缺乏P3H2表达的细胞系中都含有甲基化。与甲基化依赖的转录沉默一致，一些表达P3H2 mRNA的细胞株显示出极低的CpG甲基化频率(图2). 在以下情况下第3页3，在整个CpG岛上观察到甲基化，与MSP分析一致(图3). 与相同第3H2页，在一些表达P3H3 mRNA的细胞系中甲基化水平极低(图3). 这两个岛的整个CpG岛第3H2页和第3页3在正常乳腺上皮中未甲基化。

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图2

亚硫酸氢盐序列分析的示意图第3H2页乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮（HMEC）中的CpG岛。按照材料和方法中的描述进行亚硫酸氢盐测序。用于MSP的引物对1和2分别表示为集合1和集合2。刻度上的粗黑线表示外显子1相对于CpG岛的位置。P3H2开放阅读框部分在CpG岛内的位置由标尺上方的虚线表示。标尺下方的垂直线表示CpG岛内的单个CpG二核苷酸。每个细胞系的甲基化密度由对应于每个CpG的四分之一块表示。黑色阴影表示高达25%的甲基化。开放区块表示没有甲基化。MDA MB 361、MDA MB 453、MCF7、T47D和BT474细胞系中存在密集的甲基化。HMEC中没有甲基化。

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图3

亚硫酸氢盐序列分析示意图第3页3乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮（HMEC）中的CpG岛。按照材料和方法中的描述进行亚硫酸氢盐测序。用于MSP的底漆显示在刻度上方。刻度上的粗黑线表示外显子1相对于CpG岛的位置。部件的位置第3页3CpG岛内的开放阅读框由标尺上方的虚线表示。刻度下方的垂直线表示CpG岛内的单个CpG二核苷酸。每个细胞系的甲基化密度由对应于每个CpG的四分之一块表示。黑色阴影表示高达25%的甲基化。开放区块表示没有甲基化。MDA MB 231、MDA MB 361、MDA MB 468、MCF7和BT474中存在甲基化。CpG岛在HMEC中均未甲基化。

甲基化第3H2页针对乳腺癌

甲基化依赖性转录沉默的观察第3H2页和第3页3促使我们检测其他常见实体瘤类型细胞系中P3H基因的表达和甲基化。在卵巢、头颈部、外阴、黑色素瘤、胶质母细胞瘤和肾癌细胞系中，第3页3与乳腺癌一样，这与mRNA的下调有关(图1D; 数据未显示）。相反，我们没有发现甲基化的证据第3H2页分析多种其他肿瘤类型的细胞系，包括卵巢和肾腺癌、外阴和头颈部鳞癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤(图1D; 数据未显示）。这些结果表明，尽管第3页3在人类癌症中广泛甲基化第3页第2页仅限于乳腺癌，至少在我们在本研究中分析的肿瘤类型内。

第3H2页和第3页3原发性乳腺癌中的基因甲基化

接下来，我们测试了CpG群岛第3H2页和第3页3在184例原发性乳腺癌中甲基化。根据对上述细胞系的研究，用引物集2进行MSP分析第3H2页与mRNA表达下调密切相关。为了进一步证实该引物组用于甲基化检测的实用性，我们对MSP指定为甲基化或非甲基化的八种癌症进行了初步亚硫酸氢盐测序。这些初步研究充分证实，引物对2准确评估了甲基化状态，因此该引物对用于全组病例的所有后续分析(图4). 甲基化频率第3H2页和第3页3在184份分析过的乳腺样本中，分别有42%和26%。甲基化状态与临床病理参数之间存在一些关联(表1). 首先，甲基化第3H2页CpG岛与雌激素受体阳性状态呈正相关(P（P）=0.0053），而甲基化在第3页3CpG岛没有这种联系(P（P）=0.71) (表1). 这一观察促使我们确定在乳腺癌细胞系中是否存在类似的关联。除MDA MB 453外，所有细胞系均在P3H2 CpG岛甲基化（MDA MB 361、MDA MB 45%、MCF7、T47D、BT474和SKBR3表达雌激素受体）。甲基化第3页3CpG岛与肿瘤分级增加呈正相关(P（P）=0.02），诺丁汉预后指数较高(P（P）=0.02）。然而，我们没有发现任何一个基因甲基化与临床结果相关的证据(表1).

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图4

这个第3H2页和第3页3CpG岛在原发性乳腺癌中甲基化。(A类)亚硫酸氢盐序列分析第3页第2页随机选择的8例原发性乳腺癌中的CpG岛。该图显示了第3H2页CpG岛如图例所述图2刻度下方的垂直线表示CpG岛内的单个CpG二核苷酸。每个细胞系的甲基化密度由对应于每个CpG的四分之一块表示。黑色阴影表示高达25%的甲基化。开放区块表示没有甲基化。(B类)甲基化特异性PCR分析第3H2页在原发性乳腺癌中。它显示了通过MSP和亚硫酸氢盐测序分析的每个癌症的数量（在MSP凝胶中下划线）。还显示了未甲基化（CU）和甲基化（CM）控制DNA，在每种情况下与原发癌DNA样本并行修改。如图所示，MSP使用引物集2将案例277、424、431、446、453和473鉴定为甲基化阳性，而案例301和326为阴性，证实了该引物集对甲基化检测的敏感性和特异性。

这项工作由突破性乳腺癌和苏格兰乳腺癌研究资助。TC是CRUK临床科学家奖的获得者。