分离大脑皮质神经末梢的微图生物能量分析：剩余呼吸能力和随机线粒体衰竭

突触体的制备

从17-21天龄的CD1小鼠大脑皮层中，用Dunkley等人（1986年）稍作修改。简单地说，快速去除大脑皮层（0.1-0.2g/大脑），用冰镇“蔗糖培养基”（320 mM蔗糖，1 mM EDTA，0.25 mM二硫苏糖醇，pH 7.4）冲洗，以去除多余的血液，转移到含有3 ml蔗糖培养基的预冷Dounce玻璃均质器中，并上下轻轻均质8-10次。然后在4°C下以1000g离心匀浆10分钟。将上清液小心地分层在15ml离心管中的不连续Percoll梯度（3ml蔗糖培养基中的3%、10%和23%Percoll层）的顶部，并在Beckman Avanti J-26 XPI离心机中的JA-25.50固定角度转子中在4°C下以32500g离心10分钟。突触体分离为10%至23%Percoll之间的带。值得注意的是，重新密封的胶质膜（胶质体）是从2-6%的Percoll边界分离出来的(斯蒂利亚尼等。2006).

将突触体带稀释成“离子介质”（20 mM HEPES，10 mM D-葡萄糖，1.2 mM Na₂高性能操作₄，1 mM氯化镁₂，5 mM NaHCO_三，5 mM KCl，140 mM NaCl，pH 7.4）或稀释至“蔗糖培养基”。在4°C的温度下，在15000g的温度下离心15分钟，以去除Percoll。在呼吸测定或共焦成像之前，将最后的突触体颗粒分别重新悬浮在离子或蔗糖介质中。

突触体附着

海马呼吸测定法和共焦成像法都要求突触体牢固地附着在基底上。聚苯乙烯海马板和玻璃底96孔板均涂有聚乙烯亚胺（50%溶液的1:15000稀释液，圣路易斯Sigma-Aldrich），以优化附着。虽然有许多研究表明，离子介质中的突触体可以在单位重力下沉积在涂有Cell-Tak的盖玻片上（BD Biosciences，San Jose，CA）(尼科尔斯和莫拉德，1996年;Nayak等人，2001年)或聚-D-赖氨酸(Millán等人，2002年)聚集体而非离散的单个突触体的相对高频率限制了在单个场中成像多个离散终端的能力。

当突触体悬浮在具有显著离子强度的介质中时，突触体会聚集，但在离子强度极低的蔗糖基隔离介质中，突触体保持离散。呼吸测定法和共焦成像有着截然不同的要求，因此，对于前者来说，重要的是优化连接突触体的产量，并确保连接足够牢固，以防止在XF24呼吸计每次测定之前发生的剧烈混合期间末端移位(图1b). 相比之下，对于共焦成像，产量是次要的，但最好是优化连接的“单体”突触体的均匀场，以便区分单个终末。初步实验确定，离子介质具有最佳的呼吸测定高产率，而基于蔗糖的制备介质具有均匀的单体突触体成像场(图1c). 用TMRM平衡图像的直径(图1d)与单个离散突触体一致(琼斯和布雷利，1973年).

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图1

用50nM TMRM平衡突触体的共焦成像。成像前，允许“离子介质”中的突触体在单位重力（a）下沉积，或在3400g（b）下离心60分钟。（c） 平行离心蔗糖培养基中的突触体。场尺寸为115×115μm。（d） “c”的放大区域。代表性粒子的密度分布（箭头）给出了1.8μm的直径，这是典型的突触体。

呼吸和介质酸化率

为了监测呼吸，将“离子”突触体（10μg蛋白质/孔，除非另有说明）等分到20孔聚乙烯亚胺涂层的XF24 V7细胞培养微孔板中（马萨诸塞州北比勒里卡Seahorse Bioscience）。在Eppendorf 5810R离心机中的A-4-62转子中，以3400g的速度在4°C下离心平板1小时。控制实验确定，这会导致连接突触体聚集物，其足够坚固，能够承受机器的混合协议。用700μl“培养基”（3.5mM KCl、120mM NaCl、1.3mM CaCl）代替离子培养基₂，0.4mM千赫₂人事军官₄，1.2mM钠₂SO公司₄，2mM硫酸镁₄，15mM D-葡萄糖，4mg/ml BSA，37°C）。立即使用盘子或在冰上储存不超过3小时。按照制造商的说明，将细胞培养微孔板培养并装入Seahorse XF24细胞外通量分析仪。所有实验均在37°C下进行。XF24利用一个专门的多孔板，降低传感器阵列，在24个孔中的一层附着细胞（或在本例中为突触体）上方封闭7μl液体体积，每个孔的总体积约为700μl。在1-3分钟的时间段内，当体积被封闭时，吸氧和介质酸化由固定在传感器基质中的荧光探针进行监测，随后升高并振荡，以确保在下一次测量或添加试剂（视情况而定）之前与散装介质混合和复氧。耗氧量和酸化率数据点在测量周期内变为平均速率，包括30秒的混合时间和2分钟的等待时间，然后是3分钟的数据采集周期（13个数据点）。将所有试剂以适当的稀释度加入75μl培养基中。

O传感器检测到7μl包封体积中的氧气浓度₂-探针的猝灭荧光。使用Stern-Volmer方程校准探针的非线性响应。通过使用基于隔室模型的“去卷积”算法来确定耗氧率，该算法补偿了截留体积周围发生的氧扩散现象和探针的响应时间（Gerencser等人，未发表的结果）。通过该算法获得的速率与附着在平板上的突触体数量成正比，并且在基础呼吸期间保持稳定（未显示）。大多数呼吸速率表示为培养基（含15mM葡萄糖）中基础呼吸的百分比，除非报告了绝对速率。同时监测培养基的酸化速率。结果相对于葡萄糖培养基中突触体的基础酸化率进行了标准化。

共焦显微镜

对于单突触体共焦成像，将“蔗糖”突触体（3μg蛋白质/孔）在Whatman 96 well玻璃底多孔板中等分为4×3个孔的子集，并与“离子”突触体平行离心。随后将10nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM）和1μM四苯硼装入突触体40min。在蔡司LSM510共焦显微镜中，使用40×/0.95的Plan-Apochromat空气物镜，在543nm的激发和>560nm的发射下，使用蔡司LSM软件的“多次失效”模块监测荧光。以约9分钟的间隔记录512×512个图像的单平面，分辨率为0.088μm/像素，每次图像采集之前都会自动对焦。

单突触体线粒体膜电位分析

对延时图像序列进行校准，以稳定序列图像中由于x、y级电机的不准确而导致的任何寄存器缺失。这是根据与TMRM信号并行记录的透射光图像进行的。在图像直方图的第一个百分位减去背景。然后以ω=0.55-2μm/周期对TMRM荧光图像序列的副本进行带通空间滤波(Gerensser和Nicholls 2008)增强突触体大小物体的细节并减少噪音。然后以Otsu的最佳阈值进行二值化(大津，1979年). 单个突触体（面积至少为10像素，直径最大为20像素）通过二值化图像分割定位，并在整个时间序列中跟踪其位置。在原始的、减去背景的TMRM荧光图像中测定每个片段对应的荧光强度，得出每个突触体的荧光强度随时间的推移。对于在实验期间获得或丢失TMRM荧光信号的突触体，在第一个或最后一个已知位置测量强度。最后，将TMRM信号（F）归一化为两个基线数据点（F）的平均值₀)并通过计算26.7mV×₀)/F类₀+1). 因此，负号表示去极化。

为了可视化总体，Δψ的变化直方图_米Mathematica 5.2（伊利诺伊州香槟市Wolfram Research）计算了单个突触体的数量。t=0时，相对Δψ_米字段中每个突触体的数量定义为零（因此从直方图中省略）。每隔大约9分钟拍摄一次现场图像改变记录t=0时的电位。将+20mV（超极化0至−50mV（去极化））的范围划分为40个箱子，并绘制每个箱子中突触体的百分比。使用用Pascal语言（Delphi 2009；德克萨斯州奥斯汀Borland）和Mathematica 5.2编写的定制图像分析软件进行图像处理。

厌氧糖酵解的贡献

突触体表现出强大的巴斯德效应，在线粒体ATP合成受到抑制的情况下促进糖酵解(Kauppinen和Nicholls，1986年b). Seahorse呼吸计可以检测作为细胞外酸化的乳酸释放。图2D结果表明，添加寡霉素后，葡萄糖培养基中的酸化速率增加，这与厌氧糖酵解的激活相一致，以补偿被抑制的线粒体ATP合成。在葡萄糖加丙酮酸盐存在的情况下，酸化速率相似，在这两种情况下，进一步添加FCCP导致酸化速率进一步增加。在无葡萄糖丙酮酸盐培养基中，添加寡霉素并没有增加，但FCCP会增加酸化。由于添加FCCP在每种情况下都与呼吸大幅度增强有关，这表明CO₂TCA循环的演变有助于介质中检测到的介质酸化。在这些实验中，在使用寡霉素的情况下，FCCP后酸化率和呼吸缓慢下降是一个一致的特征，这可能是细胞质和基质在这些条件下发生酸化的结果。

丙酮酸代谢

α-氰基肉桂酸是线粒体内膜丙酮酸转运体的抑制剂(Hildyard等人，2005年). 丙酮酸作为底物在就地线粒体表现为多余呼吸能力受到广泛的浓度依赖性抑制(图4A). 值得注意的是，抑制剂对基础或寡霉素抑制的呼吸没有显著影响，这表明添加转运抑制剂后的呼吸限制仅在丙酮酸利用率最大的条件下才明显，即丙酮酸转运和丙酮酸脱氢酶对基础呼吸速率几乎没有控制作用。由于丙酮酸脱氢酶的活性受到丙酮酸激酶的抑制，因此有必要确定在这些条件下脱氢酶是否被最大限度地激活。二氯乙酸抑制激酶，从而使丙酮酸脱氢酶活性最大化(Fuller和Randle，1984年). 用高达1 mM的二氯乙酸滴定突触体，无法影响基础的、抑制寡霉素或FCCP刺激的呼吸，也未检测到对乳酸挤出的影响（由细胞外酸化率监测）（数据未显示）。这支持了早期的迹象，即丙酮酸脱氢酶对突触体制剂中的呼吸几乎没有控制作用(Kauppinen和Nicholls 1986年a). 糖酵解丙酮酸的线粒体氧化依赖于细胞质NADH的氧化。苹果酸/天冬氨酸穿梭在这方面的重要性(Kauppinen等人，1987年)转氨酶抑制剂氨基氧乙酸对剩余呼吸能力的抑制证明了这一点(图4B).

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图4

α-氰基肉桂酸和氨基氧乙酸对FCCP刺激呼吸的抑制作用。（A） 最初以15mM葡萄糖作为底物。如有指示，添加0-100μMα-氰氰菊酯（CCIN），然后添加4μg/ml寡霉素（oligomycin）和4μM FCCP。（B） 在指定位置添加0-100μM氨基氧乙酸盐（AOAA）。在这些实验和随后的实验中，呼吸是相对于葡萄糖培养基中的基础呼吸进行计算的。

线粒体与质膜离子通量的耦合

突触前Na⁺/K（K）⁺-在钠重入增强的情况下，ATP酶是ATP的主要利用者，例如在添加藜芦碱以防止电压激活钠通道失活后(尼科尔斯和斯科特，1980年). veratridine对葡萄糖/丙酮酸介质中皮层突触体呼吸的影响如所示图5A、B呼吸广泛增强，同时细胞外酸化增加(图5C、D). 呼吸刺激对寡霉素敏感(图5B)与ATP转换增强相一致，但低聚肌球蛋白不敏感呼吸略有增加，可能是由于钙的比率增加²⁺由于线粒体Na的激活，质子回路驱动的穿过内膜的循环⁺/钙²⁺胞质钠增加引起的交换⁺(尼科尔斯和斯科特1980).

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图5

Veratridine增强线粒体ATP转换，抑制FCCP刺激的呼吸（A）（在有寡霉素的情况下）（B）。在15mM葡萄糖+10mM丙酮酸存在下培养突触体。如有指示，添加veratridine（Vt，0-5μM）、寡霉素（oligomycin，4μg/ml）和FCCP（4μM）。在含有葡萄糖但不含丙酮酸的培养基中，速率与基础呼吸有关。（C，D）介质中相应的相对酸化率。

在葡萄糖加丙酮酸盐培养基中，无论是否存在寡霉素，veratridine刺激的呼吸都伴随着FCCP刺激的呼吸的相互下降(图5A、B). Veratridine也导致了细胞外酸化率的平行下降(图5C、D)，表明糖酵解受限。与此一致，在纯葡萄糖培养基中添加藜芦苷导致FCCP刺激的呼吸几乎完全丧失（数据未显示）。

纯生物能量基础上添加Na⁺/K（K）⁺-据预测，ATP酶抑制剂哇巴因在基本条件下通过泵抑制缓慢的ATP水解，会导致呼吸减少。然而，在实际操作中，添加抑制剂后可以看到轻微的呼吸刺激(图6A)它对寡霉素敏感，因此是由于线粒体ATP周转增加。由于哇巴因诱导质膜去极化并允许细胞质钠⁺要升高，可能是由于胞吐的ATP需求和钠的增加⁺和钙²⁺线粒体内膜的循环超过了Na降低的ATP需求的补偿⁺/K（K）⁺-ATP酶。在寡霉素作用下的葡萄糖+丙酮酸培养基中，0.3mM哇巴因的存在将FCCP刺激的呼吸从860±146%降低到592±38%。更引人注目的是，哇巴因几乎完全消除了纯葡萄糖培养基中的剩余呼吸能力（数据未显示）。因此，哇巴因类似于藜芦碱，可以抑制糖酵解。因此，另一种可能的解释是，哇巴因增加了呼吸，作为糖酵解对ATP转换贡献减少的补偿。

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图6

哇巴因和4-氨基吡啶增强寡粘菌素敏感性呼吸。在15mM葡萄糖+10mM丙酮酸存在下培养突触体。（A） 在指定位置添加哇巴因（0.3mM，开放符号），然后添加寡霉素（4μg/ml）。（B） 在指定位置添加4-氨基吡啶（50μM，方形或1mM，圆形），然后添加寡霉素（4μg/ml）。在含有葡萄糖但不含丙酮酸的培养基中，速率与基础呼吸有关。

重复动作电位激发的生物能量需求

维拉曲定是钠通道失活的一种使用依赖性抑制剂，其在这种和其他突触体制剂中的有效性表明，在低钾条件下，终末经历缓慢的自发动作电位放电⁺中等。钾通道抑制剂4-氨基吡啶（4AP）大大提高了这些自发动作电位的频率，并已被广泛用于孤立突触体的研究，以诱导一系列重复动作电位来研究递质胞吐的机制和调节(Tibbs等人，1989年a). 除了胞吐和内吞的ATP需求外，4AP还应增加突触体ATP需求，因为在动作电位启动的钙和钠进入后，末端恢复离子稳态。50μM和1mM 4AP的浓度分别诱导皮层突触体（Tibbs）的半最大和最大谷氨酸分泌等。1989年），并在这里使用这些浓度，产生分级呼吸反应(图6B). 与veratridine和ouabain相比，4AP没有显著降低FCCP刺激的呼吸（对照组为903±66%，在1mM 4AP存在的情况下为819±41%）。

备用呼吸容量

大脑中与衰老相关的变化的一个重要方面是，功能的丧失是渐进的，这暗示着随机的突触失败。对暴露于能量密集型兴奋毒性应激的培养神经元的研究支持了一种假设，即在这种情况下，神经元细胞死亡主要是由“能量危机”引起的(Nicholls等人，2007年). 因此，通过对就地线粒体(Vesce等人，2005年)，复合I限制(Yadava和Nicholls，2007年)，“轻度解偶联”（试图减少氧化应激，Johnson-Cadwell等人，2007年)或氧-葡萄糖剥夺（Vesce和Nicholls，未发表）都会加剧谷氨酸诱导的细胞死亡，并伴随着神经元培养物中多余呼吸能力的耗尽。目前将剩余呼吸容量的群体呼吸研究与膜电位的单突触体荧光监测相结合，可以测试突触前生物能量衰竭的随机模型。特别是，我们建议采用简单的初始实验，在基础条件下，在寡霉素的存在下，在仔细滴定原核细胞后，量化呼吸，作为评估线粒体功能障碍这一相当模糊的概念的初始定量方法。底物存在时的基础呼吸驱动质子泄漏和ATP合成。添加寡霉素可消除通过ATP合成酶重新进入质子的现象，而呼吸的减少则提供了在添加抑制剂之前用于驱动ATP合成的质子电流的最小估计值。然而，由于质子泄漏与电压有关(尼科尔斯，1974年;Nobes等人，1990年)伴随ATP合酶抑制的线粒体超极化将增强质子泄漏，从而导致在正常亚最大“状态3½”ATP产生条件下，对ATP合成质子电流的估计不足，对质子泄漏的估计过高（即状态3和状态4之间的中间）。

电子传递链复合物的损伤和抑制是许多神经退行性疾病的核心(比尔，2005年). 神经元线粒体受到可变ATP需求的影响，主要取决于其激发模式，电子传输链具有足够的能力向ATP合成酶供应质子至关重要。我们创造了“备用呼吸能力”一词，以量化这种最大不受控制的呼吸和初始基础呼吸之间的差异(Nicholls等人，2007年)并提出，即使在最大生理或病理生理刺激的条件下，也要保持一些多余的呼吸能力，这是决定神经元存活的主要因素。

突触体生物能量学

本研究使我们能够利用常规氧电极呼吸测定法获得的大鼠或豚鼠大脑皮层突触体重现和扩展早期发现。先前已经显示了外源丙酮酸与葡萄糖协同作用的能力(Kauppinen和Nicholls，1986年a). 在本研究中，这是由于在整个突触体群体中存在可变超极化（取决于给定突触体的糖酵解能力）。这意味着37°C培养的突触体中的糖酵解缓慢恶化，如Δψ的逐渐减少所示_米这种代谢限制可以通过加入外源丙酮酸来缓解。然而，丙酮酸不能阻止FCCP后最大呼吸的缓慢下降（参见。图2)这表明线粒体呼吸在ATP来源（糖酵解失败和未偶联线粒体）严重受损的末端不会无限期持续。在早期的研究中(Kauppinen和Nicholls，1986年c)据报道，氰化物抑制呼吸后，糖酵解逐渐失败，ATP耗竭。

二氯乙酸不能进一步激活小鼠突触体中的丙酮酸脱氢酶，苹果酸-天冬氨酸穿梭在糖酵解过程中NADH再氧化细胞质中的作用，以及钠引起的呼吸增加⁺藜芦碱激活通道与早期研究一致(尼科尔斯和斯科特，1980年,Kauppinen和Nicholls，1986a年,Kauppinen等人，1987年). 虽然我们引入了4AP作为在突触体中诱导自发动作电位的手段(Tibbs等人，1989年a,b条)外内吞作用的能量需求和离子内稳态的重建以前还没有文献报道。值得注意的是，相对于3.5mM KCl培养基中的“静止”突触体，1mM 4AP诱导的放电至少使突触体ATP周转翻一番(图6).

无论有无寡霉素，veratridine都会降低FCCP所能达到的最大呼吸(图5). 维拉曲定通过阻止钠发挥作用⁺通道脱敏，从而增加钠⁺Na的自行车和ATP利用⁺泵，正如寡粘蛋白敏感呼吸增加所反映的那样。同时提高细胞质钠⁺通过逆转兴奋性氨基酸载体，导致谷氨酸和天冬氨酸从细胞质大量流出(印章和阿玛拉1999). 鉴于苹果酸/天冬氨酸穿梭的重要性，AOAA的抑制作用证明了这一点(图4B)，细胞质天冬氨酸耗竭可能会限制穿梭物的活性，从而限制糖酵解。然而，外源性天冬氨酸的应用并没有挽救多余的呼吸能力（数据未显示）。

在葡萄糖加丙酮酸介质中，哇巴因与藜芦碱类似，降低了剩余呼吸容量。在这两种情况下，这种作用在仅含葡萄糖的培养基中被放大，表明糖酵解受到抑制。事实上，有报道称，在藜芦碱存在的情况下，大鼠脑突触体中存在糖酵解的时间依赖性抑制，并归因于ATP耗竭导致己糖激酶的抑制(埃雷琴斯卡等。1996). 然而，与veratridine相反，哇巴因保留突触体ATP(尼科尔斯和斯科特，1980年)因此，ATP耗竭不太可能完全解释呼吸下降。veratridine和ouabain的一个共同特征是两者都会触发[Na的持续增加⁺]_我同时[K进一步减少⁺]_我即质膜Na崩溃⁺-电化学电位。隔离的神经末梢被剥夺了生理神经营养因子，有人认为这可能是葡萄糖和谷氨酸转运的时间依赖性下降的基础，而神经营养因子可以阻止这种下降(Guo和Mattson 2000). 最后，突触体的内部K值较低⁺隔离程序产生的浓度(Nicholls&Scott 1980年). 自K起⁺是丙酮酸激酶的必要辅因子(Kachmar&Boyer 1953年)由于细胞溶质K的丢失而抑制这种酶⁺是抑制糖酵解的另一种解释。

这项工作得到了NIH（P01 AG025901）和凯克基金会“为什么衰老会导致疾病”的资助。