如果其中一个基因的突变与生存能力兼容，但同时突变两个基因会导致死亡，则这两个基因被视为“综合致死”。这种机制最好描述为功能基因的丧失，但也存在于功能基因的获得。例如，如果基因B过度表达，基因A可能成为生存所必需的。这种机制对于开发靶向抗癌化合物具有潜在的吸引力，这种化合物可以特异性杀死肿瘤细胞，同时使正常细胞存活(1–三). 然而，在人类肿瘤中合成致命致癌基因的例子几乎没有文献记载。
神经母细胞瘤是起源于发育中的交感神经系统的胚胎性肿瘤，尽管神经母细胞癌的发病率较低，但却是儿童癌症相关死亡的第二大原因(4,5). MYCN基因在20-30%的神经母细胞瘤肿瘤中扩增，扩增与不良预后密切相关。MYC基因是驱动细胞无限制生长和增殖的强大致癌基因。它们作为转录因子发挥作用，导致参与多种肿瘤发生途径的基因上调或抑制。最近，MYC基因也被证明通过mRNA翻译控制蛋白质表达，并直接调节DNA复制(6–9). 除了在致癌中的功能外，MYC基因也被描述为如果在非MYC扩增的细胞中过度表达，则可诱导细胞凋亡(10). 这可能表明MYC癌基因的扩增需要特定的遗传背景，并且可能与其他（癌）基因存在合成致死关系。
细胞周期畸变发生在所有肿瘤中，并且已经开发出许多抑制特定细胞周期激酶的靶向化合物(11,12). 这些努力基于这样一种观点，即以癌细胞中异常的细胞周期检查点为目标可能导致肿瘤生长抑制和细胞死亡(13). 最近的几项研究表明，大多数细胞周期激酶对细胞在体内外的存活并不重要(14). 细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）被认为是S期进展的关键调节因子，因此被评估为抗癌药物靶点。然而，Tetsu等人表明，在几种癌症细胞类型中抑制CDK2不会导致细胞死亡，Santamaria等人表明，CDK1可以补偿小鼠CDK2的基因消融(15,16). 这些发现严重降低了对CDK2作为治疗靶点的乐观态度。
在神经母细胞瘤中发现了几个涉及G1调节基因的细胞周期异常。细胞周期蛋白D1和CDK4基因扩增发生频率较低，发现CDK6突变使p16结合失活(17–19). 细胞周期蛋白D1在约75%的神经母细胞瘤肿瘤中过度表达。神经母细胞瘤细胞株中G1调节基因CDK4或cyclin D1的抑制导致G1检查点的恢复和随后的神经元分化(20). 由于缺乏凋亡反应，这些G1调节基因作为治疗靶点的吸引力降低。
在本文中，我们表明，抑制CDK2控制的细胞周期的下一步会导致大规模细胞死亡。这与之前关于CDK2冗余的研究结果形成了鲜明对比。使用各种基于siRNA的技术抑制CDK2在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系中显示出凋亡反应，而在MYCN单拷贝细胞中没有。我们可以显示出一种综合致死关系，其中CDK2沉默仅在MYCN存在的情况下导致细胞死亡。这种致命反应取决于功能性p53。我们表明，这种依赖MYCN的P53介导的凋亡也可以由CDK2抑制的小分子诱导。
结果
沉默CDK2对MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞是致命的。
为了确定细胞周期中的新药靶点，我们分析了88例神经母细胞瘤肿瘤细胞周期调控基因的mRNA表达模式。CDK2高表达与不良预后密切相关(图S1A类). 为了评估CDK2作为一个潜在的药物靶点，我们通过瞬时siRNA沉默了人神经母细胞瘤细胞株中CDK2的表达。令人惊讶的是，CDK2敲低导致3个MYCN扩增的神经母细胞癌细胞株中强烈诱导凋亡，而不影响1个MYCN单拷贝神经母细胞瘤细胞系和指数增长的成纤维细胞(A类). 为了进一步分析CDK2敲除的影响，我们将诱导shRNA构建物引入神经母细胞瘤细胞系IMR32（靶向CDK2编码区的另一序列）并进行时间过程分析。CDK2 shRNA的诱导导致CDK2特异性pRb磷酸化降低，随后PARP和caspase 3断裂(B类). E2F报告结构显示E2F活性显著降低(C类). FACS分析显示，48小时后G1停止，随后G1以下分数增加，表明细胞凋亡(图S1B类). CDK2 shRNA诱导后的细胞计数证实了CDK2沉默后48、72和96小时的进行性细胞死亡(D类)最终导致6天后100%的细胞死亡。我们使用慢病毒介导的shRNA靶向第三个CDK2 mRNA序列，但现在位于非编码3′UTR。IMR32中CDK2的沉默再次导致PARP和caspase 3的断裂，表明细胞凋亡(E类). 为了挽救这种表型，我们在神经母细胞瘤细胞系IMR32中体外过度表达CDK2编码区。使用靶向3′UTR的慢病毒编码shRNA在该细胞系中沉默CDK2，沉默内源性CDK2而非异位CDK2(图S1C类和D类). 这些细胞没有显示凋亡反应，因此排除了CDK2 shRNA的非靶向效应(F类和图S1E类). 我们的发现与之前关于CDK2抑制后缺乏凋亡的报道形成鲜明对比(16). 我们假设CDK2沉默后的凋亡反应取决于细胞系统的遗传背景，因为我们仅在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞中观察到凋亡，而在MYCN单拷贝神经母细胞癌细胞系和指数增长的成纤维细胞中没有观察到凋亡(A类).
CDK2抑制导致MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞凋亡。(A类)以CDK2或GFP为对照，用21-bp双链siRNA转染3个MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系、1个MYCN单拷贝细胞系和指数生长的成纤维细胞。在48小时时采集样本，并对CDK2、PARP和β-肌动蛋白进行免疫印迹。PARP抗体识别总PARP和裂解PARP（低带）。PARP的裂解表明凋亡途径激活。在采集细胞之前拍摄了光学显微镜照片。(B类)在Tet操作员控制的CMV启动子下，用pcDNA6/TR载体和含有CDK2 shRNA的载体转染神经母细胞瘤细胞系IMR32，产生可诱导细胞系IMR 32-pcDNA6-CDK2sh。在时间点0添加多西环素以诱导CDK2 shRNA表达并沉默CDK2。在不同时间点采集细胞，并对CDK2、苏氨酸821-磷酸化pRb、PARP、裂解caspase 3和β-肌动蛋白进行免疫印迹。PARP和caspase 3的裂解表明凋亡途径激活。(C类)将含有6个E2F结合位点的萤火虫荧光素酶载体与肾小球荧光素酶载体一起转染到IMR32-pcDNA6-CDK2sh中。转染后，添加强力霉素。对照样品未经处理。在48和72小时后进行双荧光素酶分析，以测量相对E2F活性。(D类)IMR32-pcDNA6-CDK2sh和衍生出该细胞系的IMR32-pcDNA6在存在或不存在强力霉素的情况下生长。在不同的时间点采集细胞，并使用Coulter计数器进行计数。(E类)用编码CDK2 shRNA或对照shRNA的慢病毒载体感染IMR32细胞，并在感染后的不同时间点收获。对样本进行CDK2、PARP、裂解caspase 3和β-actin免疫印迹。(F类)在IMR32中转染CDK2 cDNA表达载体和空载体。使用新霉素选择分离克隆，并选择1个空载体对照克隆和2个表达异位CDK2的克隆进行进一步分析。用增加浓度的慢病毒CDK2 shRNA处理细胞。还包括未处理（NT）的样品。对样品进行CDK2、PARP和β-肌动蛋白的免疫印迹。
CDK2抑制后的细胞凋亡依赖于MYCN的过度表达。
为了测试CDK2抑制诱导的凋亡是否依赖于MYCN，我们使用了SHEP-21N，一种MYCN-单拷贝神经母细胞瘤细胞系，该细胞系含有可通过添加四环素（Tet-off系统）抑制的MYCN_转基因。瞬时CDK2 siRNA沉默CDK2在MYCN表达时诱导细胞凋亡，而在MYCN沉默时则不诱导细胞凋亡( A类和B类). 为了进一步验证MYCN依赖性，我们在MYCN-扩增的神经母细胞瘤细胞（IMR32）中进行了测试。在IMR32中使用瞬时siRNA沉默CDK2导致大量凋亡，可以通过使用瞬时siRNA沉默MYCN来挽救这些凋亡( C类和D类). 这些发现表明CDK2沉默后的细胞凋亡确实依赖于MYCN的过度表达。
神经母细胞瘤中CDK2抑制后的细胞凋亡依赖于MYCN的过度表达。(A类)SHEP-21N是一种在Tet阻遏物下含有MYCN的神经母细胞瘤细胞系，用四环素和不四环素培养3天，然后在6孔板上以6×10的密度重新镀膜4每孔细胞数，用CDK2 siRNA或对照siRNA处理。在siRNA处理48小时后收集细胞，并对CDK2、MYCN、PARP、裂解caspase 3和β-actin进行免疫印迹。(B类)在采集细胞之前拍摄了光学显微镜照片。与所有对照样品相比，MYCN开启和CDK2关闭设置的样品显示细胞密度降低了>94%。(C类)IMR32是一种具有MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系，以2.5×10的密度接种在6厘米的平板上5每个平板上的细胞数，并用对照siRNA、CDK2 siRNA、MYCN siRNA或MYCN和CDK2 siRNA的组合处理。48小时后收集细胞，并对CDK2、MYCN、PARP、裂解半胱天冬酶3和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(D类)在采集细胞之前拍摄了光学显微镜照片。与所有对照样品相比，MYCN开启和CDK2关闭设置的样品的细胞密度降低了85%以上。
CDK2沉默后的凋亡诱导是由P53通路介导的。
为了确定参与这种凋亡反应的基因，我们在诱导CDK2沉默后的不同时间点生成IMR32的Affymetrix mRNA表达谱。此外，我们在单用瞬时CDK2 siRNA、单用MYCN siRNA或CDK2和MYCN-siRNA的组合治疗后生成IMR32的Affymetrix图谱。我们选择了在CDK2沉默后上调，但在联合CDK2与MYCN-沉默后未上调的基因（参见方法用于选择程序）。这些严格的标准确定了与Rac GTPase信号传导（CYFIP2）、过氧化物信号传导（SESN2）、自噬（DRAM）、凋亡信号传导（TRAIL-R2、FDXR）和组蛋白H2B家族成员（HIST1H2B）有关的基因。引人注目的是，在6个调控最强烈的基因中，有5个是P53的直接转录靶基因(A类). 这表明P53参与了凋亡反应(21–25). P53 mRNA水平是恒定的（Affymetrix），但在MYCN过度表达细胞中诱导和短暂的CDK2沉默后，P53蛋白水平增加( B类和C类). 这表明P53蛋白水平通过稳定上调。此外，在CDK2沉默后，P53表现出核移位(D类). 最后，为了分析凋亡反应中的P53依赖性，我们使用慢病毒沉默P53和CDK2。沉默P53确实可以阻止CDK2沉默的细胞中PARP的分裂(E类).
MYCN扩增细胞中CDK2沉默后的凋亡是P53介导的。(A类)在添加强力霉素后的不同时间点，采集IMR32-pcDNA6-CDK2sh和IMR32-pcDNA6用于RNA分离。此外，使用GFP siRNA、CDK2 siRNA、MYCN siRNA或CDK2和MYCN-siRNA在IMR32中进行瞬时siRNA实验。转染后24和48小时分离RNA。对诱导型shRNA时程实验和瞬时siRNA实验进行Affymetrix微阵列分析。Affymetrix的表达水平显示了6个调控最强烈的基因。（请参见材料和方法用于选择过程。）(B类)IMR32-pcDNA6-CDK2sh以2.5×10的密度播种在6-cm的板上5每个培养皿中培养细胞，用多西环素处理诱导CDK2 shRNA。在不同时间点采集细胞。对样品进行CDK2、P53和β-肌动蛋白的免疫印迹。(C类)IMR32以2.5×10的密度播种在6厘米的板上5每个平板上的细胞数，并用对照siRNA、CDK2 siRNA、MYCN siRNA或MYCN和CDK2 siRNA的组合处理。48小时后收集细胞，并对CDK2、MYCN、P53和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(D类)IMR32按以下说明播种C类用CDK2 siRNA或GFP siRNA处理，转染48小时后收获。分离出总裂解物和核裂解物。总裂解产物用CDK2和P53染色，核裂解产物用P53和组蛋白H3染色，以进行负荷控制。(E类)IMR32以1×10的密度播种在6孔板上5细胞每孔，感染编码CDK2 shRNA、P53 shRNA或两种shRNA的慢病毒载体。将非编码SHC002对照shRNA添加到仅使用CDK2或P53 shRNA的实验中，并在对照样品中添加，使其与每个样品中的shRNA数量相等。此外，还包括一个未被转染的对照(o（o）). 48小时后采集蛋白质，并对CDK2、P53、PARP和β-肌动蛋白进行免疫印迹。
CDK2靶向药物Roscovitine诱导MYCN-Amplified细胞P53依赖性凋亡。
为了将这些发现扩展到临床应用的化合物，我们使用了CDK2抑制小分子。Roscovitine是一种CDK抑制剂，与CDK2 ATP结合囊和IC具有相对较高的亲和力50微摩尔范围内的能级(26,27). 在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系IMR32中，罗考维汀可抑制CDK2特异性pRb磷酸化，并产生强烈的凋亡反应，随后P53稳定，PARP和caspase 3裂解(A类). 与siRNA介导的沉默后CDK2蛋白水平的缓慢下降相比，快速反应（暴露于化合物后6小时）可能反映了小分子对CDK2激酶活性的直接影响。我们测定了罗斯科汀LC50IMR32和SHEP-21N的水平（分别为3.0μM和7.5μM），并使用这些浓度比较MYCN开启和关闭设置中的灵敏度。在这两种细胞系中，当MYCN表达时，罗斯科维汀诱导细胞死亡，但当MYCN沉默时，却没有诱导细胞死亡( C类和D类和图S4A类和B类).
抑制CDK2的小分子罗西维汀诱导过表达MYCN的细胞中P53介导的凋亡。(A类)IMR32以5×10的密度播种在6厘米的板上5每个平板上的细胞数，并用越来越高浓度的罗斯科维汀处理。处理6小时后收集细胞。对样品进行苏氨酸821磷酸化pRb、P53、PARP、裂解caspase 3和β-actin的免疫印迹。(B类)SHEP-21-N是一种在Tet阻遏物下含有MYCN的神经母细胞瘤细胞系，在加入或不加入四环素的情况下培养3天，然后以2.5×10的密度在6cm的平板上重新镀膜5每个板的细胞数。24小时后，将罗斯科汀添加到7.5μM的最终浓度。开始治疗后24小时，收集细胞，并对MYCN、PARP和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(C类)在采集细胞之前拍摄了光学显微镜照片。与所有对照样品相比，MYCN表达和roscovitine处理的样品显示细胞密度下降>91%。
讨论
尽管之前有报道称CDK2在各种肿瘤和非恶性细胞系统中存在冗余，但我们发现MYCN过度表达的神经母细胞瘤亚群对CDK2有强烈依赖性。非靶向RNA干扰效应不能解释这些发现，因为我们使用了3种不同的RNAi技术和不同的靶序列，得到了相同的结果，并且我们可以通过过度表达CDK2来挽救表型。此外，使用可诱导CDK2 shRNA对IMR32细胞的时间进程进行Affymetrix分析表明，干扰素应答相关基因没有上调(28). 最后，抑制CDK2的小分子也会产生类似的表型效应。我们表明，这些发现是CDK2和过度表达的MYCN之间综合致死关系的结果。对凋亡反应病因的研究表明，P53在不同水平上都有强烈的诱导作用，但我们不能排除其他信号转导途径的参与。这种凋亡反应似乎不太可能涉及E2F，因为神经母细胞瘤细胞系中CDK4或cyclin D1沉默后E2F转录活性的下调不会导致凋亡，但会导致神经元分化(20). 我们没有测试过表达MYC（c-MYC）癌基因的细胞是否对CDK2抑制表现出类似的敏感性，但Goga等人表明，过表达MYC的细胞对CDK1/2抑制剂更敏感(29). 这表明CDK2和MYCN之间的综合致死关系也可能存在于CDK2与MYC之间。
我们的结果表明，CDK2抑制剂可能是p53野生型背景下潜在的MYCN选择性癌症治疗药物。大多数神经母细胞瘤原发肿瘤具有完整和功能性的P53(30,31). MYCN基因在20-25%的肿瘤中扩增，与预后极差有关。这两个特征使神经母细胞瘤成为体内验证和后续小分子CDK2抑制剂临床试验的良好候选肿瘤。
材料和方法
患者材料和细胞系。
用于Affymetrix微阵列分析的神经母细胞瘤肿瘤小组包含88个神经母细胞癌样本。所有样本均来自未治疗患者的原发肿瘤。材料在手术过程中获得，并立即在液氮中冷冻。细胞系在添加10%FBS、20 mM L-谷氨酰胺、10 U/mL青霉素和10μg/mL链霉素的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养。细胞保持在37°C，5%CO2有关这些细胞系的主要参考文献，请参见Cheng等人(32). 通过转染4μg pCMV-neo-Bam或pCMV-neo-Bam CDK2表达载体（Addgene）生成过表达CDK2的IMR32亚克隆和空载体对照(33)根据制造商的方案使用Lipofectamin 2000。使用300μg/mL新霉素选择克隆。
化合物。
从Sigma中获得Roscovitine，并在DMSO中稀释至30 mM的浓度。细胞用不同浓度的罗索维汀处理，二甲基亚砜浓度恒定为0.5%。
西方印迹法。
将神经母细胞瘤细胞系置于冰上，用PBS洗涤两次。细胞在20%甘油、4%十二烷基硫酸钠、100 mM Tris·HCl、pH 6.8的缓冲液中溶解。蛋白质通过RC-DC蛋白质分析（Bio-Rad）定量。通过参考SDS/PAGE凝胶的Bio-Rad考马斯染色控制负荷。在10%SDS/PAGE凝胶上分离裂解物，并在转移膜（Millipore）上电印迹。使用标准程序进行封闭和孵化(20). 以下抗体被用作主要抗体：CDK2克隆55小鼠单克隆（BD Bioscience）、PARP克隆4C10-5小鼠单克隆物（BD PharMinen）、pRb（pT821）（Biosource）、P53克隆DO-7小鼠单克隆体（Labvision）、Cleaved caspase 3（Asp-175）兔多克隆物（Cell Signaling Technology）、MYCN小鼠单抗（PharMineng）、，组蛋白H3小鼠单克隆抗体（Upstate）和肌动蛋白C2小鼠单克隆疫苗（Santa Cruz）。与次级羊抗鼠或抗兔辣根过氧化物酶连接抗体（Amersham）孵育后，使用ECL检测试剂盒（Amersham）观察蛋白质。使用2%十二烷基硫酸钠、100 mMβ-巯基乙醇、62.5 mM Tris-HCl、pH 6.7缓冲液从膜上剥离抗体。
细胞计数和FACS分析。
所有细胞计数实验进行两次。通过胰蛋白酶化收集细胞并在2mL培养基中稀释。在100μL TritonX-100/皂苷中稀释两份100μL培养基样品，并添加10 mL同位素II。使用犁计数器（贝克曼-库尔特）对每个样品进行重复计数。对于FACS（荧光激活细胞分选机）分析，细胞在6孔板中生长24小时，然后如前所述转染siRNA。在转染后的指定时间点，用3.4 mM柠檬酸三钠、0.1%Triton X-100溶液（含50μg/μL碘化丙啶）溶解细胞。培养1小时后，用FACS分析细胞核的DNA含量。每个样品共有30000个细胞核被计数。使用WinMDI 2.8版测定细胞周期分布和凋亡亚G1组分。
交易激活分析。
在反式激活分析中使用了以下荧光素酶结构体：pGL3 TATAbasic-6xE2F[pGL3包含一个TATA盒和6个E2F结合位点，之前对E2F选择性进行了测试，这是荷兰癌症研究所R.Bernards的一份礼物(36)]和pRL-CMV（CMV启动子下的Renilla荧光素酶载体）。细胞在6孔板中培养24小时，并根据制造商的方案使用脂质体进行转染。将一微克pGL3TATABaasic-6xE2F载体与0.8μg pRL-CMV载体一起转染。在48和72小时后使用Promega双荧光素酶报告基因测定系统进行双荧光素酶测定。对于每个分析，进行3个单独的实验。
RNA分离和Affymetrix微阵列分析。
根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取神经母细胞瘤细胞系和肿瘤的总RNA。使用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度，并使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技）上的RNA 6000 Nano分析测定质量。对于Affymetrix微阵列分析，根据制造商的协议（Affymmetrix Inc.）进行RNA片段化、标记、HG-U133 Plus 2.0微阵列杂交和扫描。表达数据在Affymetrix的GCOS程序中使用MAS5.0算法进行归一化。目标强度设置为100（α1=0.04和α2.006）。如果有1个以上的探针集可用于1个基因，则考虑到探针集正确定位在感兴趣的基因上，选择表达最高的探针集。为了在CDK2沉默后选择与凋亡相关的基因，我们使用了以下程序。首先，在所有时间进程和瞬态实验中，选择在至少1个时间点中表现出最低表达100（MASS 5.0）的基因。接下来，选择至少1个上调的基因2在可诱导CDK2 shRNA实验的生物三倍体中，与时间点0相比，时间点48的对数倍。调节超过0.5的基因2对照时间进程中的对数折叠被排除在外。使用瞬态siRNA实验进一步分析这些基因。只有当基因上调超过1个时，才包括在内2与GFP对照样品相比，CDK2 siRNA样品在时间点24的对数倍。最后，如果基因上调超过0.5，则将其排除在外2CDK2和MYCN siRNA实验中的对数倍。
Q-PCR。
使用1μg TRIzol分离RNA与125 pM寡核苷酸T12引物、0.5 mM dNTPs、2 mM MgCl进行cDNA合成2、RT-buffer（Invitrogen）和100 U SuperScript II（Invit罗gen），总体积为25μL。使用一微升该cDNA进行Q-PCR。使用实时iCycler PCR平台（Bio-Rad）结合嵌入荧光染料SYBR Green I进行基于荧光的动态实时PCR。根据制造商的说明使用IQ SYBR GreenI Supermix（Bio-Read）。使用以下引物：β-actin正向5′-CCCAGACAATGAAGATCAA-3′和反向5′-ACCAGCTGGAAGGC-3′；CDK2编码序列正向5′-ACCAGCTCTCCGGATCTT-3′和反向5′-CATCCTGGAAGAAGGTGA-3′；CDK2 3′UTR正向5′-CCCTTTCCAGGATGTGA-3′和反向5′-TGAGTCCAAGG-3′。
