美国国家科学院院刊。2000年7月18日；97(15): 8386–8391.
转录因子EPAS-1/低氧诱导因子2α在血管重塑中起重要作用
加拿大安大略省伦敦市西安大略大学儿科和生物化学系圣约瑟夫健康中心劳森研究所N6A 4V2
编辑：Steven L.McKnight，德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心，2000年5月19日批准
摘要
我们通过基因靶向研究了碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子EPAS-1/低氧诱导因子2α在血管发育中的作用。在ICR/129 Sv的远交背景中，超过一半的突变体表现出不同程度的血管紊乱，通常在卵黄囊中，并死亡子宫内胚胎期（E）9.5和E13.5之间。在直接来源于EPAS-1型−/−胚胎干细胞（因此在129 Sv背景下），所有胚胎在卵黄囊和胚胎本身都出现严重的血管缺陷，并在E9.5和E12.5之间死亡。正常血管是由血管生成形成的，但在发育过程中，它们要么融合不正确，要么无法组装成更大的血管。我们的结果表明，EPAS-1在血管生成后阶段发挥着重要作用，并且是将初级血管网络重塑为成熟层次模式所必需的。
功能性血管系统的形成需要一套复杂的发育程序的成功执行。首先，血管通道通过血管生成从非内皮祖细胞产生，这一过程需要分化、增殖、迁移和细胞/细胞相互作用。一旦形成，一些通常较小的初级血管通道就会相互作用，形成大血管。这种相互作用似乎相当特殊，因为通常只有特定位置的某些微血管子集会主动合并形成大血管，而其他微血管则保持其离散的小管结构。这一过程通常被称为血管重塑，将血管系统的形态从由大小均匀的小血管组成的形态重塑为显示大小血管层次的形态。因此，与血管生成和血管生成等其他过程一样，重塑是血管发育的一个关键方面。
已经发现了许多对血管发育很重要的成分。例如，血管内皮生长因子（VEGF/VEGF-A）(1,2)及其受体Flt-1（3,4）、Flk-1/KDR(5–7)，和神经毒素-1(8)在血管生成和血管生成中发挥重要作用(9–13). 其他重要的例子包括血管生成素(14–17)、Tie-1和Tie-2/Tek酪氨酸激酶(18–20)、VEGF-C及其主要受体Flt-4(21,22)，ephrin-B2及其受体Eph-B4(23,24).
最近，两种基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）-PAS转录因子ARNT-1(25,26)和低氧诱导因子1α(27–29)，已被证明在胚胎血管形成中发挥重要作用。缺乏这些蛋白质的小鼠胚胎出现血管扩张和融合并死亡子宫内bHLH-PAS蛋白EPAS-1（低氧诱导因子2α、HLF、HRF或MOP2）(30–34)与低氧诱导因子1α密切相关，与常见的异二聚体伴侣ARNT-1相互作用(35)，主要在内皮细胞中表达。然而，EPAS-1在血管发育中的作用仍然难以捉摸，尽管先前的研究已经证明它在调节儿茶酚胺稳态方面是必需的(36). 我们在这里报告，在我们独立生成的EPAS-1型在基因敲除小鼠中，有很大比例的纯合子突变体表现出出血，并且无法维持离散的血管管状结构或从较小的前体中组装较大的血管。这些观察结果表明，EPAS-1在控制血管重塑中起着重要作用。
材料和方法
DNA操纵。
407个基点EPAS-1型cDNA片段（核苷酸99–505）(30)用两个引物（AATGACAGCTGAGAAAAA和GAGTGAAGTCAAAGATGCTGGTGTGTC）从小鼠肺总RNA中通过逆转录-PCR生成，并从129 Sv基因组文库（Stratagene）中分离出一个基因组克隆。目标向量的构造如图所示。使用以下引物进行PCR基因分型：AGCTCAGAGCTGAGAGAGAGAAAA和CTTATGTCGAAGAGAGATGA，扩增174-bp的野生型等位基因；以及TGGCCACAACAACCATGGAACAGG和AAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA，扩增246-bp片段（图。C类). 检测EPAS-1型mRNA、引物AGGCCGACCAGAAAATGGA（外显子3）和GAGTGAAGTCAAAGATGTC（外显子4）用于扩增163-bp片段EPAS-1型cDNA或CTTCTATGGAGGCAGCATCCAACCACG和CAACAGGTAAGGCTCGACGAGAGGCGCGCGCCCC用于扩增633 bp的片段。后两个引物在小鼠基因上的确切位置未知，但它们对应于人类同源物中的外显子15和16(30).
目标EPAS-1型基因。(A类)目标构造。1.9千字节生态RI（右）/不适用I（N）片段用作5′臂和6.2-kbXmn公司I（X）碎片作为3′臂。同源重组导致IRES替换了大多数外显子2（E2）及其后的一个内含子区域（≈1.0 kb）-lacZ公司和PGK-Neo序列。生态RV（RV）消化产生野生型等位基因的6.5kb片段和靶向等位基因4.8kb片段，这两个片段都与外部探针（bar）杂交。(B类)杂合子交配胚胎DNA样本的Southern杂交。(C类)通过PCR进行基因分型。(D类)反转录–E11.5胚胎总RNA的PCR分析，用于表达EPAS-1型通过β-肌动蛋白的反转录-PCR标准化每个反应的模板用量和PCR效率。
胚胎干（ES）细胞培养。
靶向构建体由不是我通过电穿孔将其导入R1 ES细胞（多伦多大学A.Nagy和J.Rossant赠送）。根据Wurst协议，选择并扩增了对G418和更昔洛韦具有双重抗性的ES细胞克隆，并分离基因组DNA进行Southern印迹等。(37). 要为选择EPAS-1型−/−ES细胞，EPAS-1型+/−ES细胞在2.0 mg/ml的G418（2×10）存在下培养9天5每10-cm板的电池（GIBCO/BRL）。通过Southern印迹法对存活的菌落进行扩增、复制和筛选。
老鼠。
嵌合体小鼠由在体外靶向ES细胞聚集(EPAS-1型+/−)与ICR morulae（Harlan Sprague-Dawley）合作(38). 雄性嵌合体与ICR雌性嵌合体交配，以获得目标等位基因的种系传递。杂合子由5-溴-4-氯-3-吲哚β鉴定-d日-尾标本的半乳糖苷染色，因为IRES-lacZ公司尽管其在胚胎中的表达水平较低，但在尾部血管中强烈表达。Southern印迹法证实了该方法的有效性。胚胎的基因分型采用Southern印迹法或PCR。
按照Nagy的描述，生产了完全ES细胞衍生的胚胎等。(39). 简言之，野生型胚胎在两个细胞阶段进行电融合，从而产生四倍体。每个单细胞四倍体胚胎在过夜培养后发育成四个细胞，并用于与ES细胞聚集。聚集物在过夜孵化后形成囊胚，并转移到假孕雌性的子宫中。在我们手中，每个聚集实验都有生成0到10个胚胎的能力。因此，对+/-和−/-ES细胞进行了多次聚集实验，并报告了累积数量。
组织学。
抗CD31（Mec13.3，PharMinen）的免疫组织化学染色基本上按照Sato的描述进行等。(19). 简单地说，胚胎用4%多聚甲醛在4°C下固定，并用PBS冲洗。固定胚胎用5%H处理2O（运行）2用PBS冲洗，并在PBSMT-NGS中培养过夜（PBS含有3%速溶奶、0.1%Triton X-100和2%正常山羊血清）。然后将胚胎用Mec13.3在PBSMT-NGS中孵育过夜，冲洗，用山羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶孵育，并在广泛清洗后进行颜色发育。对染色的胚胎和卵黄囊膜进行拍照并进行石蜡切片处理。切片切割至5μm，并用耐核红复染。
结果
在中生成空突变EPAS-1型基因。
为了在EPAS-1型基因，我们删除了大部分第二外显子和大约1.0kb的相邻内含子（图。A类)，破坏DNA结合和异二聚体形成所必需的基本结构域和螺旋-环-螺旋结构域。第一外显子只编码九个氨基酸残基，没有已知功能，因此不太可能具有部分EPAS-1活性。从两个不同的ES细胞克隆中获得了携带目标等位基因的独立生殖系。示例如图所示。 B类和C类.确定是否有任何隐秘EPAS-1型mRNA输入EPAS-1型−/−突变体（从此缩写为−/−），我们对从胚胎期（E）11.5天胚胎中提取的总RNA进行了仔细控制的逆转录-PCR分析。为了确保这些实验的可靠性，使用了两对独立的引物，对应于目标序列下游的两个不同区域。这两组引物都表明−/−样本中没有信号，图中显示了一个例子。D类因此，隐秘EPAS-1型如果有mRNA，PCR检测不到其水平。
纯合子突变体出血。
我们将雄性嵌合体培育到ICR雌性，以获得目标等位基因的种系传递，从而产生F1129 Sv/ICR背景下的后代。在F中2杂合子交配产生的后代，约有三分之一的−/−小鼠出生时是活的，但它们比正常的窝友小得多，寿命相对较短，通常只有几周。其余三分之二的纯合者死亡子宫内在E9.5和E17.5的不同阶段进行检查时，−/−胚胎分为四类：(我)死亡和严重坏死（完全苍白或甚至部分吸收）；(ii（ii）)死亡但尚未坏死（或仅轻微坏死），通常出血；(三)存活但出血；和(iv（四）)无明显缺陷。不同种类突变体的相对丰度在不同阶段有所不同，E9.5的死亡胚胎数量最低（29个−/−胚胎中有三个，约为10%）。到受精后15.5天，−/−胚胎要么属于类我或iv（四）表明胚胎致死发生早于E15.5。事实上，大约60%的−/−胚胎在E13.5或之前死亡，胚胎死亡高峰发生在E11.5。图。显示了一些类的示例ii（ii）和三突变体，表现为卵黄囊和胚胎本身出血。
出血EPAS-1型−/−突变体。(A类和B类)图11.5。(A类)小鼠孕体的正常形态。(B类)卵黄囊膜呈苍白，很可能是因为解剖前大量出血，而不是造血失败。这由中显示的数据支持D类和F类都是在出血时拍的。(G公司–J型)胚胎在E10.0解剖。图中所示的室友我和J型似乎在早期被捕，大约在E9.5。有趣的是，在卵黄囊腔的底部发现了血细胞池（白色箭头），这表明血管泄漏。(我)在原始底面翻转后立即拍照。(J型)翻转15分钟后拍摄（黑色箭头表示参考点）。血池已经扩散，表明这些细胞确实位于血管外。（钢筋英寸A类,B类,E类、和F类，2毫米；C类,D类、和G公司–J型，600微米）
129 Sv/ICR背景下−/−胚胎的细微血管结构紊乱。
为了更详细地分析血管发育，我们用抗CD31抗体免疫组织化学染色观察血管(40). [lacZ公司插入物在E11.5表达较弱，可能是因为IRES元件的翻译起始效率低，尽管在后期表达水平逐渐增加。然而，lacZ公司表达主要局限于内皮细胞，这与田的发现一致等。(30)和Ema等。(32).] 图。显示了E11.5卵黄囊膜血管异常的示例。然而，即使在最严重的情况下，这种异常在整体水平上也是非常细微的（对比图。 A类和B类，其中样本B类来自严重出血的卵黄囊）。然而，如二维切片所示，许多内皮细胞排列错误，以牺牲完整的环状结构为代价形成延长的线条（图。 D类和F类)表明卵黄囊中的内皮层延长，而不是管状结构。参与这种无组织结构的内皮细胞的比例因卵黄囊的不同而异，最高约为三分之一。中度出血的卵黄囊膜在整体和组织切片水平上都显示出正常的血管模式（图。 G公司和H（H）)可能是因为病变的数量太少而无法检测。
用抗CD31抗体对正常和突变卵黄囊膜（均在E11.5）进行免疫组织化学染色。(A类)正常的卵黄囊膜，显示出高度组织化的维管树模式。(B类)从整体水平来看，严重出血突变株的血管模式与正常对照组略有不同。(C类–F类)抗CD31染色标本的组织学切片。(D类和F类)在大多数严重的突变株中，大约三分之一的内皮细胞形成延伸的内皮层，但没有适当的管腔结构。(G公司和H（H）)从整体水平和组织切片上观察，中度出血突变体没有明显的血管紊乱。（棒材：A类,B类、和G公司600微米；C类–F类和H（H），100μm）
在E9.5，只有约10%的突变株出血。当用抗CD31免疫组织化学染色检查时，即使是出血最严重的卵黄囊在整体水平上也显示出基本正常的血管模式（图。 A类和B类). 但在组织学切片中，估计出血卵黄囊中有2-10%的血管（从一个胚胎到另一个胚胎不等）出现紊乱（图。 D类和F类). 偶尔发现切片中含有未密封的内皮细胞（图。F类)血液很容易从中流出。E9.5时血管缺陷的频率和严重程度降低，表明这可能是血管缺陷开始发展的最早阶段。事实上，当E8.5检查超过30个−/−胚胎时，没有一个胚胎有血管缺陷，表明血管生成是正常的。
E9.5时轻微的血管紊乱和出血。(A类和B类)卵黄囊膜的整体抗CD31染色，其中B类取自一个类似于图中所示的胚胎。 我和J型组织切片中发现零星病变(D类和F类). 图中显示的内皮细胞很长的衬里D类在正常对照组的切片中未发现。(E类和F类)在发生主动重塑以形成较大血管的区域，如F类偶尔仅在突变体中发现，使血细胞泄漏（箭头所示）。请注意，附近区域没有组织撕裂或开裂的迹象，认为开口不是由于标本制备不当造成的。（棒材：A类和B类500微米；C类–F类，50微米）
我们还观察到新解剖的突变体胚胎本身出血，但正常的同卵双胞胎没有出血（图。 E类和F类). 然而，我们无法在血管中发现明显的裂缝。一种可能是胚胎本身的血管病变很少，很难找到。然而，他们可能对血液内容物的泄漏负责。
直接来源于胚胎的严重血管缺陷EPAS-1型−/−ES细胞。
我们推测，血管缺陷的变异是由单个胚胎中不相同的菌株背景引起的，因为它们起源于远交系。为了进一步解决EPAS-1型在血管发育中，我们利用“四倍体聚集”技术在129 Sv背景下构建胚胎(39). 在这种技术中，ES细胞（或其敲除衍生物）被聚集在体外具有四倍体桑椹胚。由于四倍体细胞不能对胚胎本身和卵黄囊的中胚层衍生成分做出贡献，因此整个胚胎和卵黄囊中胚层衍生组织，例如血管系统，仅由ES细胞贡献（129 Sv背景）。
为了制造这样的−/−胚胎，我们首先从两个独立的+/−ES细胞系（数据未显示）分离出−/–ES细胞，并且使用−/-和+/–ES细胞进行聚集。超过50人EPAS-1−/−经分析，约20%的胚胎在E9.5发育成严重紊乱的血管系统。在相邻血管相互融合形成内皮层内衬的大空腔的瞬间状态下发现（图。). 到E11.5，−/−胚胎要么已经死亡，要么如果还活着，至少有中度出血。然而，在这个阶段，卵黄囊的血管系统通常会严重紊乱（图。). 到E12.5，所有−/−胚胎都死于血管缺陷。在使用+/-细胞的聚集实验中，在E10.5和出生之间检查了15个胚胎，没有一个胚胎有血管缺陷，在分析阶段都是可行的。对于+/-和−/−ES细胞，由于技术原因，大量聚集物没有成功胚胎发生。然而，这些不能存活的“胚胎”（已从上述报告的数字中排除）很容易辨认，因为它们很早就死亡了（在植入前或植入后早期），并经历了快速解体，在进行解剖时留下了空的蜕膜。因此，技术限制没有干扰我们的分析。
129 Sv株背景突变胚胎卵黄囊膜中的严重血管紊乱。(A类)公式9.5。大约20%的E9.5突变体显示出这种模式。(B类)图11.5。来自+/−ES细胞系的血管模式与图中所示的相同。A类和4A类和在这里没有重复。(C类和D类)组织切片。大约一半的E9.5卵黄囊膜表现出紊乱。(C类)细长的内皮衬里和增大的血管管腔（与图相比。C类). (D类)内脏扩大似乎是由相邻血管合并引起的。箭头表示血管合并的部位。（棒材：A类和B类500微米；C类150微米；和D类，75微米）
在129 Sv背景下，除卵黄囊外，还观察到胚胎内部的血管缺陷。在正常胚胎中，从E9.5开始，初级血管床经历广泛的重塑，形成不同大小的血管。然而，在−/−胚胎中，这种层次结构在某些器官中没有发育。相反，小血管的聚集持续存在。这种缺陷在E11.5的头部和眼睛中最为明显（图。). 然而，其他血管，如背主动脉和体间动脉，似乎正常（未显示），表明EPAS-1是血管子集发育所必需的。
129Sv背景下胚胎本身的血管缺陷（E11.5）。(A类)+/-胚胎神经周血管系统的一个区域，显示出有组织的层次结构，其中大血管分叉为小血管。(B类)−/−胚胎中的神经周血管未能进化成由大小血管组成的血管树。(C类和D类)发育中的眼睛也观察到类似的缺陷。（棒材：300μm）
讨论
发育中胚胎的新生血管系统是一个动态结构，通过持续的血管重塑和分支血管生成，逐渐演化为血管树。虽然许多血管生成调节因子已知，但血管重塑的过程却知之甚少。本文证明了bHLH-PAS转录因子EPAS-1在血管重塑中起重要作用。在EPAS-1缺陷的胚胎中，光学囊泡和头部组织中的小血管无法相互结合形成较大的血管。在卵黄囊中，较小的血管相互融合；然而，它们在没有适当调节的情况下这样做，常常导致广泛内皮层的形成。此外，当在−/−卵黄囊中形成大血管时，它们有时无法完全密封，留下血液内容物泄漏的开口。因此，在EPAS-1突变小鼠中，虽然血管发生正常，但血管形成后，血管之间似乎存在不适当的相互作用，导致异常的血管重塑。到目前为止，我们在细胞水平上的分析表明，内皮细胞存活、增殖、分化和血管平滑肌细胞的补充没有缺陷（数据未显示）。因此，作为一个未来的方向，研究内皮细胞迁移、细胞/细胞和细胞/基质相互作用的潜在变化将特别有意义。
有趣的是，在一项独立的基因靶向实验中，田等。(36)发现EPAS-1对儿茶酚胺稳态而非血管化很重要。突变表型的差异不太可能是由结构设计引起的，因为两组都破坏了bHLH结构域，并证明突变为空等位基因。因此，我们认为这种差异是由于使用不同的小鼠品系造成的。此外，两组使用的ES细胞之间的细微差异也可能导致明显的分歧。这是可能的，因为获得ES细胞的129 Sv小鼠包括几个密切相关的菌株，所以不同的ES细胞系可能具有不同的菌株背景。
导致表型差异的机制尚不明确，但以下讨论了几种可能性。在一种情况下，不同菌株之间可能存在功能与EPAS-1重叠的蛋白质。潜在重叠函数研究的一个有趣候选是低氧诱导因子α，它与EPAS-1具有广泛的序列同源性。此外，与EPAS-1水平的功能重叠不同，EPAS-1调控的下游基因水平也可能发生功能重叠。通过类比，不受EPAS-1直接控制但位于下游甚至其他信号通路中的基因也可能改变突变表型。
田等。(36)在EPAS-1缺陷的胚胎中，儿茶酚胺稳态存在缺陷，表现为心率减慢（25%），并在E12.5和E16.5之间死亡。然而，通过给母亲的饮食补充d日,我-苏氨酸-3,4-二羟基苯基丝氨酸（DOPS），去甲肾上腺素的前体。获救的幼崽在出生后24小时内死亡，因为母体循环中缺乏持续的DOPS供应。在我们的研究中，超过一半的突变胚胎在E13.5之前死于血管缺陷。活产婴儿存活数周，出生后24小时内未观察到自然死亡。然而，当母亲喂食DOPS时，11只活产−/−幼崽中有3只（来自所有基因型的84只幼崽）在24小时内死亡。这一发现表明，我们的一些突变体也存在儿茶酚胺水平降低的问题，尽管我们无法直接证明心率的统计学显著降低，可能是因为这种缺陷很少发生。
我们的数据和田的数据加在一起等。(36)表明EPAS-1可能至少有两个不同的作用：一个调节儿茶酚胺的产生，另一个调节血管重塑。然而，这些功能的相对重要性可能取决于应变背景。在ICR/129 Sv远交背景下，尽管大多数突变株都有血管缺陷，但其严重程度在单个胚胎之间差异很大。另一方面，即使是那些活着出生的人，各种器官的血管也紊乱（将在其他地方描述），这解释了矮子表型。EPAS-1在血管发育中起着重要作用，这一点得到了完全−/−ES细胞衍生胚胎实验的进一步支持。这些突变体中的血管缺陷大大放大，所有突变体在E12.5或之前死亡。
EPAS-1的表达和功能调控是复杂的。EPAS-1的蛋白质水平由缺氧诱导蛋白质稳定的氧张力调节(41)蛋白质的功能部分由其氧化还原状态控制(42). 在我们的基因敲除小鼠中，我们证明没有功能性EPAS-1 mRNA模板，这表明这些蛋白水平调控的复杂性不应影响我们的突变表型，因为蛋白质就其本身而言无法生成。
以前曾报道过几个靶基因，其在培养细胞中的表达被EPAS-1激活，包括血管内皮生长因子、，flk-1（flk-1）、和第2层(30,41,43). 然而，我们无法发现这些基因表达的变化（未发表的数据），这表明EPAS-1可能调节新靶分子的表达。EPAS-1基因敲除小鼠血管缺陷的表征为鉴定此类基因提供了机会，并为研究血管发育的控制机制开辟了一条途径。
致谢
这项工作得到了加拿大医学研究委员会的支持。G.-H.F.是加拿大医学研究委员会奖学金的获得者。
缩写
| bHLH公司 | 基本螺旋–回路–螺旋 |
| 锿 | 胚胎干 |
| E类n个 | 胚胎期n个 |
脚注
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
印刷前在线发布的文章：程序。国家。阿卡德。科学。美国，10.1073/pnas.140087397。
文章和出版日期见www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.140087397
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