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美国人类遗传学杂志。2009年6月12日；84(6): 760–770.
数字对象标识：10.1016/j.ajhg.2009.05.002
预防性维修识别码：PMC2694977型
PMID：19481194

硫酸肝素蛋白聚糖Glypican 6的突变(通用产品6)损伤软骨内骨化并导致隐性Omodyplasia

Ana Belinda Campos-Xavier女士,1 丹妮尔·马丁内特,2 贝特曼,三 丹·贝鲁乔,三 林恩·罗利,三 Tiong Yang Tan公司,4 Alica Baxová,5 卡尔·亨利克·古斯塔夫森,6 Zvi U.博罗乔维茨,7 A.米切尔酒店,8 希拉·昂格,9,11 雅克·贝克曼,2,10 劳雷安·米塔兹,1 戴安娜·鲍尔豪森,1 安德烈亚·苏佩蒂·福加,11 拉维·萨瓦里拉扬,4和路易莎·博纳菲1,∗
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补充资料

摘要

糖蛋白聚糖是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的膜结合硫酸乙酰肝素（HS）蛋白聚糖家族。虽然假设它们调节HS结合生长因子的活性，但它们的生物学作用仅被部分了解。glypcans参与发育形态发生和生长调节果蝇属突变体和由glypican 3突变引起的多发畸形的人类过度生长综合征（Simpson-Golabi-Behmel综合征）。我们现在报告常染色体隐性异型增生，这是一种以短肢矮小、颅面部畸形和可变发育延迟为特征的遗传病，定位于13号染色体（13q31.1-q32.2），由点突变或glypican 6中较大的基因组重排引起(GPC6型). 所有突变都会导致GPC6蛋白的截短，并消除HS结合位点和GPI膜相关结构域，因此可以预测功能的丧失。显微解剖小鼠生长板的表达研究显示Gpc6公司在增殖的软骨细胞中。因此，通用产品6似乎在软骨内骨化和骨骼生长中起着以前不被怀疑的作用，其功能的丧失导致短肢表型。

介绍

硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）参与多种生物过程，如生长因子信号传导、细胞粘附、细胞膜转运和肿瘤转移。1–3Glypicans是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面热休克蛋白家族，具有高度保守的三维结构。4–6它们在发育过程中生长因子信号和形态梯度的调节中起着关键作用。4,7,8中的突变dally（分裂异常延迟），哺乳动物glypicans 3和5的直系同源(GPC3类[MIM公司300037]和通用程序5[最小602446])英寸果蝇属，表明glypicans参与细胞命运和分裂的控制。9唯一已知的由球状蛋白核心蛋白突变引起的人类疾病是Simpson-Golabi-Behmel综合征（MIM）312870)，一种X染色体连锁的生长过度/畸形综合征，由GPC3类10偶尔通过删除聚集GPC3类和GPC4基因（MIM300168).11

自体隐性异型增生（MIM）258315)是一种遗传性疾病，其特征是四肢缩短、面部畸形和严重身材矮小。发育不良一词来源于“omos”，希腊语中的“肱骨”一词，Maroteaux首先将其应用于一系列患有综合征身材矮小和肱骨发育不良的患者。12一种仅累及上肢的常染色体显性遗传疾病后来被认为是一种单独的疾病13（最小164745)与隐性形式不同。到目前为止，已报告22例隐性发育不良。14骨骼特征包括近端肢体缩短、长管状骨远端变细、近端桡尺分离和桡骨头前外侧脱位。面部特征包括额头隆起、扁平鼻梁、低位耳朵、长人中、鼻孔前倾和额头毛细血管瘤。不同的发现包括隐睾、疝气、先天性心脏缺陷和认知延迟。14,15成人身高在132至144厘米之间（−7.0至−5.5标准差）。15

我们报道，同源异型增生定位于13号染色体，是由基因突变的纯合子引起的通用产品6（MIM604404)，编码最新描述的人类glypican基因。16

材料和方法

患者和样本

我们调查了五个家庭的八名患者和两种受孕产品(图1)另一名隔离患者（患者9）。除患者9外，所有患者之前都有报道：家族1为吉普赛人血统17; 系列218和319阿拉伯-穆斯林语（黎巴嫩）；家族4，之前由Elcioglu等人报道。（案例3和案例4）15，是瑞典语；第五家是阿拉伯穆斯林。20家族1、2、3和5都有血缘关系。患者9是领养儿童；亲生父母既没有临床信息也没有生物材料。产前24周超声检查发现根茎性肢体缩短；她出生于38周胎龄，出生体重3118克（-0.41标准偏差），身长41厘米（-4.76标准偏差）和头围35厘米（+0.44标准偏差）。心脏超声检查正常。4岁时，她身高84厘米（-4.38标准偏差），体重16.7公斤（+0.85标准偏差）；她表现出明显的运动迟缓，但认知发育正常。

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五个Omodyplasia家系13号染色体的家系和单倍型

方形：与单个族中的链接兼容的区域。灰色：近亲家庭受影响个体的纯合子共同区域。

所有受影响的个体均符合诊断发育异常的临床和放射学标准。运动迟缓是所有患者的特征，但只有1号和5号患者存在精神发育迟缓。其他临床异常包括隐睾（患者2、5、6、7和8）和先天性心脏缺陷（患者2）。患者4（其临床病史和描述见Di Luca和Mitchell19，无放射图像）和患者9（之前未描述）的临床和放射检查结果报告于图2.

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卵巢发育不良的临床和X线特征

（A和B）女性患者4例，年龄16个月。注意股骨和肱骨缩短，干骺端轻度变细和远端变宽；胫骨也短，但受影响较小。还应注意桡尺骨分离和肢端骨骼元素的相对保存。

（C–E）女性患者9名，年龄5岁。注意肱骨明显短，呈“棒状”；股骨缩短；桡尺侧分离；以及相对的肢端保存。

（F和G）患者9出生时（F）和1岁时（G）的临床特征。注意耳后旋转，轻度小颌畸形，持续性毛细血管瘤，根茎状肢体明显缩短。

血样取自除第一个未受累胎儿和第2家族中已故双胞胎外的所有个体(图1). 根据标准技术从外周血白细胞中纯化基因组DNA。从2号家庭未受影响的父母、3号家庭受影响的孩子（患者4）和4号家庭未受影响的父亲那里获得皮肤活检。成纤维细胞在含有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基（GIBCO）中培养，并在37°C和5%CO中培养2通过RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）从成纤维细胞中提取总RNA，并将其保存在−80°C。

所有个人都获得了适当的书面知情同意书。该研究方案得到了瑞士洛桑大学伦理委员会和以色列国家赫尔辛基委员会的批准。

联系研究

我们使用微卫星标记（linkage Mapping Set V2.5；Applied Biosystems）以平均10 cM的距离对所有五个家族进行了全基因组连锁扫描。我们使用GeneHunter版本2.1_r4_beta进行了多点连锁分析。疾病基因频率设置为0.001，假设为完全外显的常染色体隐性遗传模式。一个独特的感兴趣区域通过十个额外的Genethon和deCODE标记进行了优化。

突变分析

通用程序5（MIM602446)以及通用产品6这两个基因都在受试者的基因组DNA中进行了研究。

用于PCR扩增通用产品6，寡核苷酸引物是在通用产品6序列（ENSG00000183098），靶向所有9个外显子和3′-和5′-UTR区域。所有引物均由Microsynth定制合成，其序列报告于表S1用PCR扩增整个编码序列（包括内含子-外显子边界）和UTR区域。放大子尺寸和碎片特定的退火温度报告于表S1为了验证扩增产物，我们使用了2%琼脂糖凝胶电泳。用蒙太奇PCRμ96（Millipore）标准方案纯化扩增片段。扩增产物根据标准程序（BigDye terminator V1.1 Cycle Sequenting Kit，Applied Biosystems）在自动测序仪ABI 3100-Avant（Applied biosystem）上用荧光双脱氧终止剂法直接测序分析。

通用产品6用RT-PCR从成纤维细胞总RNA中扩增cDNA。根据GenBank序列通用产品6mRNA（登录号NM_005708号)，根据制造商的说明，通过一步反向转录PCR（SuperScript一步RT-PCR with Platinum Taq，Invitrogen）扩增了五个不同大小的重叠片段。cDNA特异性引物（Microsynth）、扩增子的长度和每个PCR的退火温度在表S2cDNA扩增子在3%琼脂糖凝胶NuSieve GTG琼脂糖（BioConcept）上迁移；当获得单一条带时，根据蒙太奇PCRμ96（Millipore）标准方案直接纯化PCR产物；当凝胶上出现双条带时，根据S.N.A.P.凝胶纯化试剂盒（Invitrogen）的标准方案，切除并纯化每条带。用于测序的引物与用于扩增的引物相同。为了防止非传感介导的mRNA衰变（NMD）对含有提前终止密码子（PTC）的转录物的潜在降解，21我们用环己酰亚胺（CHx）（Sigma-Aldrich）处理来自2号家族父母、4号患者、4号家族父亲和一个对照的成纤维细胞（80%–90%融合）。我们通过在75 cm内培养80%-90%融合细胞来处理培养细胞2提取RNA之前，用100μg/ml CHx烧瓶放置6小时。培养后，用5 ml磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，将烧瓶放在冰上，通过刮取收集细胞。将细胞转移到15 ml的新试管中，在室温下以1500 rpm离心10 min。仔细去除上清液后，将试管放在冰上，按照标准方案进行RNA分离。cDNA测序的程序与基因组DNA的程序相同。

比较基因组杂交阵列

采用比较基因组杂交阵列（aCGH）和安捷伦人类基因组CGH微阵列试剂盒244KA对患者3-9和患者3-6的父母进行研究。aCGH平台是一个基于60-mer寡核苷酸的微阵列，允许全基因组调查和分辨率为～20kb的基因组畸变的分子分析。根据安捷伦提供的方案进行标记和杂交。简而言之，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN）消化和纯化后，使用安捷伦基因组DNA标记试剂盒Plus通过随机启动Cy3-UTP或Cy5-dUTP来标记测试和参考DNA（1.3μg）。在标记反应后，使用Microcon YM-30过滤器（Millipore）浓缩单独标记的试验样品和参考样品，然后合并。探针变性并与Cot-1 DNA预退火后，在65°C下进行杂交，旋转40小时。安捷伦寡糖CGH洗涤液完成四个步骤：在室温下洗涤缓冲液1 5分钟，在37°C下洗涤缓冲溶液2 1分钟，在室温下乙腈漂洗1分钟，在安捷伦的稳定和干燥溶液中，在室温下放置30秒。所有载玻片均在安捷伦DNA微阵列扫描仪上进行扫描。数据通过安捷伦特征提取软件v9.1获得。根据随后翻译为hg18的hg17基因组组装（2004年5月发布），使用CGH分析软件（v3.4.27）获得了图形概览（2006年3月）。在基因组变异数据库中检查拷贝数变异；所有被研究的患者都被视为白人，因为阿拉伯穆斯林没有关于拷贝数变异的具体数据。

短荧光片段的定量多重PCR

为了用不同的方法确认aCGH在所有家族成员中检测到的基因组缺失和重复，我们使用了前面描述的短荧光片段定量多重PCR（QMPSF）方法。22–25我们设计了寡核苷酸引物对，用于扩增与9个基因对应的短外显子荧光片段通用产品6外显子构建多重PCR；它们的序列以及扩增子的大小在表S3多重反应还包含一对内部控制引物，该引物扩增了DSCR1型基因（MIM602917). 每对正向引物均用6-FAM荧光标记5′。

将荧光多重PCR产物（1.2μl）与18μl甲酰胺和0.3μl尺寸标准500 LIZ（GeneScan 500 LIZ尺寸标准，Applied Biosystems）混合，然后在60°C的ABI Prism 310遗传分析仪上用POP4聚合物（Applied biosystem）分离。根据大小标准，将患者和对照DNA的荧光图谱叠加后，使用Genescan 3.7软件（Applied Biosystems）对结果进行分析。然后将配置文件标准化为DSCR1型峰值强度。然后，DSCR1号机组-目视比较相应扩增子的归一化峰值水平。扩增片段的正常双拷贝数显示为完全重叠的峰面积。杂合外显子缺失表现为相应峰值高度（约50%）降低2倍，而纯合外显基因缺失则表现为无峰值。杂合外显子重复表现为1.5（约30%–50%）的峰值大小增加。

基因组断点的排序

为了确定缺失的确切长度并确定其断点，我们采用了一种基于包含重叠公共引物序列的一系列内含子片段的基因组扩增的策略：每个扩增子的正向引物序列在倒置的5′-3′方向上是互补的，前一个扩增子的反向引物序列(图S1). 根据序列ENSG00000183098（染色体13:92677711–93853948），在重组aCGH探针限定的内含子区域设计引物。所有核苷酸引物（Microsynth）均可根据要求提供。在GeneAmp PCR系统9700（Applied Biosystems）中，通过触碰PCR在患者及其父母以及两名对照个体中扩增所有片段。循环条件可根据要求提供。我们使用2%琼脂糖凝胶电泳来验证患者和对照组中的扩增。对于在家族2、3、5和患者9中发现的缺失，缺失中包含了一定数量的片段，至少部分包含在缺失中，并且当控制DNA正确扩增时，未能从纯合子先证者的DNA中扩增。然后，我们使用上一个扩增片段的反向引物的互补序列（缺失5′）作为正向引物，并使用下一个扩增片段的正向引物的互补序列（缺失3′）作为反向引物，扩增出包含断点的单个扩增子(图S1). 包含删除断点的最后一个放大器(表S4)按照蒙太奇PCRμ96（Millipore）标准程序进行纯化，并使用与扩增所用引物相同的引物进行测序。如上所述进行测序反应以进行基因组DNA分析。对于家族4，我们通过QMPSF扩增患者和父母中的所有片段，以检测那些峰值大小增加了1.5倍并且包含重复起点和终点的片段(图S1). 由于技术原因，复制断点没有直接排序。包含每次重排断点的扩增子的引物序列报告于表S4.

注：已确定的序列变异和突变是根据人类基因组变异学会的建议命名的。根据通用产品6cDNA参考序列NM_005708号对于核苷酸编号，ATG翻译起始位点的A被用作位置+1。对于氨基酸编号，GPC6蛋白的起始蛋氨酸用作位置1。用于命名断点的基因组序列编号以Ensemble参考序列ENSG00000183098的核苷酸+1开始（对应于13号染色体上的NCBI核苷酸92677111）。

Glypican 6在小鼠生长板中表达的研究

定量逆转录酶聚合酶链式反应

如前所述，从2周龄小鼠的股骨中提取并扩增增殖区、前增生区和肥大区的RNA。26用随机六聚体和转录高纯度cDNA合成试剂盒（Roche）在20μl反应中反向转录每个成熟区（100 ng）的RNA。使用通用探针库寡聚物（Roche）和LightCycler 480探针主试剂盒（罗氏）进行定量PCR。在LightCycler 480II实时PCR仪器（Roche）上用1 ng cDNA以10μl的反应进行PCR反应。数据被归一化为看家基因线粒体ATP合成酶(Atp5b)，我们已经显示了在整个生长板中以一致的水平表达（数据未显示）。所有样品均一式三份，并在从两只小鼠显微解剖的生长板软骨区上重复实验。

免疫荧光

死亡后立即采集2周龄野生型小鼠的胫骨，将其解剖并快速冷冻在含有液氮冷却异戊烷的OCT化合物中，并储存在−80°C下。将连续9μm冠状冰冻切片收集在超霜玻璃载玻片上，风干1小时。切片在100%甲醇中固定10分钟。在含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中进行免疫染色。glypican 6抗体（目录号AF1053，R&D Systems）的使用浓度为15μg/ml，抗X型胶原抗体（由R.Wilson博士善意提供）的使用稀释度为1:1000。胶原X被用作肥大区软骨细胞的标记物。用与Alexa Fluor 488（驴抗羊IgG绿色）或594（驴抗兔IgG红色）（分子探针，尤金，or）结合的次级抗体检测一级抗体结合，稀释比例为1:1000。将载玻片安装在氟试剂（Calbiochem）中，并在奥林巴斯IX70显微镜上进行检查。

结果

隐性卵巢发育不良映射到13号染色体

最初的连锁图谱筛选显示了两个LOD评分为阳性的区域，一个在18号染色体上（18q12.2–q21.2，7cM，最大LOD评分2.31），另一个在13号染色体上（13q31.1–q32.2，15.7cM，LOD评分3.2）。然而，只有13号染色体上的区间在近亲父母的患者中显示出一个共同的纯合子区域，因此被选择用于进一步筛查。用10个额外标记进行精细定位证实了连锁，并将该区域缩小至4.5 cM，两侧为D13S265（89.3 Mb）和D13S167（93.8 Mb），在D13S886位点θ=0时LOD得分最大值Zmax=4.0(图1). 根据国家生物技术信息中心网站的搜索，这个4.5兆位长的区域包含15个基因。通用程序5和通用产品6根据生长因子在发育过程中参与细胞生长控制和分化的协同受体功能，首次被认为是可能的候选基因。

GPC6突变导致Omodyplasia

直接测序通用程序5编码区、内含子-外显子边界以及5′和3′UTR区域在受影响个体中未发现任何突变。

分子研究通用产品6包括基因组直接测序、aCGH研究、QMPSF、基因组断点分析以及cDNA扩增和测序。所有发现的突变总结如下图3和图4; 重排的aCGH探针和每次重排的基因组断点在表1.

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通用产品6在家族2、3、4和5以及患者9中用不同方法检测到突变

（A） 患者3、4、7和9（纯合子缺失）和患者5（杂合子重复）的aCGH结果。

（B） 一名先证者和2、3、4和5号家庭（未显示其他兄弟姐妹的数据）以及9号患者的父母的QMPSF结果。对照DNA中不同外显子的峰值以蓝色显示，而患者和父母的DNA扩增的峰值以绿色（家族2、3、5和患者9）或红色（家族4）显示。在家族2中，外显子4（E4）的峰值显示，与对照组相比，父母的外显子强度降低了2倍（杂合缺失），而先证者没有外显子（纯合缺失）。在家族3中，与外显子5和6相对应的峰值（E5和E6）显示，与对照组相比，父母的强度降低了2倍（杂合缺失），先证者则没有（纯合缺失）；由于空间原因，未显示控制外显子的峰值。在家系4中，外显子4（E4）的峰值显示父亲和先证者的强度增加了2倍（杂合重复），并且与母亲的对照组重叠。在家系5中，与外显子3相对应的峰值显示，与对照组相比，父母的强度降低了2倍（杂合缺失），而先证者则没有（纯合缺失）。在患者9中，外显子3（E3）的峰值缺失（纯合子缺失），而对照外显子（E7）的峰值与对照峰值重叠。

（C） 断点测序结果：在家族2中，IVS3和IVS4被包含外显子4的基因组缺失截断；在两个内含子序列之间的断点插入19bp。在家族3中，IVS4和IVS6被包含外显子5和6的基因组缺失截断；在两个内含子序列之间的断点插入3bp。在家族5中，IVS2和IVS3被包含外显子3的基因组缺失截断；在两个内含子序列之间的断点插入9bp。在患者9中，IVS2和IVS3被包含外显子3的基因组缺失截断。本文所示扩增子的引物和基因组位置在表S4在家系4中，用QMPSF绘制基因组重复的边界：片段IVS3-A和IVS4-D分别位于重复的5′和3′；IVS3-B和IVS4-C表现出增强的扩增，表明至少有一个引物位于重排中（另见表S4).

（D） cDNA测序结果：第2家族第4外显子缺失；第3家族第5、6外显子缺失；第4外显子在第4家族中出现两次。

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的摘要通用产品6研究患者的基因和蛋白质结构突变

（A） 基因组和蛋白质结构GPC6型基因。所提议的蛋白质结构域由所有蛋白聚糖共享。SP-唾液酸肽；CRD-富含半胱氨酸结构域；GAG-肝素硫酸酯（HS）糖基化位点；GPI-糖磷脂酰-肌醇结合位点，将球蛋白聚糖固定在质膜上。

（B） 异型增生患者基因组突变示意图。

表1

基因组重排导致卵巢发育不良：与基因组重排相关的aCGH探针，对卵巢发育的影响通用产品6基因与基因组断点的定位

患者（家属）aCGH探针一（重新排列5′）
aCGH探头一（重新排列3′）
上次正常检测重新安排中的第一个重新安排对的影响通用产品6基因重新排列中的最后一个首次正常检测基因组断点b条
3 (2)A_16_P19915562A_16_P19915577删除10个探针（66492 bp）第4外显子缺失A_16_P19915750A_16_P40055309g.770152_836646电话66495
4 (3)甲_16_P40055823A_16_P19916323删除14个探针（99317 bp）外显子5和6的缺失A_16_P40056128A_16_P19916617g.1026129_1125444电话99316
5和6（4）A_16_P19915593A_16_P199156104个重复探针（26-27 kb）外显子4的重复甲_16_P02838707A_16_P19915685784663至811908之间
7和8（5）甲_16_P02838121甲_16_P19914778删除12个探针（89632 bp）外显子3缺失A_16_P19915025甲_16_P19915064g.514476_604107电话89632
9A_16_P02837882甲_16_P02837902删除36个探针（257017 bp）外显子3缺失甲_16_P19915147A_16_P19915180g.376472_6633489电话257018
一安捷伦人类基因组CGH微阵列试剂盒244KA。
b条用于命名断点的基因组序列的编号从Ensembl参考序列ENSG00000183098的核苷酸+1开始（对应于13号染色体上的NCBI核苷酸92677111）。

在家族1中，受影响个体（患者1和患者2）外显子4的单碱基缺失为纯合子（c.778 delC）；预计这种缺失会导致从密码子260开始的移码，并导致PTC（p.Leu260Phe英尺X4）。父母和未受影响的兄弟姐妹是突变的杂合子。

在家族2中，尽管父母和对照DNA扩增良好，但受影响受试者（患者3和两个受孕产品）的DNA的基因组PCR反应未能扩增外显子4。先证者的其余基因组序列和父母的整个编码区（包括外显子4）与参考序列相同。这些结果在第二次PCR扩增中得到证实，表明第4外显子附近可能存在基因组缺失。aCGH研究显示受影响的活孩子（患者3）中存在纯合基因组缺失(图3A） 父本中相同缺失的杂合性。QMPSF确认删除(图3B） 在所有家庭成员中：外显子4对应的峰值显示父母中存在杂合性缺失，受影响个体（患者3和两个受孕产物）中存在纯合性缺失。所有其他的GPC6型外显子表现正常（数据未显示），证实该家族中的缺失边界在IVS3和IVS4内。缺失的基因组断点如所示表1此外，在所有携带突变的受试者中，在断点的交界处发现了另外19个碱基对(图3C） ；该序列在已发表的IVS3和IVS4基因组序列中不存在。从两个杂合亲本的成纤维细胞总RNA中进行RT-PCR扩增，得到两种产物，一种对应于野生型通用产品6序列（579 bp），另一个短片段（413 bp）(图S2A） 缺失外显子4（c.712-877 del）(图3D） ●●●●。杂合携带者野生型和突变型mRNA的相对丰度(图S2A） 以及增强功能(图S2B） 通过CHx处理的突变体mRNA扩增，可以防止mRNA在翻译过程中降解，这与突变体mRNA受到NMD的影响是一致的。删除的序列预测了PTC的帧外转换（p.Val238Met英尺X32）。

在家系3中，尽管其他家庭成员的DNA扩增良好，并且控制了DNA，但受影响儿童（患者4）的基因组DNA PCR反应未能在两个独立的PCR中扩增出外显子5和6。这些个体的其余基因组序列和未受影响家庭成员的整个编码区（包括外显子5和6）与参考序列相同。这些结果在第二次PCR扩增中得到证实，表明在外显子5和6周围可能存在基因组缺失。aCGH研究显示受影响儿童的基因组纯合子缺失(图3A） 以及亲本中的杂合缺失。对所有家庭成员进行QMPSF分析：结果表明，父母和未受影响的兄弟姐妹在外显子5和6缺失方面是杂合的，而先证者在相同缺失方面是纯合的(图3B） ●●●●。所有其他通用产品6外显子在所有个体中均表现正常（数据未显示），证实该家族的缺失边界在IVS4和IVS6内。缺失的基因组断点如所示表1对于家族2，在断点连接处的所有受试者中都发现了三个在已发表的基因组序列中不存在的额外碱基对(图3C） ●●●●。受影响患者成纤维细胞总RNA的RT-PCR扩增产生一个主要产物（660 bp图S2C） 对应于通用产品6cDNA序列缺失外显子5和6（c.878_1152 del）(图3D） ●●●●。CHx处理对NMD的抑制增加了突变转录物（660 bp）相对于对照mRNA（935 bp）的丰度(图S2D） ●●●●。删除的序列预示着向帧外转换的转移（p.Asp293Gly英尺X12）。RT-PCR还显示第二次扩增副产物为494 bp(图S2C） 其序列缺失了外显子4、5和6。三个外显子的缺失预测了一种内框但更短（408个氨基酸）的翻译产物，该产物缺乏GPC6核心蛋白球状构象所必需的大部分富含半胱氨酸的结构域。鉴于基因组序列中已证实存在外显子4（通过QMPSF和受影响患者和杂合子父母的断点测序可见），且NMD抑制缺乏增强作用(图S2D） ，该cDNA可能来源于外显子3到外显子7的一个效率较低的剪接。

在家系4中，受影响个体（患者5和6）及其母亲有杂合子单碱基替换（c.700C>T），导致外显子3发生无义突变（p.Arg234X）。通过对受影响和非受影响家庭成员的其他外显子和内含子-外显子边界（均扩增良好）进行直接测序，未发现基因组水平的突变。aCGH研究显示受影响儿童的基因组杂合重复(图3A） 在父亲身上。QMPSF分析证实了外显子4的杂合重复(图3B） 父亲和受影响的孩子；这种重复在母亲或未受影响的孩子身上并不存在。所有其他的通用产品6外显子在所有个体中均表现正常（数据未显示），证实该家族中重复的边界在IVS3和IVS4内。虽然复制的确切边界尚未确定，但复制的开始和结束都位于片段内，显示信号强度增加（约30%–50%）(图3C和表S1). 从父亲成纤维细胞中提取的总RNA的RT-PCR显示出单一扩增产物（579 bp）(图S2A） 其序列与野生型等位基因相对应。用CHx处理成纤维细胞后进行RT-PCR，可以识别与突变等位基因对应的第二个产物（745 bp）(图S2B） ●●●●。直接测序显示，正如预期的那样，第4外显子完全重复（c.712_877 dup）(图3D） ●●●●。这种复制导致在复制连接处产生帧外翻译产物，新的阅读帧以PTC终止（p.Asp293Gly英尺X46）。

在家系5中，受影响双胞胎（患者7和8）的DNA PCR反应未能在两个独立的PCR中扩增出外显子3，尽管其他家庭成员的DNA扩增良好，并且控制了DNA，这表明可能存在包含外显子的基因组缺失。这些个体的其余基因组序列和未受影响家庭成员的整个编码区（包括外显子3）与参考序列相同。对其中一对受累双胞胎进行的aCGH研究显示基因组纯合子缺失(图3A） ●●●●。QMPSF分析(图3B） 在所有家庭成员中进行，证实父母和一个未受影响的兄弟姐妹中存在杂合子缺失（II.4图1). 另一个未受影响的兄弟姐妹（II.1英寸图1)具有外显子3的正常图谱，因此遗传了两个野生型等位基因。与其他外显子相对应的所有峰值在所有个体中均正常（数据未显示），证实该家族中缺失的边界位于IVS2和IVS3内。缺失的基因组断点如所示表1对于家族2和家族3，在断点连接处的所有受试者中都发现了9个额外的bp（在已发表的基因组序列中不存在）(图3C） ●●●●。该删除预测了导致PTC的帧外翻译产品（p.Glu107Gly英尺X46）。

在患者9中，基因组PCR反应未能在两个独立的PCR中扩增外显子3，尽管对照组扩增良好，表明可能存在外显子缺失。aCGH研究显示基因组纯合子缺失(图3A） ●●●●。QMPSF确认删除(图3B） ●●●●。所有其他峰值通用产品6外显子正常扩增（数据未显示），证实缺失边界位于IVS2和IVS3内。缺失的基因组断点如所示表1，序列如所示图3C.删除预测了帧外翻译产品（p.Glu107GlyfsX46）。

Glypican 6在小鼠生长板中的表达研究

为了确定glypican 6在软骨内骨化过程中是否起作用，我们检测了小鼠生长板内相对mRNA表达水平。

对从微小软骨生长板亚区获得的总RNA进行定量RT-PCR显示Gpc6公司信息在增殖区表达最高，在前增生区和肥厚区显著降低(图5E） ●●●●。与增殖区相比，肥厚区的表达水平降低了50倍以上。这在蛋白质水平上得到了证实；免疫荧光显示Gpc6公司增殖区软骨细胞的表达(图5D） ●●●●。胶原蛋白X的定位(第10a1列)生长板肥厚区的表达(图5B和5E）用于确认软骨显微解剖的准确性。通过定量RT-PCR测定glypican家族其他成员生长板软骨中的表达模式(图S3). 这些glypicans在整个生长板中表达，在软骨肥大期间没有显示相同的差异表达模式。

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小鼠生长板中GPC6蛋白和mRNA的分析

（A） 2周龄小鼠生长板软骨的甲苯胺蓝染色切片，显示增殖区（PR）、前增生区（PH）和肥大区（HZ）软骨细胞的组织。免疫染色显示X型胶原（B）定位于PH和HZ，glypican 6表达（D）从PR和PH区到HZ中很少或没有表达的梯度。（C） 非免疫血清对照。（E） 定量RT-PCR检测Gpc6公司和第10a1列在来自两个生物复制品（#1和#2）的微切割软骨区中。Gpc6公司和第10a1列表达式被规范化为Atp5bmRNA通过比较CT型方法。

讨论

我们报告说，异型增生是由球状蛋白HSPG基因的隐性功能丧失突变引起的，通用产品6这一发现证实了glypicans在发育过程中的生长控制作用，正如果蝇属突变体磨磨蹭蹭的和德利9,27辛普森-戈拉比-贝梅尔综合征与GPC3类突变。10此外，我们的数据强调了GPC6型骨骼肢体生长。

在受异型增生影响的个体中发现的所有突变都预示着功能蛋白的缺失。家族2和家族4杂合携带者成纤维细胞中野生型和突变mRNA的相对丰度与突变mRNA受到NMD的影响一致。当逃避NMD并翻译时，所有突变都会破坏三维蛋白质结构，并且通常会消除多个高度保存的半胱氨酸残基。28所有预测的突变蛋白都会被截断，从而失去GPI和HS结合位点(图4)对于GPC6的假定功能至关重要。28,29我们发现，同源异型增生可由两种点突变引起，导致终止密码子突变和/或类似于基因组疾病的更大基因组重排30; 这些重排似乎不受低拷贝重复的介导，因为在缺失/重复连接处或一般在通用产品6基因。另外一种已知的由glypican基因突变引起的人类疾病是Simpson-Golabi-Behmel综合征；在这种疾病中，在GPC3类和大量的缺失是导致大量病例的原因。10, 31, 32类似于GPC3类重新安排，通用产品6突变发生在整个编码区，没有任何突变热点，包括一个或多个外显子。值得注意的是，基因组重排在两个glypican基因中都很常见，可能是因为它们覆盖了较大的基因组区域。

因为发育不全是由隐性功能丧失突变引起的通用产品6同一基因的低形态或显性突变可能导致其他骨骼表型。最近，通用程序5单倍体不足被认为是13q缺失综合征上肢畸形和生长迟缓的分子原因，因为它在发育中的肢芽中表达。33 通用程序5与通用产品6在13q31.2–q31.3上，这两个基因聚集在一起，类似于GPC3类和GPC4基因在X染色体上，这表明glypican家族的这些成员具有进化关系2这可能反映了一个常见的功能。16, 34然而，考虑到完整的GPC5不能补偿异型增生患者中GPC6的丢失，并且Gpc5公司与其他glypicans相比，小鼠生长板中的表达不显著(图S3)，我们的数据不支持它们的功能关系。

GPC6是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）GPI-连接glypican亚家族的六个成员之一，16,28,29在脊椎动物发育过程中广泛表达。29至于其他HSPG，1有人提出glypican基因存在于果蝇属共享部分冗余功能。9GPC4是与GPC6关系最密切的glypican，与之有64%的同源性。16,28,29尽管生长板中有很强的相似性和共表达(图S3)，这两个分子之间似乎没有互补性，因为通用产品6足以引起卵巢发育不良。

在我们的患者中，骨骼表型是均匀的，因为只有典型的患者被选为研究对象。在特定区域的突变和骨骼外表现之间未发现基因型-表型相关性。对小鼠胚胎的研究表明，GPC6在牙齿间质、后肾帽间质、肠间质和血管（背主动脉）中的表达高度独特，表明这些器官的发育具有特殊功能。29然而，其中一个组织的功能障碍并不能直接解释骨外表现，例如隐睾或先天性心脏缺陷，这在发育不良中有报道。在中枢神经系统中，GPC6与GPC4共定位，特别是在心室区，29但它的表达水平远低于GPC4。35智力迟钝并不是单发育不良的持续特征，在我们的系列中只有两名患者出现。精神发育迟滞作为血缘关系的潜在附加影响似乎被排除在外，因为这两名患者中只有一名是血缘父母所生，而另一名是非血缘家庭4中两名受影响的兄弟姐妹之一。

小鼠生长板软骨的免疫荧光显示Gpc6公司在增殖区表达(图5D） ●●●●。显微切割生长板软骨分离RNA的定量PCR证实Gpc6公司在增殖区的表达是肥厚区的50倍以上(图5E） ●●●●。尽管GPC6缺失导致单发育不良的机制尚不清楚，但这些表达数据与人类单发育不良生长板的形态学发现相关，与对照组相比，增殖区似乎扩大了，似乎这些藻细胞的功能缺陷被越来越多的小软骨细胞无效地补偿了。36的微分表达式Gpc6公司小鼠生长板中的mRNA未与其他glypicans一起观察到(图S3)，建议对Gpc6公司在增殖的软骨细胞中。尽管缺乏GPC6功能缺陷的动物模型，但单发育不良表型以及上述表达数据表明通用产品6在软骨内骨化和长骨伸长中起作用。

HSPG对调节印度刺猬至关重要(IHH公司[MIM公司600726])成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白和Wnt信号转导，都是软骨内骨化的关键因素。8GPC6对调节小鼠生长板对甲状腺激素的反应至关重要37与异型增生患者的生长板相似36，含有纯合子低形态等位基因的小鼠的生长板分机1（HS-聚合酶）由于Ihh梯度扩散的改变，增殖区变宽。38虽然这些数据没有提供生长板中球状蛋白的作用机制，但它们显示了IHH信号与发育异常藻体异常之间的形态学相关性。在细胞表面，glypians促进生长因子与其受体的结合。34一旦被Notum裂解并在细胞外基质中释放，GPC6核心蛋白可能参与信号分子的进一步调节。39我们假设通用产品6我们患者中的突变取消了生长板中HSPG的功能，并导致生长因子信号和形态梯度的改变，导致增殖性软骨细胞终末分化失败和长骨生长迟缓。

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补充数据

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补充数据

文件S1。三图四表：
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致谢

我们感谢受影响的个人及其家人的合作。我们感谢Carole Chiesa提供了出色的技术援助，Trevor Cameron提供了软骨RNA分离，Peter Farlie提供了免疫组织化学方面的帮助。这项工作得到了瑞士国家研究基金会（向L.B.授予编号320000-116506）和澳大利亚研究委员会向J.B.授予的发现基金的支持。

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文章来自美国人类遗传学杂志由以下人员提供美国人类遗传学学会