癌症细胞的转移扩散是癌症死亡的主要原因，传统上被视为晚期事件(1)，尽管乳腺上皮细胞已被证明从转基因小鼠的早期肿瘤病变和女性的导管原位癌中系统扩散(2). 有充分证据表明，完全转化的肿瘤细胞的转移能力取决于发育程序和外部环境的调节(三——11)，但异位部位肿瘤细胞的种植或生长在多大程度上依赖于起始的转化事件是一个有争议的话题(12). 我们开发了一种系统，通过使用以强力霉素依赖的哺乳动物特异性方式表达强效致癌基因的动物，将肺部种子细胞的过程与异位部位的恶性生长过程分开。静脉（IV）注射具有不同遗传潜能的标记乳腺细胞[无致癌基因，或只有细胞在异位部位（肺部）定居后才会表达的致癌基因]后，正常乳腺细胞可以滞留在肺部，生长缓慢，一旦潜在的致癌基因被激活，就会成为坦率的转移性恶性肿瘤。
我们最近描述了三转基因TetO-MYC；TetO-Kras公司第12天;百万吨电视rtTA(汤姆；任务大纲；曼恩商用车公司)协调表达MYC公司和突变型喀斯特多西环素对乳腺上皮细胞致癌基因的影响(13). 强力霉素阴性动物不表达转基因致癌基因，具有形态和功能正常的乳腺，但在强力霉素暴露后3-4周内，它们发展为弥漫性本地肿瘤。由于这些癌基因的表达而形成的肿瘤具有恶性特征，如可移植性和转移性(图S1). 因此，该模型提供了可以通过简单的实验操作从正常状态转换为肿瘤状态的初级乳腺细胞。
为了研究这些小鼠的乳腺细胞是否可以在原发部位没有转化的情况下诱导形成转移，我们改进了传统的实验性转移试验(14). 在改进的方法中，我们将分离的形态正常的成熟乳腺细胞注射给新受体，而不是将强力霉素处理过的动物的肿瘤细胞静脉注射给新的受体汤姆；任务大纲；曼恩商用车公司从未接触强力霉素的动物抹布1−/−(15)服用强力霉素的女性。通过这种方式，注射的细胞只能在受体小鼠的血流或组织中转化，这是一种以前从未检测过的实验情况。使用磁共振成像（MRI）进行调查抹布1−/−肺部肿瘤病灶的证据。注射6周后，四分之四的受试者出现孤立结节()，组织学切片显示肺部有乳腺腺癌病灶(); 相反，在未接受强力霉素治疗的对照小鼠中未发现肿瘤(和表S1). 实验性转移瘤在组织学上与荷瘤患者观察到的自发转移瘤相同汤姆；任务大纲；曼恩商用车公司老鼠(图S1)以及供体动物中产生的原发性乳腺肿瘤(13)，肺结节中含有MYC阳性细胞()角蛋白8（K8）、平滑肌动蛋白（SMA）和角蛋白6（K6）(图S2). 这些发现表明，小鼠乳腺细胞通过共表达MYC公司和喀斯特第12天可以在肺部异位环境中实现。
未转化的小鼠乳腺细胞在静脉注射和致癌基因诱导后形成肺转移。（A至D）肺转移由静脉注射表型正常的乳腺细胞在激活MYC公司和喀斯特第12天转基因。(A类)转移瘤由MRI监测抹布1−/−静脉注射1×10的小鼠6从多西环素核酸中分离出的原代乳腺细胞汤姆；任务大纲；曼恩商用车公司老鼠。从注射前1天开始，给受体小鼠喂食多西环素6周。注射后4周和6周从同一只动物身上获得的具有代表性的轴向（顶部）和冠状（底部）图像显示，肺部出现了一个实心结节（箭头）。(B类)相同石蜡包埋肺切片中苏木精-伊红（H/E）染色乳腺癌（箭头）的病灶抹布1−/−鼠标，如（A）所示。比例尺指示1 mm（左）和0.1 mm（右）。(C类)肺切片中未观察到肿瘤抹布1−/−静脉注射1×10后未注射强力霉素的小鼠6多西环素-奈维的原代乳腺细胞汤姆；TOR；曼恩商用车公司老鼠。比例尺，1 mm(D类)与（A）中相同动物的肿瘤细胞，但不是周围肺组织，用抗MYC抗血清染色。比例尺，0.1毫米。（E和F）肺转移由静脉注射的表型正常的乳腺细胞在激活PyMT公司转基因。(E类)5×10后生物发光成像检测表达转基因的供体细胞5多西环素-奈维的原代乳腺细胞TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司将小鼠静脉注射到抹布1−/−注射前1天给予强力霉素的小鼠。注射后第10天和第24天的代表性图像显示胸部中存在信号发射细胞（右）；生物发光的时间增长(14)以相对发光单位量化（左；n个=5只小鼠；误差条代表SD）。(F类)用强力霉素维持12周的（E）小鼠的轴向（顶部）和冠状（底部）MRI图像显示肺部有固体结节。右侧显示了相应的生物发光图像。
我们在不同的小鼠模型中证实了这一观察结果，TetO-PyMT:IRES:Luc；MMTV-rtTA电视(TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司)，最近在我们的实验室生成(14). 中间T多瘤的表达(PyMT公司)该系的癌基因是乳腺特异性和强力霉素依赖性的，可以通过报告基因的协同表达进行监测(吕克)编码萤火虫荧光素酶(图S3). 当成熟的乳腺细胞分离时TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司对从未接触过强力霉素的动物进行静脉注射抹布1−/−服用强力霉素的雌性大鼠，在2周内，在受体小鼠的胸部可以看到生物发光信号(). 核磁共振成像记录了注射小鼠肺部乳腺肿瘤的发展()通过组织学(). 异位乳腺肿瘤病灶来源于汤姆；TOR；曼恩商用车公司或TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司转基因株系表现出与原癌基因激活相关的特征，包括强劲的增殖()和密集的血管(). 因此，在有效致癌基因激活后，先前未转化的小鼠乳腺细胞被输送到体循环，在肺实质中产生类似于转移的疾病，而在原发部位未发生转化。
癌基因激活延迟并不排除异位乳腺肿瘤的发生。(A类)生物发光抹布1−/−静脉注射1×10的小鼠5多西环素核酸的乳腺细胞TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司小鼠在接触强力霉素之前无法检测到，但在将小鼠置于强力霉素1.5（◆，n个=7只小鼠），8只（■，n个=3只小鼠），或17周（●，n个=2只小鼠）。向下箭头表示饮食中添加强力霉素的次数。误差条代表SD。在注射后10天，在没有强力霉素的情况下（右上），以及注射强力霉素2周后（右下），获得了具有代表性的生物发光图像。(B类)肺组织学类似转移瘤抹布1−/−静脉注射1×10的小鼠5多西环素核酸的乳腺细胞TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司小鼠在静脉注射（左）后10天或静脉注射（右）前1天开始接触强力霉素8周。比例尺，1 mm（顶部）和0.1 mm（底部）。(C类)肺切片中肿瘤病灶的有丝分裂活性抹布1−/−收件人汤姆；任务大纲；甲基溴细胞（左侧；用抗pH3染色）或抹布1−/−收件人汤姆：IRES：吕克；曼恩商用车公司细胞（右侧；BrdU标记后用抗BrdU血清染色）(14). 比例尺，0.1 mm(D类)生物素化凝集素灌注异位肿瘤显示血管生成能力（左）(14)并用抗CD31血清染色肿瘤病灶内的内皮细胞拉格牌手表−/−收件人TOMT:IRES:Luc；甲基溴单元格（右侧）。比例尺，0.1 mm。
为了探索未转化的乳腺细胞是否能在血液和肺异位环境中存活，而癌基因没有表达，但在以后仍能诱导其发展成肿瘤，我们将分离的乳腺细胞注射到TOMT:IRES:Luc；曼恩商用车公司从未接触强力霉素的动物抹布1−/−无强力霉素饮食的雌性。在对该饮食进行长达4个月的监测后，在受体小鼠的肺部中未观察到生物发光信号(). 当受体在静脉注射转基因乳腺细胞后1.5、8或17周接受强力霉素治疗时，我们在强力霉素暴露开始后2周内检测到胸部的生物发光(). 静脉注射前1天和注射后10天给予强力霉素饮食的动物的组织学外观和肺部病灶总数相似[32±6（SD），n个=5只小鼠和26±6（SD），n个=分别为4只小鼠](). 诱导后期转化为恶性肿瘤未进行测量，因为MMTV-rtTA电视转基因曼恩商用车公司随着年龄的增长，线条变得不均匀(16). 这些观察结果表明，在没有癌基因表达的情况下，导致异位乳腺肿瘤发生的细胞可以在肺部持续存在长达17周。
为了排除转基因癌基因在缺乏强力霉素的情况下出现低水平或短暂表达的可能性，我们对缺乏任何转基因癌基因的动物（C57BL6/J小鼠）或表达编码“增强”基因的动物的乳腺制剂进行了改进的实验性转移检测鸡β中的绿色荧光蛋白-肌动蛋白启动子（β-肌动蛋白-GFP) (17). 注射β-肌动蛋白-GFP小鼠，在所有受体的整个肺的荧光显微镜下观察到绿色病灶(). 这些病灶缺乏转移瘤的结节状外观，在常规组织学检查中不明显(，左上角）。K8抗体染色有助于检测异位病灶并确认其上皮来源，而在未注射的小鼠肺部，只有支气管上皮被染色(，右）。
没有致癌转基因的乳腺细胞可以在肺部存留。(A类)激发光下观察到的绿细胞焦点(14)在一个全新的肺里抹布1−/−受体静脉注射5×10后3周5从aβ中分离出的乳腺细胞-肌动蛋白-GFP鼠标。比例尺，0.1 mm(B类)肺切片中H/E染色异位病灶的典型大小和分布抹布1−/−小鼠静脉注射3×106来自aβ的乳腺细胞-肌动蛋白-GFP注射后3周供者（左上）。插图显示了高倍镜下典型的H/E染色病灶。连续切片（右上）用大鼠K8抗血清染色。未注射的肺切片的H/E（左下）或K8染色（右下）未发现病灶抹布1−/−老鼠。比例尺，1 mm。插入比例尺0.2 mm(C类)用大鼠抗BrdU血清（箭头，顶部）检测到的BrdU标记或用抗pH3染色（箭头，左侧）显示的异位上皮外生长中的有丝分裂活性（用红色勾勒）。比例尺，0.2 mm(D类)激发光下全肺成像观察到绿色荧光细胞的较大病灶(14)注射后16周（右）与注射后1周（左）比较。抹布1−/−受体注射3×105从aβ中分离出的乳腺细胞-肌动蛋白-GFP鼠标。比例尺，1 mm(E类)继发性乳腺再生抹布1−/−受体在移植后4或7周在整个支架制剂中产生可在激发光下检测到的绿色荧光乳腺树(14). 从处女受体（左）获取腺体，或对宿主动物进行交配，并在产后1天获取移植腺体（右）。比例尺，1 mm。
为了确定正常上皮细胞的异位病灶是否在肺部的外部环境中持续存在并生长，我们统计了注射后不同时间肺切片中离散病灶的总数，并观察了这些病灶中的增殖标记物。注射4×10的C57BL6/J受体肺切片中发现的病灶总数5在3周时接受调查的动物中，同基因乳腺细胞相似(n个=3只小鼠）和10周时接受调查的小鼠(n个=3只小鼠）（10个石蜡肺切片分别为42±7和56±22）。此外，野生型细胞能够形成这些小上皮簇的效率与我们在注射多西环素核酸细胞后诱导异位肿瘤的效率相似汤姆；任务大纲；曼恩商用车公司捐赠者[1.2±0.4（标准偏差）vs.1.7±1.4（标准偏差，n个分别为6只和8只小鼠；按照中所述进行测量(14)]. 这一结果有力地证明，大多数或所有能够在肺部存活的乳腺细胞都能够通过形成异位乳腺肿瘤对启动的癌基因表达作出反应。
非转基因C57BL6/J–和β-肌动蛋白-GFP–衍生病灶，偶尔有细胞显示有丝分裂活性(). 与此结果一致的是，在激发光下，用β--肌动蛋白-GFP注射后16周的小鼠比注射后1周接受相同制剂的小鼠体型大(). 异位上皮外生长包含K8和SMA阳性细胞，如在完整乳腺中观察到的(图S4A)外生长有时呈腺状。尽管在肺部停留时间较长（长达4个月），但在三维形态发生分析中，从受体肺部回收的绿色细胞能够形成中空的腺泡结构(图S4B)以及乳腺的清除脂肪垫中的继发性乳腺生长抹布1−/−女性(). 这些发现证实了肺中的异位细胞确实起源于乳腺，它们具有活力和有丝分裂活性，并且至少其中一些具有多潜能，能够支持乳腺的全面发育。
这里描述的实验表明，在缺乏活性癌基因的情况下，未转化小鼠乳腺中分离的细胞可以在肺部异位环境中定居，生长缓慢，静脉注射后临床上仍无法检测到。当致癌基因激活时，同一细胞可以引起转移性恶性肿瘤，而致癌基因可以在完整的腺体中产生乳腺肿瘤。众所周知，建立转移瘤需要多个步骤，包括将原发肿瘤的细胞注入血管或淋巴管；循环中的存活、外渗和异位部位细胞的建立；和恶性生长。因为我们已经将转基因小鼠供体的乳腺细胞注射到受体小鼠的尾静脉中，所以我们没有检查静脉注射的要求。然而，我们已经证明，除了异位部位的恶性生长外，激活的致癌基因和细胞转化并不需要任何后续步骤。这些发现表明，正常细胞固有的特性足以协商转移级联的很大一部分。大量实验和临床证据支持这样一种观点，即小肿瘤细胞可能在肿瘤发生早期扩散到远处，并导致人类乳腺癌的休眠和晚期复发(2，18). 虽然我们不知道癌前细胞是否能在这些早期阶段进入体循环并成为晚期转移性肿瘤的来源，但我们的观察结果表明，这一假设应该得到验证。转移性疾病可由循环中未转化的乳腺细胞引起，这一发现完善了我们对癌症进展的概念，并建议应检查转移级联中的每一步，以确定其功能需求，包括正常细胞的功能需求。这种功能可能容易受到抑制策略的影响，这些策略可以消融播散的恶性前期或恶性细胞，从而降低癌症造成的死亡率。
