肝癌中鳞状细胞癌抗原（SCCA）的组织表达与肿瘤大小呈负相关
,#1 ,#2 ,2 ,2 ,三 ,2,4 ,5 ,2和
2 保罗·特雷罗托利
1意大利巴里巴里大学医学院医学统计科生物医学和人类肿瘤学系
艾米莉亚·弗朗斯韦
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
翁贝托·安吉洛蒂
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
乔瓦尼·安托纳西
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
路易吉·卢波
三意大利巴里巴里大学医学院急诊和器官移植系
安东尼奥·马佐卡
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
4美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心病理学系
安妮塔·曼吉亚
5意大利巴里国家癌症研究所临床实验肿瘤实验室
萨尔瓦多·安东尼
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
吉安路易吉·吉安内利
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
1意大利巴里巴里大学医学院医学统计科生物医学和人类肿瘤学系
2意大利巴里巴里大学医学院内科、免疫学和传染病系
三意大利巴里巴里大学医学院急诊和器官移植系
4美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心病理学系
5意大利巴里国家癌症研究所临床实验肿瘤实验室
通讯作者。 #贡献均等。
收到日期：2009年1月23日；2009年5月27日接受。
版权©2009 Trerotoli等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
本研究旨在研究血清、肿瘤和配对瘤周组织中的鳞状细胞癌抗原（SCCA）。我们研究了27例肝硬化（LC）和55例肝癌患者：20例单个结节<3cm（s-HCC），35例单个结节>3cm或多灶（l-HCC）。
方法
血清SCCA用ELISA试剂盒测定，冰冻组织用免疫组织化学法测定，用适当的成像分析软件定量，并以平方微米表示。连续变量报告为平均值和95%置信区间。采用广义线性模型和Tukey分组对独立组进行比较。测定皮尔逊相关系数以评估标记之间的关系。定性变量总结为计数和百分比。统计显著性设置为p值<0.05。
结果
LC患者的血清SCCA值为0.41（0.31–0.55）ng/ml，与两个HCC组相比有统计学差异：s-HCC为1.6（1.0–2.6）ng/ml，l-HCC为2.2（1.28–2.74）ng/mI。肝组织中SCCA为263.8（176.6-394.01）μm2在LC患者中，与s-HCC的数值有统计学差异：1163.2（863.6–1566.8）μm2和l-HCC:625.8（534.5–732.6）。各组之间的所有成对比较都产生了统计上的显著差异。肿瘤SCCA结果与结节大小呈线性相关，显示这两个变量之间具有统计学意义的反向关系（b=-0.099，p=0.024）。
结论
SCCA的组织和血清水平之间没有统计学上的显著相关性。SCCA在较小肝癌组织中的表达明显强于较大肝癌组织，这对于早期肝癌的检测具有重要意义。然而，瘤周组织中表达的增加可能会影响血清学检测的意义。
背景
早期识别肝细胞癌（HCC）的发病将有助于为患者选择更有效的治疗方法，从而获得更好的预后和寿命。因此，在巴塞罗那举行的共识会议上强烈建议实施监测计划[1]. 甲胎蛋白（AFP）是临床实践中唯一常用的标志物，仅对高于400 IU/ml的值显示出较差的敏感性和较高的特异性。然而，由于AFP浓度与肿瘤大小直接相关，因此这种标志物的可靠性似乎不足以早期识别HCC[2]. 这促使进行了大量研究来验证不同的新生物标记物，但关于生物标记物有助于实现肝癌早期检测的报道很少[三]. 就诊断准确性、结果的再现性或与生物标记物检测方法相关的技术问题而言，所有提议的生物标记物未能以令人满意的方式区分肝硬化（LC）和肝癌[4]. 因此，同时使用不同的测试似乎提供了一种有希望的方法，值得进一步调查[5].
鳞状细胞癌抗原（SCCA）是丝氨酸蛋白酶抑制剂大分子量家族中的一员[6]. 据报道，肝癌组织中有两种高度同源的亚型在蛋白质和翻译水平上表达[7]. 据报道，与肝癌的成对癌周组织相比，SCCA在肿瘤组织中过度表达，这表明SCCA在肝癌组织学检测中具有潜在的标记作用[8]. 最近，SCCA在肝癌组织再生结节和异型增生结节中得到了研究。有趣的是，结果显示SCCA在再生组织中表达较差，但在增生异常结节中表达强烈，这表明SCCA可作为早期检测HCC的潜在标记物[9].
本研究的目的是研究SCCA在不同特征的HCC患者中的组织表达，即大小或多灶结节。
结果
在82例患者、27例LC和55例HCC的匹配血清和组织中定量SCCA。在后一组患者中，研究了SCCA在肿瘤组织和成对瘤周组织中的组织表达。患者根据结节大小分层。肝癌病灶的平均（95%可信区间）大小为4.07±2.08cm；36.4%（20/55）的患者有一个小于或等于3cm的单个结节（s-HCC），63.6%（35/55）有一个大于3cm的结节或多灶性结节（l-HCC）。在s-HCC（55%）、l-HCC（82%）和LC（88%）中，Child-Pugh分期A的百分比存在统计学显著差异（p=0.01）。最常见的病因是HCV单独感染或HBV感染，组间差异无显著性（p=0.108）：s-HCC为65%（15/20），l-HCC为71.4%（25/35），LC为92.6%（25/27）（表).
表1
| | 单个结节≤3 cm | 单个结节>3 cm | 总HCC | 信用证 |
| 性别 | M（M） | 16 | 28 | 44 | 17 |
| F类 | 4 | 7 | 11 | 10 |
| | | | | |
| 年龄 | | 65 (10.15) | 65 (10. 2) | 65 (10.1) | |
| | | | | |
| 大小 | | 2..4 (0.5) | 5 (2) | 4 (2.1) | |
| | | | | |
| 削减 | 0 | 7 | 15 | 22 | |
| 1 | 10 | 17 | 27 | |
| 2 | 三 | 三 | 6 | |
| | | | | 27 |
| | | | | |
| 儿童 | A类 | 11 | 29 | 40 | 24 |
| B类 | 9 | 6 | 15 | 三 |
| | | | | |
| 病因学 | 酒精或其他 | 1 | 2 | 三 | 1 |
| | | | | |
| 乙型肝炎病毒 | 三 | 8 | 11 | 1 |
| HBV+酒精 | 1 | | 1 | |
| HBV总数 | 4 | 8 | 12 | 1 |
| 仅HCV | 13 | 23 | 36 | 24 |
| 丙型肝炎病毒+乙型肝炎病毒 | 1 | 2 | 三 | |
| HCV+酒精或其他 | 1 | | 1 | 1 |
| HCV总数 | 15 | 25 | 40 | 25 |
通过免疫组织化学方法在所有患者中检测到SCCA，尽管在大小肝癌的肿瘤组织和瘤周组织中存在一些差异（图). 特别是，肿瘤组织中的平均（95%置信区间）表达为1163.2（863.6–1566.8）μm2s-HCC和625.8（534.5–732.6）μm2在l-HCC中。各组之间存在统计学上的显著差异（F=17.45，p=0.002），Tukey分组显示s-HCC与l-HCC之间存在显著差异（p<0.05）（图). 为了进一步研究SCCA的组织表达，我们分析了成对的瘤周组织以及作为适当对照的LC样本。SCCA组织表达的平均值（95%CI）为263.8（176.6–394.01）μm2在s-HCC瘤周组织中，345.49（263,98–452,16）μm2l-HCC和232.63（163.3–331.38）μm2在LC中，图该模型的结果在统计学上没有显著性差异（F=1.84，p=0.16）。总之，与大肝癌相比，SCCA在较小的肿瘤组织中表达更强烈。此外，值得注意的是，肿瘤性SCCA和瘤周性SCCA之间的比率呈现出从s-HCC的4.4到l-HCC的1.8的趋势。
短链氯化石蜡的组织表达在图1A中，在低（A，C）和高（B，D）放大率下，大小肝癌中SCCA的免疫组化。小（E）和大（F）HCC低倍镜下成对的瘤周组织。在A、C、E和F中，标尺=100μm，在B和D中，标杆=50μm。在图1B中，不同HCC患者组肿瘤组织SCCA的95%置信区间。
不同HCC患者组非肿瘤性瘤周组织SCCA的95%置信区间.
在相同的患者中，我们测量了SCCA的血清浓度。如图所示，s-HCC中的浓度为1.6（1.02–2.6）ng/ml，l-HCC中为2.2（1.28–2.74）ng/ml，LC患者为0.41（0.31–0.55）ng/mI（图). 该模型的结果具有统计学意义（F=20.81，p<0.0001），Tukey分组在各HCC组和LC组之间显示出显著差异（p<0.05）。
如广义线性模型所示，潜在的肝脏疾病似乎不会影响不同Child-Pugh分期患者的SCCA组织表达水平（p=0.5），而与LC相比，唯一重要的因素仍然是HCC的诊断（p=0.049）。
依赖性瘤周SCCA的回归模型显示，在单结节HCC亚组中，结节大小作为预测瘤周SCCA的一种手段，在统计学上没有显著意义（b=0.064；F=1.55；p=0.219），而它是肿瘤SCCA的一种具有统计学意义的预测因子（b=-0.099；F=5.47；p=0.024；R2= 0.117).
血清SCCA和结节大小之间的线性回归显示这两个变量之间没有统计学意义的关系（b=0.023；F=0.14；p=0.71；R2= 0.003).
总之，肿瘤SCCA取决于结节大小，结节大小与较高的SCCA值呈相反趋势。相反，瘤周和血清SCCA与肿瘤大小没有任何关系。
血清SCCA的ROC曲线下面积为0.897（CI95%0.81–0.953），建议的临界值为1.1 ng/ml，敏感性为72.7%，特异性为100%，尤登指数为72.7%。仅评估s-HCC和LC患者，血清SCCA的类似准确度为：AUC 0.873（CI95%0.743–0.952），截止值1.1 ng/ml，敏感性70%，特异性100%，尤登指数70%。
然而，在HCC中，肿瘤和/或癌周组织中存在的SCCA水平与血清中存在的SCCA水平之间没有统计学上的显著相关性（表). Pearson相关系数仅在评估LC患者血清水平与肝硬化肝组织SCCA表达之间的关系时具有统计学意义：0.39（p=0.04）。换句话说，组织值越高，血清值就越高，但仅限于LC患者。
表2
| | 瘤周SCCA | 肿瘤SCCA |
| s-HCC公司 | 血清SCCA | 0.01 | -0.08 |
|
| 肿瘤SCCA | 0.27 | |
|
| | | |
|
| l-HCC公司 | 血清SCCA | 0.05 | -0.13 |
|
| 肿瘤SCCA | 0.014 | |
|
| | | |
|
| 信用证 | 血清SCCA | 0.39（p=0.04） | |
最后，血清SCCA值可以表示为该标记物的肿瘤或瘤周值的函数，因此进行了回归分析；结果如图所示所评估的模型除LC患者外没有统计学意义（F=5.02，p=0.034）。在该组中，斜率为0.33（p=0.034），表明SCCA血清值增加，组织表达增强。在HCC患者中，SCCA肿瘤或瘤周组织的表达都不能预测血清水平，这一发现在两组患者中是一致的。此外，在较小的结节中，我们计算出711μm2测定血清中一个单位的SCCA抗原是必需的，而在较大的肿瘤中只有268μm2已经足够了。
HCC患者肿瘤和瘤周组织中血清SCCA和LC患者组织SCCA的散点图.Ln=自然对数。
讨论
最近，肝癌诊断新生物标记物的研究引起了极大的兴趣，因为它们可以为单个患者选择最有效的治疗方法。从这个观点来看，帮助检测小肝癌的生物标记物将是向前迈出的一大步。最近，SCCA的组织表达在癌前病变患者中的比例高于再生结节患者。此外，在同一研究中，SCCA在癌前增生异常结节中的表达比在肝癌中的表达更为强烈[9]. 在我们的研究中，观察到类似的统计学显著差异，但由于患有增生异常性肝硬化结节的患者数量较少（5名LC患者vs.20名s-HCC患者），尽管这似乎是一个有趣的初步观察结果，但无法得出可靠的结论。与这些数据一致，我们在此报告SCCA在较小肝癌组织中比较大肝癌组织中表达更强烈。因此，首次报道了一种能够更好地区分较小结节和较大结节的标记物，尽管这种标记物在组织中的发现也限制了其在临床实践中的直接应用。然而，本研究的结果包含两个不同的信息，第一，SCCA可能是癌前转化的生物标记物，第二，这种血清生物标记物的不规则行为可能与不同的肿瘤生物学状态有关。
特别是，SCCA的表达随着肿瘤大小的进展而减少，并且在更大肝癌的瘤周组织中表达增加，进一步肿瘤转化的风险更高，这支持我们的第一个结论。这些结果与我们之前的观察结果一致[5]Pontisso等人之前的一份报告也支持这一观点，该报告显示，在LC进展为HCC的患者中，SCCA持续增加[10]. 这可以解释为什么某些LC患者的SCCA会意外增加。事实上，在我们的研究中，结节大小和肿瘤SCCA之间的关系表明，高水平的SCCA表达可以预测HCC发作的临床证据。
另一方面，组织和血清SCCA水平之间缺乏相关性令人失望，目前尚无任何解释。然而，事实上，SCCA主要分布在胞浆中，与膜结合小泡无关，因此不能正常分泌，而是在细胞溶解后在血清中释放，这可能有助于澄清这个问题[11]. 我们之前的研究也证实了这一假设，该研究显示SCCA在一些细胞系中表达，但在条件培养基中没有表达，表明蛋白分泌缺陷[8].
此外，值得注意的是，血清SCCA的量并不取决于其在瘤周或LC组织中的表达水平。较小结节的比率高于较大结节，表明SCCA在不同时间产生和释放，可能发生在HCC进展的早期事件中；这为SCCA血清和组织水平之间的差异提供了另一种可能的解释。
总之，本研究表明SCCA组织表达可能是早期检测较小肝癌结节的标志，并有助于解释为什么血清中的数据可能有些令人失望。此外，我们的结果表明，建议的生物标记物需要仔细研究和临床验证，以获得更可靠的结果。
材料和方法
组织和血清采集
原发性结节和瘤周区的组织标本来自HCC患者以及LC患者。所有通过手术活检获得的标本均固定在3.7%甲醛中，并进行常规组织学检查，同时部分标本立即在液氮中快速冷冻，并在-80°C下保存，直至使用。在任何一种治疗之前，均采集同一患者的血清样本，并在-20°C下保存，直至使用。
根据EASL标准将患者分为LC和HCC，根据CLIP分类确定肿瘤分期[1,12]; 结节大小由一致的US、CT和/或MRI扫描确定。在82例患者、27例LC和55例HCC的匹配血清和组织中定量SCCA。在后一组患者中，研究了SCCA在肿瘤组织和成对瘤周组织中的组织表达。
这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的，在手术或肝活检之前以及血样采集之前，所有患者都获得了知情的书面同意
SCCA的组织表达
如前所述，对冰冻标本进行免疫组织化学[13]. SCCA是使用从（Hepa-Ab，Xeptagen，意大利）购买的针对重组SCCA的多克隆抗体并按照制造商的说明检测的。
SCCA的表达以μm为单位进行测量2通过适当的软件系统（Lucia、Nikon、Corp）进行染色，这在我们之前的几份报告中已经得到验证。简单地说，SCCA抗原的表达在每个切片中被测量为总染色面积，计算为十个随机选择的显微镜视野的平均值。数字和显示所有计算结果的平均值和标准偏差。为了使染色定量标准化，每个实验中都包括一个阴性对照物（没有一级抗体培养的切片），以便在背景染色上校准软件的灵敏度。
SCCA血清测定
按照之前报告的制造商说明，使用从施普坦（意大利那不勒斯施普坦）购买的ELISA试剂盒进行SCCA抗原的血清测定[8]. 简言之，SCCA ELISA试剂盒基于三明治系统，其中HRP结合链霉亲和素二级抗体用于揭示反应。还包括一条标准曲线作为内部对照，并对样品进行两次测试，以确保结果的重现性。
统计分析
连续非高斯分布变量被转换为自然对数，并在反向转换后描述为平均值和95%置信区间。独立组之间的比较采用Student t检验，两组以上的比较采用广义线性模型。通过Tukey分组进行多次比较。皮尔逊系数用于评估连续变量之间的相关性。为了评估S-SCCA作为组织标志物值函数的预测，以S-SCCA的自然对数为因变量，以肿瘤和/或瘤周SCCA值的自然对数作为自变量，建立了线性回归模型。为了评估肿瘤、瘤周和血清SCCA与结节大小的线性关系，仅对单个结节的观察结果进行回归模型。
为了评估血清SCCA的诊断准确性，进行了ROC分析；确定了临界值和相关的敏感性、特异性和尤登指数。
定性变量概括为计数和百分比。在适当的情况下，采用X平方检验或Fisher精确检验进行独立组之间的比较。
所有测试在p值<0.05时均被视为具有统计学意义。使用9.1版PC SAS系统软件进行分析。
缩写
HCC：肝细胞癌；LC：肝硬化；SCCA：鳞状细胞癌抗原；AFP：α-脂肪蛋白-IC：免疫复合物。
作者的贡献
PT进行了统计分析。EF、UA、GA、AM和AM进行了实验。LL负责监督生物样品的采集。SA监督了该项目。GG监督项目并准备手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。
致谢
这项研究得到了意大利癌症研究协会（AIRC）的支持（授予GG编号202240GNN28）。
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