维甲酸信号组织沿整个前后轴的内胚层器官规格

RA的应用

所有变速器RA是从Sigma购买的。对于珠子嫁接方法，将含有直径为200-400µm的氯化物结合珠子的AG1-X2阴离子交换树脂（BioRad）在其亲和力较低的甲酸盐中进行平衡。然后，将甲酸盐在4°C的乙醇溶液中培养过夜，以取代甲酸盐⁻³M或10⁻⁴M RA，然后用PBS清洗。对于原肠胚阶段的植入，将珠子放置在Kimura等人确定的内胚层位置。[29]在体细胞期植入中，沿着AP轴在紧邻体节的侧板内胚层或已经闭合的前肠内胚层的侧面以不同的水平嫁接珠子。作为珠载RA的替代品，RA在10⁻⁶M或10⁻⁷M.仅通过添加相应数量的乙醇制备对照板。这允许使用较低的RA浓度以达到相同的效果，但不允许限制小面积接触。

AGN193109的应用

RA拮抗剂AGN193109在诺和诺德A/S（DK）合成[30]。在RA-应答的P19胚胎癌细胞中使用RARβ，RA信号的直接目标，作为读数[31],[32](图S1). 对于处理鸡胚⁻²制备了M AGN193109 DMSO储备溶液，10⁻⁵培养基中加入M AGN193109或纯DMSO作为对照。胚胎按照上述方法进行孵化和放置。

FGF4的应用

重组FGF4购自R&D Systems Inc.。将直径为150–250µm的肝素丙烯酸珠（Sigma）浸泡在PBS溶液中或与1 mg/ml FGF4一起浸泡。对于原肠胚期植入，珠被切成两半，平放在内胚层上，小心不要撕裂内胚层。

SU5402的应用

SU5402购自Calbiochem。通过添加最终浓度为20µM的SU5402（DMSO中的50 mM储备溶液）或纯DMSO作为对照，将FGF抑制剂直接加入新培养基中。

卵内电穿孔

对18和22体节期（13–14 HH期）之间的胚胎进行电穿孔，如前所述，相当于在38°C下培养约54小时[33]电穿孔后，用胶带将卵子重新密封，并将其置于38°C下28–30 h或48 h。S.Sockanathan和T.Jessell提供克隆到pCIG中的显性（VP16融合）和阴性（hRAR 403氨基酸截断）维甲酸受体。载体导致GFP共表达[34]–[36].

现场鸡胚的杂交和切片

整个底座就地如前所述进行杂交[37]简单地说，将胚胎固定在4%多聚甲醛中，在甲醇中脱水，再水化，用蛋白酶K（10µg/ml）处理30秒至3分钟，具体时间取决于胚胎的发育阶段，然后再固定在4%的多聚甲醛和4%的戊二醛中。将胚胎在70°C的杂交缓冲液（50%甲酰胺，1.3×SSC，5 mM EDTA，50µg/ml酵母RNA，0.2%吐温20，0.5%CHAPS，50 mg/ml肝素）中杂交过夜，其中含有1µg/ml RNA探针。用抗地高辛抗体（Roche，1∶2000）清洗胚胎并孵育过夜。使用4.5µl/ml NBT储备液（75 mg/ml）和7µl/ml BCIP储备液（25 mg/ml）进行染色。现场杂交探针以前发表过：RARα，β和γ [38],霍克斯B4 [39],探头1 [40],Pdx1页 [41],CdxA公司 [42],Hex1（六角） [43],Nkx2.1个 [44],Nkx6.2个 [45],γ-纤维蛋白原 [46],霍克斯A2 [47]，的Cyp26A1细胞和拉尔德2从HH 20期鸡cDNA中通过RT-PCR扩增产生探针。用于扩增cDNA的引物为：拉尔德2（反义：5′-gctcttctgcactattgg-3′; 感觉：5′-atggcatctgcatctgc-3′);Cyp26A1细胞（反义：5′-tcagatttggccgctgaaacc-3′; 感觉：5′-atggcttctccgctctggtcg-3′). 将cDNA克隆到pGEM-Teasy（Promega）中。对于切片，将整个原位贴装染色胚胎嵌入15%的蔗糖-葡聚糖中，并收集15µm的冷冻切片。

外源性RA激活内胚层内的直接靶基因

为了研究内胚层对外源RA是否有反应，我们利用了直接RA靶基因Cyp26A1。无论是在HH 4期（原始条纹晚期）还是HH 10期（体节10期），我们都将浸泡在RA（10⁻³M或10⁻⁴M） 在改良的新培养物中进入内胚层(图2A)[28]。培养6小时后，检测这些胚胎的Cyp26A1细胞我们选择这个相对较短的潜伏期，以减少通过RA激活邻近细胞（尤其是中胚层细胞）间接诱导靶基因的可能性。HH 5时，暴露于含RA的珠子的胚胎表现出广泛的Cyp26A1细胞内胚层和外胚层珠周围的诱导(表1;图2C、E)以及HH 11的内胚层和外胚层(表1;图2G，I). 的范围Cyp26A1细胞浸透10的珠子周围的感应⁻³在原肠胚形成期间，M RA可以估计为胚胎的一半，在体细胞发生期间扩散到3个体节的长度。低浓度（10⁻⁴M） RA诱导的Cyp26A1细胞mRNA在较短范围内（未显示）。同样，要么10⁻⁶M和10⁻⁷M RA在原肠期或体液期被纳入培养基，导致升高Cyp26A1细胞在其内源性结构域中表达。然而，在异位区域没有观察到诱导。

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图2

外源性RA激活内胚层中的异位基因转录。

（A） 是一个示意图，显示了HH 4阶段RA珠的初始嫁接位置⁻或HH10鸡胚。（B–I）显示整个底座就地杂交分析Cyp26A1细胞对照组（B，F），RA珠移植（C，G）或抑制剂处理的胚胎（D，H），腹视图，顶部前面。将珠子浸泡在乙醇（对照）或含有10⁻³将M RA和移植到内胚层，6小时后进行分析（分别约为HH 5或HH 11）。为了抑制，胚胎用10⁻⁵M AGN193109添加到HH 3的培养基中⁺或HH 10，孵育6小时，然后进行分析（分别约为HH 4-5或HH 11）。每张图片都给出了嫁接的确切阶段和分析。珠子的位置由一个圆圈标记，线条给出了（E和I）中所示的截面平面，腹侧朝下。比例尺为100µM。注意（E）中的宽诱导和（I）中的单侧腹侧诱导。A、 前部；h、 小时；P、 后部。

为了阻断RA信号，我们使用了AGN193109（10⁻⁶M） 在培养基中抑制所有风险调整比率秒[30]; 补充的图1). RA信号的抑制导致Cyp26A1细胞原肠胚形成期的表达(图2D;表2)完全没有Cyp26A1细胞HH 11期胚胎干细胞中的转录物(图2H;表2). 在这个阶段，尾芽中的表达独立于RA信号。这些实验证明第26周期内胚层中的表达确实依赖于RA，并且在原肠胚形成和体细胞发生时，内胚层也显示出活跃的内源性RA途径。

RA分级显示鳃弓内胚层

为了研究RA信号改变如何影响随后的肠管模式，我们要么移植RA浸泡珠（10⁻³M或10⁻⁴M） 或包括不同浓度的RA（10⁻⁶M或10⁻⁷M） 在培养基中。在这些胚胎中，分析前肠道内胚层中表达的一组转录因子。嫁接珠限制了RA的暴露区域，从而限制了致畸作用。在睡眠阶段，它将控制侧作为内部控制。将RA应用于培养基中可确保更均匀地暴露于更生理水平的RA。然而，这两种方法对标记表达的影响相似。

十六进制是最前面、最早的内胚层标志物。我们分析了十六进制在HH 4期移植的胚胎中表达，并在HH 5–6期收集。在这个早期阶段，十六进制标志着假定的前肠内胚层，它产生包括肝脏、甲状腺和腹胰腺在内的器官[56]。激活RA信号后，十六进制表达式减少(图3A、B;表1)通常在培养基中提供RA时，或在当地交付时，单方面围绕珠子。这表明前内皮命运受到全反式拉脱维亚。为了研究早期接触类风湿关节炎的后期后果，我们将胚胎固定在HH15期十六进制表达定义甲状腺和肝脏原基[56].RA处理鸡胚可特异性抑制十六进制在甲状腺中表达，但在肝脏中不表达(图3D，E;表1). 在HH 11阶段，Nkx2.1个基因活性决定了腹前肠内胚层的甲状腺和前脑的垂体[57]在HH 14期的RA处理胚胎中，分析Nkx2.1个证实甲状腺特异性基因通过外源性RA被抑制(图3G，H;表1)表明甲状腺原基细胞受到影响。当胚胎在HH 10期暴露于RA并在HH 14期固定时，也获得了类似的结果，这表明RA可以阻断最前部的内胚层特性，直到体丝发生(表1). 为了进一步确定RA对肝诱导的影响，我们在HH10阶段RA暴露后调查了两个独立的肝脏标志物。探头1在HH 13/14的分化肝芽中特异性表达[46]，当RA信号被外部激活时，局部减少(图3M，N). 然而，我们看不到对独立标记物γ-纤维蛋白原的影响(图S3). 这些发现表明，RA治疗不会损害肝脏沿肠道主轴的定位，并且通常不会抑制后期的肝脏分化，尽管它可能会影响特定的分化标记物。

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图3

RA对咽内胚层进行分级。

RA珠子（10⁻³M） 在HH10将对照珠嫁接到内胚层，并根据特异标记表达的时间（D、E、G、H、J、K、M、N）对不同阶段的胚胎进行分析。十六进制在HH 4和HH 5（A，B）移植的胚胎中也进行了表达分析。在HH 3阶段进行RA抑制⁺或通过添加10⁻⁵M AGN193109加入培养基（C、F、I、L、O）。每张图片都显示了治疗和分析的确切阶段。整个底座就地杂交分析胚胎十六进制（A–F），Nkx2.1个（G–I），探头1（J–L）和霍克斯B4（M–O）。在的侧面视图中Nkx2.1个（G-I），去除表面外胚层以更好地观察染色。方框（K）显示放大倍数较高探头1RA治疗的抑制作用。虽然是肝脏十六进制E中的表达可能会减少，这是不可重复观察到的。黑线表示AIP的中线。霍克斯B4在所有三个胚层中都有表达，因此，内胚层中的诱导已通过相应的整座胚胎中用黑线标记的15µm切片（P，Q）进行了验证。前部始终位于顶部，但在（G–I）中，前部显示在左侧。比例尺为100µM。星号标记耳泡。黑色箭头表示RA处理的胚胎中甲状腺基因表达缺失。黑色箭头表示丢失十六进制或探头1表达式。蓝色箭头表示甲状腺正常表达十六进制或Nkx2.1个。绿色箭头指向肝芽。红色箭头表示异位十六进制表达式。白色箭头标记前脑表达Nkx2.1个.圆圈标记嫁接珠子的位置。

为了研究RA是否需要限制前内皮层边界，我们在HH 4期用AGN193109抑制RA信号。我们发现了十六进制表达不受影响(表2，未显示）。然而，RA信号的早期抑制（HH 3+期）会横向减少十六进制HH 4时的表达式(图3C)而将这些胚胎留到15个体节期会导致异位十六进制肝芽与甲状腺之间前肠内胚层的表达(图3F;表2). 该异位结构域不具有完整的甲状腺或肝脏程序，因为它既不表达Nkx2.1个也不是探头1或γ-纤维蛋白原(图3I、L、O;表2,图S3). 因此，抑制前肠内胚层细胞的RAR活性可以揭示它们表达RAR的能力十六进制我们得出结论，在HH 3+之前需要RA信号来限制十六进制表达到其内源性结构域。

接下来我们分析了霍克斯B4，在包括内胚层在内的所有三个胚层中内源性表达。阶段HH 13，霍克斯B4在鳃弓4后、第一体节水平正前方的内胚层达到其明确的前边界(图3P). 原肠胚期和体节期RA信号增加导致前移和高表达霍克斯B4内胚层、神经管和表面外胚层切片证实（n=8；图3Q、T;表1). 同样，霍克斯A2，在包括内胚层在内的所有三个胚层中内源性表达，在鳃弓2和3之间具有前边界[47]在外胚层和内胚层体节期RA暴露导致前移(图S2 A、B;表1). 在我们用AGN193109在HH 4抑制RA信号通路的反向实验中，我们发现后移和减少霍克斯B4mRNA水平(图3R;表2). 但是在中未检测到任何变化霍克斯A2表达模式，可能是由于早期RA的独立性(图S2 A、C;表2). 综上所述，这些数据表明RA信号抑制前鳃弓标志物的表达，并且确定的活动水平定位鳃弓标记物的前边界。

RA需要建立后前肠和中肠区域

Pdx1页对胰腺发育至关重要，在HH12时，它标志着后前肠/前中肠水平的内胚层细胞的多能干群体，产生尾胃、十二指肠和背腹胰腺。在HH 4或HH 10条件下用RA处理的胚胎，无论是通过珠子移植还是将RA应用于培养基，都不会表现出任何改变Pdx1型表达式(图4A、B;表1).

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图4

RA对后前肠和中肠结构域的形成至关重要。

胚胎用10⁻⁶M RA在HH 10（B，E）或10的培养基中⁻⁵M AGN193109在HH 4（C，F，G）或HH 8（D，E）阶段的培养基中。每张图片都显示了治疗和分析的确切阶段。前部始终位于顶部。整个底座的腹视图就地表达Pdx1页（A–C）和CdxA公司（D–G）。RA激活对Pdx1页或CdxA公司（B、E）。抑制RA导致完全抑制Pdx1页（C） 和两种不同的表型CdxA公司其表达被完全抑制（F，63%）或向后转移（G，37%）。黑色箭头指向AIP。黑色箭头表示CdxA公司表达式。请注意，F中的胚胎没有正确形成AIP。整个支架的侧视图就地杂交Nkx6.2个在HH8（4个体节）至HH16–17（H–K）阶段的培养基中暴露指示量的AGN193109后。Nkx6.2个胰腺中的表达逐渐减少，而神经系统中的表达则不受影响。暴露于指定量的AGN193109（L–O）后，通过对Pdx1（胰腺和十二指肠，绿色）、Nkx6.1（胰腺和十二指肠亚群，蓝色）和胰高血糖素（α细胞，红色）的全量免疫染色，在HH 19期评估随后的器官发生。前部始终位于顶部。（DP）背胰腺（VP）腹胰腺。

CdxA公司是一种在内胚层中表达的基因，产生小肠。在HH 13/14期，我们发现其前边界正好从AIP的尾部开始(图4D)以双边方式。腹侧和背侧内胚层（分别为肝原基和背侧胰腺原基）为阴性CdxA公司.随着开发的进行，CdxA公司结构域逐渐退化并向尾部延伸。当我们在HH 4或10阶段激活RA信号时，CdxA公司基因表达没有前移(图4E;表1). 因此，仅RA不足以激活Pdx1页和CdxA公司转录超出其内源性表达域。

相比之下，在原肠胚形成和早期体细胞发生过程中抑制RA信号可显著防止Pdx1页表达式(图4C;表2). 胰腺标志物的表达Nkx6.2个AGN193109也以剂量依赖的方式阻断(图4H–K). 这会导致随后的胰腺发育不全或在极端情况下导致胰腺缺失(图4L–O).CdxA公司mRNA要么向后移位，要么完全被抑制(图4F、G,表2). 后一组的大多数胚胎在AIP闭合时也表现出缺陷。这些结果表明，后肠前肠和中肠标志物的表达需要RA。此外，他们证明模式标记的干扰随后改变了器官发生。

RA直接在内胚层发出信号以诱导CdxA公司表达与胰腺形成

维甲酸受体和通路活性报告基因的表达，如Cyp26A1细胞表明内胚层有直接活性。我们通过在内胚层电穿孔显性负维甲酸受体直接解决了这个问题。我们观察到CdxA公司与用对照质粒电穿孔的胚胎（n=16）相比，表达显性阴性受体的内胚层细胞中的表达要么被取消（n=3/11，高度电穿孔胚胎，未显示），要么被下调（n=7/11，低电穿孔胚胎）(图5A-H). 这些结果表明，RA信号直接需要在内胚层CdxA公司表达式。此外，CdxA公司在与表达显性负性视黄酸受体的细胞相距几个细胞直径的邻近内胚层细胞中，表达也受到抑制(图5H). 这表明CdxA公司表达细胞通常需要维持其表达。

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图5

主要负RAR的电穿孔被废除CdxA公司表达和胰腺形成。

电穿孔pCIG（A、B、G、I、K）或pCIG-DNRAR（C–F、H、J、L）。整个底座就地HH 19期胚胎杂交显示CdxA公司在闭合的十二指肠和开放的中肠中表达（蓝色）。CdxA公司DN-RAR部分或完全抑制表达（n=7/11，C）或完全抑制（n=3/11，F）。表达表达结构的细胞通过免疫细胞化学标记双顺反子结构表达的GFP（D、F和H中绿色，用蓝色遮蔽CdxA公司B中染色，G中DAB-棕色），表明抑制延伸到靶细胞的相邻区域。HH 20期胚胎的整体免疫细胞化学显示，显性阴性RAR（用GFP示踪，绿色）以非细胞自主方式（J）抑制胰腺祖细胞的出现（用Nkx6.1示踪，红色），而对照胚胎用空载体（I）电穿孔。胰高血糖素+细胞仍能分化（蓝色）。（K和L）胚胎的选定光学切片分别显示在（I）和（J）中。比例尺200µm。

同样，内胚层显性负RAR电穿孔导致胰腺祖细胞标记物Nkx6.1缺失（n=4），胰腺体积缩小(图5I–L)尽管Pdx1蛋白（n=3）和RNA（n=5）未受影响（数据未显示）。虽然化学抑制胰腺形成可消除胰高血糖素细胞的形成(图4L–O)，观察到大量胰高血糖素阳性细胞，可能是由于电穿孔的晚期。因此，它们不是GFP+。由于腹侧胰腺的靶向性较差，腹侧胰腺对RA的需求无法满足。这些结果表明，RA向内胚层发出的直接信号在后前肠和中肠规范中是必需的。

甲状腺在RA缺乏或极低水平时形成

暴露于外源性RA后，我们发现甲状腺标志物十六进制和Nkx2.1个被压抑。十六进制表达式是必需的Nkx2.1个表达对甲状腺发育至关重要[59]在RA处理中非洲爪蟾或者斑马鱼，十六进制甲状腺中的表达与我们在鸡胚中的结果类似。因此，增加的RA阻止了大多数前内皮细胞对甲状腺素的特异性，这是在缺乏RA或RA水平很低时确定的(图7).

虽然RA抑制甲状腺发育的作用已经在几种物种中进行了分析，但结果仍有一些争议。十六进制在我们的15期胚胎中，当在HH3+之前RA信号丢失时，肝脏和甲状腺之间的表达扩大。这种扩张与肝脏或甲状腺的同一性并不相符Nkx2.1个,前置器和γ-纤维蛋白原在该域中表示。诱导肝脏需要许多信号，这些信号可能在肝脏中缺失十六进制 ⁺肝脏和甲状腺之间的区域。相反，Stafford等人观察到甲状腺功能丧失十六进制维生素A缺乏鹌鹑（VAD）胚胎中的表达[19]使用VAD模拟RA从胚胎发生开始的功能丧失，而我们在早期原肠胚形成期间开始抑制RA。因此，在原肠胚形成之前，可能需要RA来进行后期的甲状腺形成。或者，甲状腺可能在极低浓度RA下形成。VAD模型中RA抑制可能更严重。在HH 5早期分析的抑制剂处理胚胎（HH 3+）显示，与VAD胚胎相似[60]，横向减少十六进制表达式。在HH 5 VAD胚胎中，Wnt抑制剂的表达克雷斯在外侧和最前部的终末内胚层类似下调十六进制RA抑制剂处理的原肠胚中的表达[60]此外，十六进制受原肠化后肠Wnt/β-catenin途径负调控非洲爪蟾胚胎[13]因此，我们推测外周激活的Wnt/β-catenin信号抑制十六进制在缺乏RA信号的情况下横向表达。RA信号丢失对十六进制在其他三种不同观察结果的模型中研究了甲状腺的表达。抑制剂处理后非洲爪蟾胚胎，十六进制表达式未展开[18]。这种扩张可能很难看到，因为青蛙的肝脏和甲状腺表达十六进制靠得很近。在拉尔德2斑马鱼突变胚胎、甲状腺Nkx2.1个向后移位[17]斑马鱼中观察到的后移是有争议的，因为耳泡被用作一个标志物，并且可能自身发生了移位。与我们的实验一致，小鼠的甲状腺发育不需要RA信号[14]–[16],[61]但是十六进制在RA信号缺失小鼠中的表达并没有进行专门研究。

鳃弓RA部位器官分级

我们对鳃弓RA信号活动分级的观察在很大程度上证实了其他物种的报道。当我们在原肠胚形成期抑制RA信号传导时，霍克斯B4在鸡内胚层向后移位。RA活性丧失导致2级放大^第咽弓（PA）和3例缺失^第个和4^第个小鼠体内的PA[14]–[16],[61].霍克斯A1和霍克斯B1在这些小鼠的前内胚层中减少[14],[16].在我们的实验中霍克斯A2未受到RA损失的影响，可能是因为它需要极低水平的RA或在HH3+阶段之前需要RA。

相反，RA在我们的实验中获得的功能发生了改变霍克斯B4和霍克斯A2内胚层的前向表达表明在突变胚胎中咽内胚层异常后向。在Crkl公司-和Tbx1型-缺陷小鼠，外周激活的RA信号通路与异位前表达霍克斯基因也是如此[61]在文昌鱼中，AmphiHox1型已经证明，通过抑制后部前肠/中肠内胚层中咽标记物的表达来调节RA信号的影响[62]我们从鸡胚中获得的结果证实，RA在鳃弓水平上以分级方式作用于前肠。拉尔德2，一种负责RA生成的酶在中胚层后前肠水平有一个尖锐的前边界。RA活动RARE-lacZ公司转基因到达更多的前内胚层区域，直到鳃弓2的水平，这导致了RA在鳃弓中形成扩散梯度的假设(图7). 此外，记者的表情似乎在前肠中分级[14],[21].

胰腺形成需要RA

我们使用显性负RARs在内胚层中使用化学抑制和直接抑制的观察结果揭示了RA信号在鸟类胚胎背胰腺早期发育中的需求，通过表达Pdx1页,Nkx6.2个、Nkx6.1（胰腺祖细胞）和胰高血糖素（分化内分泌细胞）。在其他生物体中也观察到RA对背部胰腺形成的需求，包括非洲爪蟾斑马鱼和老鼠[17]–[21].在我们的实验中Pdx1型-包含胰腺背侧和腹侧以及十二指肠的表达域消失。对小鼠和青蛙腹侧胰腺的影响不太显著[18]与中的观察结果相反非洲爪蟾我们发现，至少在体细胞发生开始之前，幼雏的胰腺发育需要原肠胚形成以外的RA信号。根据这一最新要求Pdx1页胰腺组织中的表达与内分泌分化拉尔德2^−/−小鼠需要RA治疗，直到E 9.5[20],[21]此外，最近通过dnRAR介导的小鼠Pdx1表达细胞中RA信号的抑制表明，RA不仅在早期需要，而且在胰腺规格化后也需要，以维持背侧和腹侧胰腺祖细胞[24]这在我们的电穿孔实验中得到了证实，其中RA抑制发生在Pdx1页表达式。的顺序表达式拉尔德2来自中胚层和拉尔德1胰腺上皮似乎提供RA[24].

在斑马鱼和青蛙中，异位RA信号导致Pdx1页 [17]–[19]这种差异可能与羊膜的不同时间要求、发育中胚胎的物种特定运动，特别是信号中胚层和内胚层之间的转移有关。FGF4可以扩展的事实Pdx1页更靠前[12]表明胰腺区域前方有足够的RAPdx1页表达（除非FGF4诱导RA信号）。因此，胰腺前低水平的RA信号不太可能确定其前边界。此外，分别减少或增加RA信号不会改变Pdx1页在后面或前面。因此，后部内胚层可能存在RA活性梯度，但Pdx1页对这种梯度没有反应。

内胚层直接需要RACdxA公司表达

我们关于小鸡的数据显示，通过两种独立的方法，RA信号是必需的CdxA公司表达式。镉氧化物基因编码同源域转录因子，并被认为是霍克斯神经系统中的表达[63]与我们的观察结果相反CdxA公司同系物Zf-cad1型斑马鱼对RA信号或RAR抑制没有反应[17]在其他物种中进行的实验对于研究这种调节的进化保守性至关重要。有趣的是，在小鼠中胚层和外胚层中Cdx1码表达也需要RA[64]–[67].

我们的实验还证明，内胚层中的直接RA信号传导对于CdxA公司表达式。非细胞自主效应表明，具有不适当RA信号水平的内胚层细胞直接或通过中胚层向其邻居发出信号，以抑制CdxA公司目前尚不清楚RA-low细胞是否缺乏同步体内细胞所需的阳性信号CdxA公司磁场或发送负信号。

RA对最初的肝诱导不是必需的，但对器官发生是必需的

在我们的实验中，RA的消失对肝脏的形成有轻微影响。肝脏发育拉尔德2突变小鼠没有受到影响，因为十六进制和探头1表达仍存在于腹面内胚层，在那里形成肝脏[20],[21]同样，肝脏十六进制在里面非洲爪蟾在RA信号缺失的情况下，VAD胚胎不会受到干扰。与斑马鱼相反，当RA信号丢失且十六进制部分丢失。使用RA-浸泡珠，探头1但不是十六进制或γ-纤维蛋白原被局部抑制。在十六进制^−/−胚胎，探头1保持不变[68]由此，我们得出结论，RA信号不需要定义未来肝脏的位置，而是干扰肝脏的维持或分化程序。

根据AP级别的不同，在不同的时间段需要RA信令

RA治疗后细胞激活基因表达的能力窗口至少从前原肠胚持续到10体节期。然而，用RAR阻断剂AGN193109处理鸡胚表明，对内源性RA信号的反应逐渐丧失，前部结构在后部结构之前变得独立于RA信号。因此，十六进制甲状腺中的表达只有在HH 3+期之前才能改变。霍克斯B4表达，位置更靠后十六进制，在HH 4级仍可以向后移动，但在HH 10级不能向后移动。有趣的是，Wendling等人在7-10体节期（E 8.25左右）观察到一个狭窄的发育时间窗，在这个时间窗中，RA的缺失只会影响3^第个和4^第个小鼠PA结构[14]这表明在哪个阶段沿着AP轴的水平可以受到影响的时间窗口在羊水之间略有不同。Pdx1页当RA信号受损时，后部前肠的表达在4体节期受到抑制，而后期操作（HH 10）不会影响Pdx1页mRNA表达。最后，我们使用的最后面的标记，CdxA，当应用抑制剂阻断RA信号传导时，直到HH10阶段，仍显示出胚胎子集的后移(表2)或在HH 13–14阶段出现显性负RAR电穿孔。因此，内胚层细胞位置越靠后，RA信号需要的时间就越长。由于RA暴露在后部（持续时间）较长或RA暴露时间较晚（后天发育能力延迟），后天细胞可能获得更多的后部特征。我们的结果还表明，羊膜原肠胚形成后还需要RA。非羊膜型和羊膜型患者的肠管管腔形成方式不同。在后一种情况下，折叠将最初位于肠道腹侧更靠前位置的细胞带到更靠后的位置[69]在它们到达最终位置之前，可能需要进行信号传递，以记录背侧和腹侧细胞的AP身份，其中一些细胞将参与相同的器官。

我们还提供了一些支持物理RA梯度的论据：在HH 5和HH 7之间，拉尔德2在鸡胚后半部分呈扇形表达，其前缘位于1^标准索米特和一个拉尔德2-横向低区(图1A和未显示）。RA被认为是通过组织扩散的[69]因此，能够进入RA非合成区域。稳定的前表达边界拉尔德2主张内胚层RA分级暴露于拉尔德2-负性前部和外侧拉尔德2-中肠/后肠细胞起源的低区域(图6). 然后，RA在胚胎前部的细胞内被Cyp26酶降解，允许RA正常抑制的基因表达[70]第二个有利于梯度的观察结果是霍克斯B4经RAR抑制剂治疗后，其BA结构域的表达比中肠中的表达受到更有效的抑制，这表明较高剂量的RA可能无法完全被抑制。同样，CdxA公司RA抑制后，其前部区域被更有效地抑制。在体细胞发生早期，拉尔德2这种表达证明了前体节中RA合成的梯度。拉尔德2随时间向后移动。经双方同意，拉尔夫2在所有体节的E8.5处检测到，而在E9.5处，吻侧体节的表达减弱[71]. The拉尔德2表达数据为RA在背部内胚层的梯度从1到6体节水平提供了证据，而LPE（成为侧肠管和腹肠管）均匀暴露于RA(图6)总之，RA引起的内胚层模式可能是RA暴露持续时间和内胚层特定位置信号浓度共同作用的结果。

我们感谢诺和诺德A/S的John Bondo Hansen合成AGN193109。我们感谢Emilie Gésina、Marine Rentler-Courdier、Karsten Skole Marckström和Tove Funder-Nielsen为原位杂交和免疫化学做出的贡献，也感谢Emiliy Gésina、Marine Lentler-Coordier和Nancy Thompson对手稿的评论。