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美国国家科学院院刊。2009年6月2日；106(22): 9010–9015.
2009年5月18日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0901329106
PMCID公司：2021年9月29日下午
PMID：19451644

干扰素信号受损是人类癌症中常见的免疫缺陷

丽贝卡·克里奇利·托恩,一 戴安娜·西蒙斯,一 宁艳,a、，b条 安德烈亚·米亚希拉,一 弗雷德里克·M·迪巴斯,c（c） 丹尼斯·约翰逊,c（c） 苏珊·M·斯威特,d日 罗伯特·卡尔森,e（电子） 乔治·A·费希尔,e（电子） 阿尔伯特·孔,（f） 苏珊·霍尔曼,b条和彼得·P·李a、，1
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摘要

免疫功能障碍在多种癌症患者中发生，可能导致肿瘤进展和免疫治疗失败。癌症相关免疫功能障碍的机制尚不完全清楚。有效的IFN信号传导对淋巴细胞功能至关重要；缺乏干扰素信号的动物患癌症的几率更高。我们假设干扰素信号改变可能是癌症常见免疫功能障碍的关键机制。为了解决这个问题，我们评估了3种主要癌症患者外周血淋巴细胞对干扰素的功能反应：乳腺癌、黑色素瘤和胃肠道癌。与健康对照组相比，所有3个癌症患者组的T细胞和B细胞中的I型干扰素（IFN-α）诱导的信号减少。所有3个癌症患者组的B细胞中的II型干扰素（IFN-γ）诱导的信号传导均减少，但T细胞或自然杀伤细胞中没有减少。II期、III期和IV期乳腺癌患者的IFN信号受损同样明显，并发现T细胞激活的下游功能缺陷。综上所述，这些发现表明，淋巴细胞干扰素信号缺陷出现在乳腺癌、黑色素瘤和胃肠道癌患者中，这些缺陷可能是免疫功能障碍的常见癌症相关机制。

免疫功能障碍是癌症发展的早期事件，并随着转移疾病的进展而扩大(1). 肿瘤相关抗原（TAA）特异性CD8 T淋巴细胞通常存在于癌症患者的血液中，并在肿瘤部位和肿瘤引流淋巴结中积聚(2). 虽然目前的肽疫苗和其他免疫疗法可以诱导TAA-特异性CD8 T细胞，但这些反应的存在或程度与临床结果或疫苗接种反应并不可靠相关(三–5). 这些细胞可能在体内被特异性地诱导凋亡或无反应，从而阻止对肿瘤细胞的适当激活和细胞溶解反应(6,7). 目前的免疫治疗策略受到癌症和调节性T细胞的免疫抑制作用的影响，这可能是它们迄今为止缺乏成功的原因(4,5). 癌症免疫功能障碍的本质和分子机制尚不明确。对这些机制的阐明将有助于合理设计策略，以逆转免疫功能障碍，使淋巴细胞数量正常化，从而改善对癌症的内源性免疫反应，并提高癌症免疫治疗的效果。

癌症免疫功能障碍的潜在机制包括抗原识别缺陷（第一信号）、协同刺激缺陷（第二信号）和细胞因子缺陷（如干扰素；第三信号）。有效的干扰素信号对于提供第三种信号以实现完全激活、克隆扩展和记忆发育而非耐受至关重要(8)，以及有效的自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性(9). 我们假设干扰素信号受损可能是癌症患者常见的免疫缺陷(10). 本研究旨在确定干扰素信号改变是否是不同类型和分期癌症患者免疫功能的一般机制。本研究的另一个目的是评估哪些外周血白细胞亚群表现出IFN信号缺陷，以及哪些下游IFN刺激的功能反应受到影响。我们通过实时定量PCR评估了3种主要癌症患者外周血淋巴细胞中的IFN信号传导，以测量IFN刺激基因（ISG）的表达，广泛的Phosflow分析和功能分析来测量对IFN的下游反应。STAT1酪氨酸-701-磷酸化（pSTAT1）通过JAK-STAT途径对I型和II型干扰素信号传导至关重要(11); 因此，我们评估了乳腺癌患者、黑色素瘤患者、胃肠道（GI）癌症患者（包括结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌）队列中T、B和NK细胞对IFN-α或-γ的应答，并与年龄匹配的健康对照组进行了比较。我们的分析包括参与肿瘤免疫并可能受到肿瘤负面影响或促进的主要外周血淋巴细胞群，特别是T细胞，包括幼稚、效应和记忆亚群、B细胞和NK细胞。IFN信号在这些细胞类型的适当激活和稳态控制中至关重要，这些细胞类型中受损的IFN信号可能有助于肿瘤进展和混淆免疫治疗方法。

结果

乳腺癌患者淋巴细胞中ISG表达下调。

为了评估癌症患者淋巴细胞中IFN信号通路的完整性，5种主要ISG的表达水平(STAT1（状态1）,国际单项体育联合会44,国际单项体育联合会1,IFIT2、和MX1型)通过实时定量PCR检测乳腺癌患者和年龄匹配的健康对照者外周血淋巴细胞。与对照组相比，乳腺癌患者淋巴细胞中每个ISG的标准化表达水平在统计学上显著降低(图1)表明IFN信号通路的失调。

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乳腺癌患者和健康对照者淋巴细胞ISG表达的实时定量PCR分析。ISG的表达水平STAT1（状态1）,国际单项体育联合会44,国际单项体育联合会1,IFIT2、和MX1型通过实时定量PCR在乳腺癌患者（BC填充圆圈）和年龄匹配的健康对照组（H开平方）的未刺激淋巴细胞中进行了测量。将每个基因的表达归一化为GAPDH。中位数由每个数据集中的条表示。进行双侧Wilcoxon-Mann-Whitney试验，比较乳腺癌患者和健康对照组的ISG表达值；状态1 P= 0.0381,IFI44蛋白= 0.0303,国际单项体育联合会（IFIT1 P）= 0.0480,国际单项体育联合会（IFIT2 P）= 0.0177,MX1 P型= 0.019.

癌症患者淋巴细胞中的干扰素信号受损。

为了证明癌症患者淋巴细胞中IFN信号受损，通过Phosflow在27名乳腺癌患者（II、III和IV期）、12名黑色素瘤患者（III和IV期）、，11名胃肠道癌症患者（II、III和IV期）和28名健康对照(图S1). 与健康对照组相比，IFN-α诱导的乳腺癌、黑色素瘤和胃肠道癌患者T、B和NK细胞pSTAT1的折叠变化减少(图2 A–C)，表明这些癌症患者的主要淋巴细胞群中存在IFN-α信号传导缺陷。这三个癌症患者组的T细胞和B细胞以及乳腺癌患者与健康对照组的NK细胞的减少具有统计学意义（参见图2,表S1]. 黑色素瘤和胃肠道肿瘤患者的NK细胞对IFN-α的反应也表现出相同的降低趋势。IFN-α对乳腺癌和胃肠道癌患者的B细胞、T细胞和NK细胞的影响最大，而黑色素瘤患者的T细胞、B细胞和NK细胞的影响最小，如95%置信区间的下限所测，这反映了患者和对照组之间差异的大小和重要性（参见表S1). 在健康对照组中，T细胞表现出最高的IFN-α诱导的pSTAT1水平，B细胞表现为中等水平，NK细胞表现为最低水平(图S2A类)这为我们检测癌症患者T细胞和B细胞中IFN-α诱导的pSTAT1与健康对照组之间差异的能力增强提供了解释。

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与健康对照组相比，乳腺癌患者、黑色素瘤患者和胃肠道癌患者外周血单个核细胞（PBMC）亚群中IFN-α和IFN-γ刺激的pSTAT1（Y701）fold变化。用1000 IU/ml IFN-α、IFN-γ或未刺激的IFN-γ刺激PBMC，并用Phosflow测定pSTAT1。在来自健康对照组（H开方格）、乳腺癌患者（BC填充圆圈）、黑色素瘤患者（梅尔填充三角形）和胃肠道癌患者（GI x）的T、B和NK细胞中测量IFN诱导的pSTAT1折叠变化。(A类)干扰素-α-BC(B类)α-Mel(C类)干扰素-α-GI(D类)干扰素-γ-BC(E类)干扰素-γ-梅尔(F类)IFN-γ-GI。每个数据集中的中位数用条形表示。采用双侧Wilcoxon-Mann-Whitney试验比较癌症患者与年龄匹配的健康对照组的数值；P（P）-表示小于0.05的值#1P（P）= 0.00077, #2P（P）= 0.00012, #3P（P）= 0.00040, #4P（P）= 0.00420, #5P（P）= 0.04408, #6P（P）= 0.00270, #7P（P）= 0.00003, #8P（P）= 0.00012, #9P（P）= 0.00570, #10P（P）= 0.00190.P（P）-每个比较的95%置信区间（CI）的值和估计差异如所示表S1.

与健康对照组相比，所有3个癌症患者组的B细胞（而非T或NK细胞）对IFN-γ刺激的反应中，pSTAT1诱导显著降低（参见图2 D–F型). 在健康对照组中，B细胞表现出高水平的IFN-γ诱导的pSTAT1，而T细胞和NK细胞表现出极低水平的IFN-γ诱导的p STAT1(图S2B类). 这可能是我们检测癌症患者的B细胞中IFN-γ诱导的pSTAT1差异的能力的基础，而不是检测癌症患者的T细胞和NK细胞与健康对照的差异。

早期和晚期乳腺癌的IFN信号受损同样明显。

为了确定受损的IFN信号是否是癌症分期的功能，对II、III和IV期乳腺癌亚组之间IFN-α和IFN-γ刺激的pSTAT1进行了比较。IFN-α刺激的pSTAT1在各疾病阶段乳腺癌患者的T、B和NK细胞中同样减少(图3 A–C). 在对IFN-γ的反应中，每个阶段乳腺癌患者的B细胞中pSTAT1的倍数变化同样减少，但T细胞或NK细胞中没有(图3 D–F型). 不同阶段患者IFN诱导的pSTAT1无显著差异(表S2). 这些数据表明，淋巴细胞中IFN信号的下调是癌症免疫调节的早期事件，癌症在发展到晚期疾病期间持续存在。

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癌症分期、化疗和T细胞表型对癌症患者和健康对照者中IFN-α和IFN-γ刺激的pSTAT1 fold变化的影响。用IFN-α、IFN-γ或非刺激刺激PBMC，并用Phosflow测定健康对照组（H开方格）、第II期BC患者（BC II填充钻石）、第III期（BC III开放圆）、第IV期（BC IV填充圆）疾病、未治疗BC患者（BC-）T、B和NK细胞中的pSTAT1，接受化疗（BC+）的BC患者和III-IV期黑色素瘤患者（Mel填充三角形）。根据CD27和CD45RA的表达对天真、效应和记忆T细胞亚群进行门控。(A类)干扰素-α-T细胞；(B类)干扰素-α-B细胞；(C类)干扰素-α-NK细胞；(D类)干扰素-γ-T细胞；(E类)干扰素-γ-B细胞；(F类)IFN-γ-NK细胞；(G公司)来自未经治疗（BC-）或化疗（BC+）的BC患者的IFN-α-T、B和NK细胞；(H（H）)BC-或BC+患者的IFN-γ-T、B和NK细胞；(我)干扰素-α-朴素、效应和记忆T细胞；(J型)干扰素-γ-朴素、效应器和记忆T细胞[(A–H)BC患者(I–J型)梅尔患者）。中位数由每个数据集中的条形图表示。进行双侧Wilcoxon-Mann-Whitney试验，比较癌症患者与年龄匹配的健康对照组的数值；P（P）-表示小于0.05的值#1P（P）= 0.00447, #2P（P）= 0.03327, #3P（P）= 0.03985, #4P（P）= 0.00077, #5P（P）= 0.02690, #6P（P）= 0.01180, #7P（P）= 0.01107, #8P（P）= 0.00108, #9P（P）= 0.00286, #10P（P）= 0.01019, #11P（P）= 0.01349, #12P（P）= 0.00069, #13P（P）= 0.04490, #14P（P）= 0.00037, #15P（P）= 0.00764, #16P（P）= 0.00339, #17P（P）= 0.00527, #18P（P）= 0.00233, #19P（P）= 0.00131, #20P（P）= 0.01806, #21P（P）= 0.03107. 黑色素瘤患者和健康对照组的T细胞表型频率没有显著差异。P（P）-每个比较的值和95%置信区间的估计差异如所示表S1A类.

干扰素信号的缺陷不受化疗的影响。

为了确定干扰素信号的损伤是否由化疗引起或影响，将乳腺癌患者分为化疗治疗（分析前至少3周进行新辅助/辅助化疗）和未接受任何系统治疗的患者。治疗组和未治疗组之间IFN-α或IFN-γ诱导的pSTAT1无差异，且两个亚组与健康对照组相比，IFN-诱导的pTAT1均显著降低(图3 G–小时，请参阅表S1A类和第2页). 除1例外，所有IV期患者均接受化疗，而只有1例II期患者接受化疗；然而，这两个亚组在pSTAT1诱导方面没有显著差异（参见表S2). 为了评估同一疾病阶段患者的化疗效果，将III期患者分为新佐剂治疗组和未治疗组。IFN-α或IFN-γ诱导的pSTAT1水平在这些亚组之间没有差异(图S3). 综上所述，这些数据表明，乳腺癌患者外周血淋巴细胞中IFN信号受损并不是因为化疗或化疗的影响。

记忆、效应器和幼稚T细胞中存在干扰素信号缺陷。

为了确定T细胞中IFN-α信号的缺陷是全局性的还是对可能经历过TAA的效应/记忆细胞特异性的，对来自黑色素瘤患者和健康对照的原始、效应和记忆T细胞中的IFN-诱导的pSTAT1水平进行了测量（选通策略如图S1). 干扰素α诱导的pSTAT1在幼稚、效应和记忆T细胞中减少。记忆和效应T细胞的减少具有统计学意义(图3我并查看表S1B类)来自黑色素瘤患者，而原始T细胞表现出相同的趋势。

下游功能响应中的缺陷。

为了研究干扰素信号受损的下游效应，将乳腺癌患者T细胞的激活反应与健康对照组进行比较。用抗CD3/抗CD28抗体涂层珠单独或与IFN-α或-γ联合刺激淋巴细胞。流式细胞术检测CD25作为一般激活标记物的表达，HLA-DR、CD95和CD54作为IFN进一步诱导的激活标记物，以及激活诱导的细胞死亡（AICD）。乳腺癌患者的T细胞表现出CD25、HLA-DR、CD54和CD95的表达降低，这是对单独刺激抗CD3/CD28以及与IFN-α或γ联合刺激的反应(图4 A–D,表S3). 与健康对照组相比，乳癌患者T细胞中IFN在抗CD3/CD28激活的T细胞中额外诱导CD95的作用降低(P（P）IFN-α=0.02，P（P）IFN-γ=0.05）(图4E类). 当通过多变量分析进行综合考虑时，这些激活标记物的表达水平在单独使用抗CD3/CD28刺激的T细胞和与IFN-α联合使用的乳腺癌患者与健康对照组的T细胞中高度相关并显著降低（参见表S3). 这些结果表明，乳腺癌患者T细胞中IFN信号受损，导致启动适当的完全激活所需的第三个信号转导不良。

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乳腺癌患者和健康对照者中抗CD3/CD28抗体和IFN-α或IFN-γ刺激的T细胞活化标记物的表达和凋亡。分别用抗CD3和抗CD28抗体包被珠单独或IFN-α或-γ刺激BC患者（填满的圆圈）和健康对照（开方格）的淋巴细胞，或不刺激。48小时后，用FACS测定CD25、HLA-DR、CD54、CD95、Annexin V（Anx）和ViViD（Viv）阳性T细胞百分比(A类)%CD25+；(B类)%HLA-DR+；(C类)%CD54+；(D类)%CD95+；(E类)干扰素诱导%CD95+活化T细胞的变化（在用抗CD3抗CD28加IFN-α或-γ刺激的条件下，%CD95+-在只用抗CD3-抗CD28刺激的条件中，减去%CD95+/-）；(F类)%Anx+Viv+（Anx和Viv均阳性的所有T细胞）。中位数由每个数据集中的条形图表示。采用双侧Wilcoxon-Mann-Whitney试验比较乳腺癌患者和健康对照组的数据；P（P）-表示值≤0.05#1P（P）= 0.004, #2,P（P）= 0.020, #3P（P）= 0.018, #4P（P）= 0.016, #5P（P）= 0.018, #6P（P）= 0.053. 多元分析如所示表S3.

由于抗CD3/CD28刺激，AICD在乳腺癌患者T细胞中的表达高于健康对照组(图4F类，请参阅表S3)而抗CD3/CD28加IFN-α或-γ的刺激导致乳腺癌患者T细胞凋亡减少。在健康T细胞中，由于抗CD3/CD28加IFN-α与单独抗CD3/CD28刺激，凋亡细胞百分比之间没有显著差异(P（P）=0.078），而在乳腺癌中，由于抗CD3/CD28加IFN-α与单独抗CD3/CD28相比，凋亡的T细胞百分比显著降低(P（P）= 0.036). 这些结果表明，由于干扰素信号受损，乳腺癌患者（比健康对照组）的淋巴细胞活化诱导凋亡的程度更高，这可以通过干扰素-α来挽救。

讨论

免疫功能障碍在许多癌症患者的早期阶段和转移性疾病的整个发展过程中都有记录；细胞和分子机制尚不清楚。为了发展完全适应性免疫反应，需要3个信号：抗原（第一个信号）、协同刺激（第二个信号）和可由I型干扰素提供的细胞因子信号（第三个信号）。我们假设干扰素信号改变可能是癌症常见免疫功能障碍的关键机制。在本研究中，我们研究了IFN信号通路在II、III和IV期乳腺癌患者、III和Ⅳ期黑色素瘤患者以及II、III、IV期胃肠道肿瘤患者淋巴细胞中的功能。通过实时定量PCR，我们发现在直接体外实验中，与健康对照组相比，乳腺癌患者外周血淋巴细胞中5种主要ISG的表达水平下调，表明乳腺癌患者体内淋巴细胞中IFN信号缺陷。通过广泛的Phosflow分析，我们证明在所有3个癌症患者组的T细胞和B细胞以及乳腺癌患者的NK细胞中，pSTAT1对IFN-α的诱导作用显著降低。黑色素瘤和胃肠道肿瘤患者的NK细胞表现出相同的干扰素-α信号受损趋势。在对IFN-γ的反应中，来自所有3个癌症患者组的B细胞中pSTAT1的诱导显著下调，但在T细胞或NK细胞中没有。这些结果表明，淋巴细胞群中受损的I型和II型干扰素信号是多种主要癌症类型的常见缺陷。

每个淋巴细胞亚群对IFN-α和IFN-γ的反应水平不同。在IFN-γ刺激的细胞中，细胞类型之间的差异最为显著：B细胞表现出高水平的IFN-γ诱导的pSTAT1，而T细胞和NK细胞对IFN-γ的反应仅表现出最小的pSTAT1诱导。这可以解释为什么在癌症患者的T细胞和NK细胞中不能检测到IFN-γ诱导的pSTAT1的差异。在淋巴细胞亚型（T细胞、B细胞和NK细胞）之间观察到的IFN诱导的pSTAT1活化的差异，可能是由于每种细胞类型表面的I型和II型IFN受体的IFN结合和信号传递成分的密度不同所致，或细胞类型之间STAT1信号级联控制的变化(12,13).

IFN信号受损在患有II、III和IV期疾病的乳腺癌患者中很明显，表明这是癌症免疫功能障碍的早期机制，在整个肿瘤进展到转移性疾病的过程中持续存在。此外，在接受新辅助或辅助化疗的乳腺癌患者和尚未接受任何系统性治疗的患者中同样观察到这种缺陷，这表明化疗不会导致或影响癌症患者观察到的干扰素信号障碍。黑色素瘤患者T细胞的记忆和效应亚群中，STAT1对IFN-α的反应减少最为明显，但原始T细胞也表现出同样的趋势，表明T细胞中有缺陷的IFN信号可能是全局性的，影响抗原经验记忆细胞和无经验原始细胞。

乳腺癌患者的T细胞表现出活化标记CD25、HLA-DR、CD54和CD95[干扰素诱导死亡受体（FAS）]的表达降低，这是对单独或与干扰素联合刺激CD3和CD28的反应，证明下调的IFN信号与T细胞激活的下游功能损伤相关。这些发现代表了癌症患者中观察到的导致无反应性和无法建立有效抗肿瘤免疫的机制，并为癌症免疫治疗带来了障碍。当仅用抗CD3和抗CD28抗体或与干扰素联合刺激时，乳腺癌患者的T细胞也表现出非调节性生存反应，进一步证明癌症患者T细胞中干扰素信号受损会导致下游功能后果，影响适当的体内平衡。我们观察到乳腺癌患者IFN刺激的活化T细胞中CD95表达降低，这可能解释了乳腺癌患者中IFN诱导的T细胞凋亡降低。在这些条件下，乳腺癌患者活化的T细胞对CD95介导的凋亡不太敏感，因此可以部分保护其免受细胞活化的凋亡影响。对干扰素的正常反应是通过调节AICD和生存来实现T细胞稳态的必要条件；正如我们所表明的，受损的IFN信号传导和由此导致的激活反应的失调可能与癌症患者淋巴细胞群的稳态改变有关(14,15).

干扰素支持T和B淋巴细胞的活化和克隆扩增(16–18). 在NK细胞中，干扰素激活NK细胞的确切机制尚未阐明，但已经证明干扰素信号对NK细胞最佳功能至关重要(19). 癌症中淋巴细胞的无反应性或无能已被证明部分是由CD3ζ链和T细胞受体信号级联的其他信号成分的降解引起的(20,21). 其他外周血免疫过程，如B细胞受体信号和炎症反应，也被证明在癌症状态下受到影响(22)并可能导致免疫功能障碍。如我们的研究所示，干扰素信号受损代表了对癌症状态下细胞凋亡调节改变和一般免疫无反应机制的进一步深入了解，这两者都是肿瘤诱导免疫功能障碍的关键方面。干扰素对STAT1的低激活将导致启动淋巴细胞效应器和记忆功能的适当激活和存活反应所需的第三个信号转导不良。对IFN-α的低反应也可能损害CD8 T细胞和NK细胞的细胞毒性功能，因为IFN-α诱导穿孔素和颗粒酶的表达，而这些在癌症患者血液中的效应细胞中含量较低(23).

癌症患者淋巴细胞中STAT1对干扰素的反应受损，可能是干扰素信号通路成分（包括干扰素受体、JAK1、Tyk2和负调控因子）功能缺陷的结果。黑色素瘤患者与健康对照组淋巴细胞中IFN受体亚单位STAT2、JAK1、JAK2和Tyk2的基因表达水平无显著差异(10); 然而，这些成分的功能改变可能与干扰素导致STAT1磷酸化受损有关。干扰素信号的负调控是通过蛋白酪氨酸磷酸酶发生的，例如含有Src同源2-的磷酸酶-1和-2以及CD45，它们是组成性表达的活化STATS的蛋白抑制剂，是细胞因子信号的早期调节器(24)细胞因子信号的抑制物，形成快速的经典负反馈回路来调节JAK-STAT信号(25). 癌症患者外周血细胞因子谱的改变可能与癌症患者淋巴细胞中IFN信号受损的机制有关。肿瘤细胞、肿瘤相关白细胞、调节性或抑制性外周血白细胞（如Tregs和髓源性抑制细胞）产生的多种细胞因子，如IL-4、IL-10和TGF-β1，能够诱导IFN信号负调控因子的表达(26–30)，可能是癌症患者淋巴细胞IFN信号受损机制的一部分。免疫抑制生长因子，如癌症患者血液中升高的VEGF，也可能通过抑制树突状细胞成熟或促进髓源性抑制细胞间接参与IFN信号的解除调节(31)进而产生细胞因子，可能干扰淋巴细胞中的干扰素信号。

干扰素信号受损可能阻碍旨在刺激抗肿瘤免疫的治疗方法，因为免疫治疗策略需要功能性免疫激活(32,33). 评估淋巴细胞中的干扰素信号可能提供一种选择癌症患者进行干扰素治疗与替代治疗的方法。对癌症患者在治疗期间、无病期和复发时的IFN信号传导的纵向研究对于确定IFN信号传导功能障碍的动力学和评估IFN反应在预测疾病存在和对基于IFN的治疗的反应中的效用将是重要的。我们的结果表明，纠正这种干扰素信号缺陷的策略将提高癌症免疫治疗的疗效。由于在多发性硬化症和慢性丙型肝炎感染中都观察到IFN信号被解除调控，因此这种策略可能扩展到免疫功能障碍是潜在因素的其他情况(34,35)通常采用干扰素治疗。在慢性丙型肝炎感染中，与其他种族的患者相比，非裔美国人对干扰素治疗的反应较低，这表明种族可能会影响干扰素信号的功能(35). 本研究中的患者来自不同种族，包括白种人、西班牙裔、非裔美国人、亚洲人和其他人，这表明干扰素信号的缺陷与癌症有关，而与本研究中种族无关。

总之，我们已经确定了三种主要癌症常见的免疫缺陷。我们已经证明，乳腺癌、黑色素瘤和胃肠道癌患者T和B细胞中的IFN-α信号减少，B细胞中IFN-γ信号减少。我们进一步证明，这种缺陷在II、III和IV期乳腺癌患者中同样明显，并且不受化疗的影响。我们的研究结果表明，干扰素信号受损是癌症患者免疫功能障碍的早期、持续和全局机制。这些发现代表了对癌症免疫功能障碍的重要认识，并可能导致新的策略来纠正癌症患者的这种功能障碍，并提高癌症免疫治疗策略的成功率。

方法

患者和健康供者样本。

PBMC来自32例美国联合癌症委员会（AJCC）II、III和IV期乳腺癌患者，12例AJCC III和IV级黑色素瘤患者[一个独立于先前研究的黑色素瘤队列的新队列(10)]以及11名II至IV期胃肠道癌患者（斯坦福大学医学中心），并获得知情同意。还从28名年龄匹配的健康献血者（斯坦福血液中心）获得PBMC。PBMC在90%NCS 10%DMSO中冷冻保存。这些实验得到了斯坦福大学机构审查委员会的批准。年龄、性别、疾病、阶段和治疗数据如所示表S4,表S5,表S6、和表S7.

ISG表达的实时定量PCR测量。

将来自乳腺癌患者和年龄匹配的健康对照组的卵泡蛋白保留的PBMC解冻并放置在10%的IMDM FBS中过夜。使用RosetteSep粒细胞和单核细胞去除鸡尾酒对淋巴细胞进行负向富集（干细胞技术）。清洗细胞并重新放置（≈106用小鼠抗人CD3-FITC、CD19 APC和CD14-PE[Invitrogen（Caltag）]染色小份，以检查淋巴细胞的富集情况。使用TRIzol（Invitrogen）分离RNA，使用RiboGreen RNA定量试剂（Invit罗gen）定量，并根据制造商的说明使用Omniscript RT Kit（Qiagen）合成cDNA。使用Quantitect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）和iCycler热循环器（Bio-Rad）进行定量RT-PCR分析。引物序列STAT1（状态1）,国际单项体育联合会44,国际单项体育联合会1,IFIT2、和MX1型之前描述过(10). 所有呈现的基因表达数据均归一化为每个样本的GAPDH水平。

干扰素刺激和STAT1-pY701的检测。

冷冻保存的PBMC在含有10%FBS的IMDM中解冻、广泛洗涤并放置过夜。PBMC在5%人AB血清（HS）中浓缩、洗涤并重新悬浮至3×10650μl的细胞/试验，并用以下小鼠抗人单克隆抗体CD16 PE、CD3 PE-Cy7、（BD Biosciences）、CD19 PE-TR、CD27 FITC和CD45RA PE（Invitrogen）的组合染色30分钟。然后，向每个试验中添加1.45 ml IMDM 5%HS，每管细胞分为500μl，并在37°C 7%CO下休息2将干扰素-α或-γ（NIAID参考试剂库和R&D系统）添加到1000 IU/ml中，并在37°C下培养细胞15分钟。用3%福尔马林固定细胞10分钟，37°C。将固定的细胞在5ml PBS中洗涤两次，在室温下在1ml 1×Custom Perm Buffer-PBMC（编号643435，BD Biosciences）中透化30分钟，并在染色缓冲液（1×PBS，2%FBS，0.09%叠氮化钠）中洗涤两次。细胞在染色缓冲液中再次悬浮至50μl，用7μl抗STAT1-pY701 Alexa Fluor 647（BD Biosciences）、CD45RA PE在室温下染色60 min，在染色缓冲溶液中洗涤两次，并使用FACS Aria（BD bioscience）进行分析。Phosflow方法能够敏感、定量地检测小型临床样本中多个细胞群的磷酸化事件。Custom Perm Buffer−PBMC（BD Biosciences）是一种新配方的磷流渗透缓冲液，能够以高信噪比优化pSTAT1染色，同时保留用于检测细胞亚群的细胞表面抗体的荧光（参见图S1).

在静止和抗CD3/CD28刺激的PBMC中测量IFN刺激的激活、增殖和凋亡。

将来自乳腺癌患者和健康对照者的冷冻保存的PBMC解冻，广泛清洗，并在10%的IMDM FBS中休息一夜。使用RosetteSep粒细胞和单核细胞消耗鸡尾酒（StemCell Technologies）纯化淋巴细胞，并在PBS中清洗。用CD3-FITC、CD19 APC、，和CD14 PE[Invitrogen（Caltag）]单克隆抗体，并通过FACS测定以确定CD3+淋巴细胞的百分比。细胞在2到5×10的条件下进行电镀5IMDM中的细胞/孔，10%FBS，2%HS，96 well板，并用Dynabeads CD3/CD28 T细胞扩张器珠（Invitrogen）以1:10的珠与T细胞比率刺激，或以1000 IU/ml的IFN-α或-γ刺激，或不刺激细胞。细胞在37°C 7%CO下培养2然后在室温下用CD3 PE-AF700、HLA-DR Pacific Orange（Invitrogen）、CD25 PE-Cy7、CD95 PE、CD54 APC mAbs（BD Biosciences）和活/死固定紫-死细胞染色试剂盒（Invit罗gen）对细胞染色30分钟。细胞在Annexin V结合缓冲液（BD bioscience）中洗涤，并用Annexin-V Cy5.5（BD生物科学）染色在室温下保持15分钟。使用FACSAria分析细胞。

流式细胞术数据分析。

使用Flowjo 8.2（Treestar）分析FCS文件。计算IFN-α和IFN-γ刺激细胞和非刺激细胞的STAT1 pY701-Alexa Fluor 647染色的平均荧光强度（MFI）。STAT1 pY701染色的折叠变化是通过将受刺激细胞的MFI除以未受刺激细胞MFI来计算的。CD54的百分比+，CD25+，CD95+和HLA-DR+使用Flowjo 8.2中的人口比较平台计算细胞。

统计分析。

使用R统计软件包（R统计计算基础）和Prism（GraphPad）分析数据。全部P（P）-数值来自双侧Wilcoxon-Mann-Whitney检验。R中的Wilcox_test函数用于计算精确的P（P）-对癌症患者和年龄匹配的健康对照组进行了比较。乳腺癌患者（52.4，SD 11年）和黑色素瘤患者（50.0，SD 14.8年）的平均年龄无统计学差异，将这些患者的Phosflow数据与年龄匹配的健康对照组（平均54.0，SD 12.4年）进行比较。在健康对照组或癌症患者中，男性和女性之间IFN诱导的pSTAT1水平没有显著差异（参见图S2); 因此，将乳腺癌患者（均为女性）与混合性别健康对照组进行比较。胃肠道癌患者的平均年龄（66岁，SD 12.5岁）高于总健康对照组；因此，将胃肠道患者的Phosflow数据与年龄匹配的健康对照亚组（平均年龄60.8岁，SD 9.4岁）进行比较。对于多元分析，使用R中的princom（）函数应用标准主成分分析；然后，沿第一主成分进行常规的曼希特尼检验(36).

补充材料

支持信息：

致谢。

我们感谢David Parks博士和斯坦福大学FACS设施使用BD FACSAria进行流式细胞术的帮助，以及BD Biosciences为Phosflow定制Perm缓冲液提供的帮助。我们感谢Jeffery A.Norton博士、Robin M.Cisco博士和Laurie Ann Columbo博士从胃肠道癌症患者获得PBMC样本，并感谢Gerald Lee处理这些样本。这项工作由国防部希望时代学者奖BC0516650（发给P.P.L.）和国家卫生研究院拨款R01 GM086884-2（发给S.H.）资助。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0901329106/DC补充.

工具书类

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