晚期糖化终产物通过一氧化氮依赖性抑制细胞色素抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌c（c）氧化酶和三磷酸腺苷的合成

AGE修饰牛血清白蛋白的制备

AGE-BSA根据标准方案制备(26). 简单地说，低脂多糖和无脂肪酸BSA（50 mg/ml）与0.5米0.2中的葡萄糖米磷酸钠缓冲液（pH 7.4）在37℃下在无菌条件下持续8周。在无葡萄糖的相同条件下，通过培养BSA制备非糖化BSA。通过对PBS的彻底透析去除未结合的糖。将所有制剂通过内毒素结合亲和柱。用抗Nε-（羧甲基）赖氨酸（CML）的特性良好的单克隆抗体（4G9；Alteon，Northvale，NJ）通过ELISA检测AGEs水平(26). 如前所述，AGEs的CML单位是根据普遍可用的标准正常人血清定义的。一个AGE单位被定义为竞争性AGE-ELISA中1:5稀释正常人血清产生的50%抑制(26). 每种制剂的AGE值通过标准曲线的线性回归确定，并以U/mg表示。

动物和AGE-BSA管理

六个月大的C57BL/6J小鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）被随机分为对照组（BSA）和AGE组（每组六只雄性和六只雌性）。每日两次ip BSA（200μg/g体重）或AGE-BSA（12 U/g体重）、24 U/g和60 U/g，持续2周。该方案基于一次注射AGE-BSA（24 U/g）后的AGE-BSA清除曲线。AGE-BSA峰值出现在1-3小时内，约50%在5小时后仍然存在（补充图1，作为补充数据发布在内分泌学会期刊在线网站上，网址为http://endo.endojournals。组织）。所有小鼠均置于受控条件下：23±1℃，光照12小时，黑暗12小时。他们可以自由享用标准的啮齿动物食物和水。所有动物研究均按照西奈山医学院动物护理和使用委员会机构指南中概述的政策进行。

血清AGEs的测定

如前所述，使用与CML样表位（4G9）反应的单克隆抗体通过竞争ELISA测定小鼠血清中的AGE浓度(26,27). AGE-BSA被用作竞争抗原，以生成每次实验的AGE-标准曲线（0.1–100 AGE U/ml）。通过标准曲线的线性回归计算AGE值。

糖耐量试验和血清胰岛素水平

在AGE-BSA治疗2周后进行腹膜内葡萄糖耐量测试。在隔夜禁食后，给小鼠腹腔注射10%葡萄糖（2毫克/克体重），并由血糖仪Elite（Bayer Corp.，Elkhart，IN）在0、30、60、90和120分钟时测定血糖水平(28). 为了测量血清胰岛素水平，在葡萄糖负荷后，在0、30和60分钟时从下颌下动脉采集血液，并使用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Crystal Chem）测定胰岛素水平。

胰岛素耐受性试验（ITT）

AGE-BSA治疗2周后进行ITT(13). 禁食6小时后，将人类常规胰岛素（0.75 U/kg）（西格玛化学）ip给自由饮水和进食的小鼠。每隔15分钟采集一次注射胰岛素前后尾部的血样，持续120分钟，并测定血糖水平。

免疫组织化学分析

每组三个不同胰腺（BSA 0.2 mg/g、12 U/g和24 U/g，体重）的4μm切片幻灯片用标准苏木精/伊红（HE）染色，或用兔抗胰岛素抗体用胰岛素/胰高血糖素双重染色（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物科技公司）和兔抗葡聚糖抗体（Dako Corp.，Carpindia，CA）(28). 用苏木精和Cytoseal二甲苯基安装介质（斯蒂芬斯科学公司，卡拉马祖，密歇根州）对载玻片进行复染，以便通过光学显微镜（放大倍率，×100）进行可视化。

分离胰岛和INS-1细胞的培养和AGE处理

根据Lacy和Kostianovsky的方法，通过Liberase（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）消化、间断Ficoll梯度分离和手动拾取从C57BL/6J小鼠胰腺中分离出胰岛(29)如前所述进行了修改(28). 将6个月龄正常C57/BL6小鼠的新鲜分离胰岛培养在细胞外基质涂层板中，在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，2 m米 我-谷氨酰胺，1%丙酮酸钠，50μ米β-巯基乙醇、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。这些条件允许胰岛附着在盘子上并扩散，并保持其功能完整性(30). 接种后两天，在大多数胰岛附着并开始变平后，将培养基改为补充2 m的RPMI 1640培养基米 我-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，含有BSA（0.5 mg/ml）或60和120 U/ml的AGE-BSA，与糖耐量试验异常的AGE处理小鼠的血清AGE水平相对应，并且与这些遗传或饮食诱导糖尿病小鼠模型中观察到的AGE浓度非常相似(13,15). 48小时后收集培养基和胰岛进行进一步实验。按照说明培养INS-1细胞(28,31)如前所述，用BSA或AGE-BSA治疗。

胰岛素分泌和含量的测定

将分离的胰岛或INS-1细胞置于含有500μl Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液的玻璃瓶中培养2 h，并补充10 m米HEPES，2 mg/ml BSA，1.7 m浓度米含5%CO的增湿空气中的葡萄糖₂37℃，然后在1.7或16.7 m的温度下在37℃下进一步培养60 min米葡萄糖。孵育结束时，取出培养基并储存在−20 C下，以进行胰岛素测定。在Hanks溶液中短暂清洗胰岛，并在200μl酸性乙醇（70%乙醇中15 ml 12 mol/l盐酸）中超声均质30秒，然后在4℃下提取过夜。将提取物储存在−20℃下，用于胰岛素测定。使用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定培养基和胰岛提取物中的胰岛素浓度，并用总蛋白归一化。

细胞内ATP含量的测量

对INS-1细胞或胰岛进行与胰岛素分泌相同的处理。在用含有刺激性葡萄糖浓度的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液培养1 h后，在Hanks溶液中短暂清洗INS-1细胞或胰岛，用50μl三氯乙酸（5%）悬浮，然后立即用塑料均质器均质。悬浮液以2000 rpm的转速旋转，上清液以−80 C的温度储存。根据制造商的说明，使用ENLITEN r荧光素酶/荧光素试剂测量细胞内ATP含量。简单地说，用10μl 4将样品中和至pH 7.4米将Tris、10μl和90μl不含ATP的水注入新试管中。在20/20n光度计（Turner BioSystems，Inc.，Sunnyvale CA）中进行5秒测量之前1秒加入萤光素酶试剂。ATP浓度通过与ATP标准曲线进行比较来确定。上清液蛋白质含量用DC蛋白质测定试剂盒测定，并用于标准化ATP水平。

NO和细胞色素的测定c（c）氧化酶活性

用BSA或AGE-BSA处理新鲜分离的胰岛，有无1m米L-NAME或2米米AG 48小时。用线粒体/细胞溶胶分离试剂盒（加州山景城BioVision）分离线粒体。根据制造商的说明，使用硝酸盐测定试剂盒测量释放的NO。细胞色素c（c）用细胞色素测定分离线粒体中的氧化酶活性c（c）氧化酶分析试剂盒（Sigma Chemical），用于监测铁细胞色素的氧化c（c）550 nm。用DC蛋白检测试剂盒测定线粒体制剂中的蛋白质浓度。细胞色素c（c）氧化酶活性表示为μmol/min/mg蛋白。

RT-PCR分析

使用RNeasy Mini Kit从接受或不接受AGE-BSA治疗的小鼠的胰岛中提取总RNA，并根据制造商的说明进行RT-PCR。使用Integrated DNA Technologies（Coralville，IA）SciTools设计iNOS特异性引物：正向5′-TCTTTTGACGCTCGGAACTGAGGCA-3′，反向5′-TAGGTCGATGCACAACTGGGTGAA-3′。带强度由基于Java的图像处理程序ImageJ（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）进行量化。

蛋白质印迹分析

用0.5mg/ml BSA、60U/ml和120U/ml AGE-BSA处理胰岛，48小时后收集，并在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解(28). 含有60μg蛋白质的等分样品在8%SDS-PAGE上进行解析。电泳后，蛋白质被印在硝酸纤维素膜上，用兔抗iNOS多克隆抗体进行探测，然后用辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG进行孵育。iNOS蛋白用增强化学发光Western印迹检测试剂检测，每条带的强度用ImageJ定量。

AGE治疗降低胰岛胰岛素分泌和胰岛胰岛素含量

为了确定小鼠服用AGEs是否会影响胰岛结构，我们检查了胰岛形态。免疫组织化学分析显示，2周AGE治疗后胰岛几乎没有形态学变化（图2A​2A）。). 接下来，我们从用BSA或AGE-BSA治疗的小鼠中分离出胰岛，并分析其分泌胰岛素的能力以及胰岛素含量。如图2B所示​2B、，，从接受12或24 U/g AGE-BSA治疗的小鼠中分离出的胰岛对葡萄糖的反应显著减少（16.7 m米)与单独用BSA处理的小鼠胰岛相比。此外，胰岛的胰岛素含量与给小鼠注射AGE-BSA的剂量呈负相关（图2C​2摄氏度).

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图2

AGEs对胰岛功能的影响体内胰岛的免疫组织化学分析。BSA或AGE-BSA处理的小鼠的三种不同胰腺的4μm切片的载玻片用标准HE和抗胰岛素+胰高血糖素抗体染色，如图所示（放大倍数×100）。用BSA（0.2 mg/g，体重）或AGE-BSA（12和24 U/g，体重）处理2周的小鼠分离胰岛，然后用1.7或16.7 m米然后收集培养基中的葡萄糖用于测定胰岛素分泌（B），收集胰岛用于测定胰岛素含量（C）。数据以平均值±表示扫描电镜三个独立实验的结果，P（P）与对照组相比<0.05。

验证这些结果在体外，我们用增加浓度的AGE-BSA处理6个月龄正常C57BL/6小鼠新鲜分离的胰岛48小时，并评估其对葡萄糖刺激分泌胰岛素的能力。如图3A所示​3A、，显示异常葡萄糖耐量测试的AGE处理小鼠的血清AGE水平对应的60和120U/ml AGE-BSA抑制了这些胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。进一步分析表明，经AGE-BSA处理的胰岛中的胰岛素水平比对照胰岛低约30%（图3B​3B）。). 这些结果与我们观察到的一致体内进一步表明，小鼠体内AGE水平升高会抑制急性胰岛素分泌，以应对葡萄糖刺激，并降低β细胞中的胰岛素生成。

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图3

AGEs对胰岛功能的影响在体外将正常C57/BL6小鼠新鲜分离的胰岛在BSA或AGE-BSA存在下培养48 h，然后用1.7或16.7 m米然后收集培养基用于胰岛素分泌试验（A），收集胰岛以测量胰岛素含量（B）。数据以平均值±表示扫描电镜三个独立实验的结果，P（P）与对照组相比<0.05。

AGE治疗抑制胰岛ATP生成

需要增加ATP与ADP的比率以响应葡萄糖刺激来关闭ATP-依赖性K⁺胰岛素分泌准备中的通道和去极化细胞膜(32). 由于AGEs抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，我们检测了用BSA或AGE-BSA（60和120 U/ml）治疗的胰岛中的ATP水平。如图4A所示​4A、，，葡萄糖刺激导致AGE-BSA处理的胰岛和INS-1细胞中的ATP水平显著低于BSA处理的胰岛和INS-1细胞中的ATP水平。因为AGE处理细胞中ATP水平的降低可能无法有效地关闭ATP-依赖性K⁺葡萄糖刺激导致胰岛素分泌减少的通道，我们检测了GP，一种抑制ATP-依赖性K⁺通道，可以克服AGEs对胰岛素分泌的抑制作用。如图4B所示​4B、，添加GP后，AGE处理的胰岛和INS-1细胞完全恢复了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。这些发现表明，AGE治疗抑制胰岛β细胞分泌胰岛素所需的葡萄糖刺激的ATP生成。

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图4

AGEs对ATP生成的影响。A、 将从正常C57/BL6小鼠和INS-1细胞中分离的胰岛用RPMI 1640在0.5 mg/ml BSA（对照）或AGE-BSA存在下培养48 h。用16.7 m米葡萄糖1小时，然后收集用于ATP含量测定。B、 胰岛素分泌测定。用0.5 mg/ml BSA或AGE-BSA（120 U/ml）处理胰岛和INS-1细胞48小时。然后用1.7或16.7 m米血糖或GP（按指示持续1小时）。数据通过总蛋白和胰岛素分泌率（16.7:1.7 m）进行标准化米葡萄糖）表示为平均值±扫描电镜三个独立实验的结果，P（P）与对照组相比<0.01。#，P（P）与60 U/ml AGEs治疗组相比，<0.01。

AGE治疗刺激胰岛iNOS的表达和NO的产生

AGEs刺激内皮细胞和巨噬细胞iNOS的表达(33,34,35,36). 有趣的是，iNOS的表达与细胞因子诱导的胰岛功能障碍有关(37,38). 为了研究AGEs是否诱导小鼠胰岛iNOS的表达，我们用BSA或AGE-BSA处理新鲜分离的胰岛48小时，然后分析胰岛中iNOS水平。如图5所示​5,AGEs以浓度依赖的方式刺激iNOS mRNA和蛋白质的表达。此外，这种表达伴随着胰岛以AGE剂量依赖的方式释放NO（图5C​5摄氏度).

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图5

AGE治疗对胰岛iNOS表达和NO生成的影响。分离的胰岛用BSA或AGE-BSA处理48 h，提取总RNA，通过RT-PCR和1%琼脂糖电泳测定iNOS和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA水平，以及iNOS的比率与绘制了甘油醛-3-磷酸脱氢酶。B、 制备胰岛细胞裂解物用于iNOS和β-actin表达的Western blot分析，以及iNOS的比率与绘制β-actin。C、 使用改良的格里斯试剂测量胰岛培养液中的亚硝酸盐水平。数据以平均值±表示扫描电镜三个独立实验的结果，P（P）与对照组相比<0.01。