家养奶牛的全基因组集合，Bos金牛

单核苷酸差异

在逐个碱基的比较中，UMD2和BCM4组装体的单核苷酸差异（SND）大于200万。其中一些可能是有效的单倍型差异，其中两个组合都是正确的，而另一些可能是错误的。我们将分析重点放在一个子集位置上，其中基础读取数据表明该位置极有可能是纯合的，因为大多数（或所有）读取结果彼此一致。我们还要求每个SND两侧都有50-bp的精确匹配（参见材料和方法），这将SND集减少到389015。然后，我们查找了这样的情况：只有一个读取确认了一个程序集，而所有其他读取（至少三个）确认了另一个程序集中。UMD2程序集包含这些明显错误的10636个实例，而BCM4程序集中包含30750个实例。因此，BCM4组件中明显错误的SND大约增加了三倍。

查看细粒度准确性的另一种方法是将程序集与独立生成的序列进行比较。我们将这两个组件与六个成品BACS进行了比较，它们来自与全基因组项目来源不同的奶牛。UMD2或BCM4组件中均未使用这些BAC克隆。UMD2中含有96%的BAC序列，而BCM4中含有91%。仅考虑BAC序列中匹配的部分，BAC和UMD2之间的平均差异为0.58%，而BCM4的差异率为0.96%。尽管其中一些不匹配可能是由于真正的多态性造成的，但BCM4中的过度差异可能表示错误的基调用，这表明BCM4的错误率较高。

这个家牛Y染色体

由于三分之二的数据来自母牛，而雄性DNA基于BAC文库（材料和方法），因此只有非常有限的组装体可以分配给Y染色体。（值得注意的是，BCM4组合没有为Y染色体分配任何序列。）我们将所有未定位的contigs与人类Y染色体对齐，以确定家牛Y序列，我们识别出71个与Y对应的contigs。当包含相同支架中的Contig时，总contigs增加到94个，覆盖832527 bp。这些基因包括男性性别决定基因的一部分SRY公司[7]. 因为目前很少有这些连续体是相对排列的，所以需要进一步的工作来构建Y染色体结构的更好图片。

将装配映射到染色体上

我们在UMD2的CelAsm支架的初始放置中使用了两组标记：IBBMC指纹图中的BAC末端[4]; 以及斯内林及其同事的17524标记合成图（Cmap）[4].

指纹图（IBMMC）是Hin公司290797个BAC的DIII限制图，组装成655个contigs并固定在家牛染色体[4]. 许多BAC是从一端或两端进行末端测序的，我们从NCBI的GSS数据库中检索到这些序列。我们能够将108100个BAC-end序列与我们的家牛基因组组装，要求每个序列在其长度的85%以上与>90%的一致性对齐。大多数BAC末端与>98%的序列匹配，长度大于99%。MUMmer软件包[14]用于这些比对和Cmap比对。（Cmap数据的BCM4标记位置直接从BCM ftp站点获得[15].) 我们手动检查了FPmap和Cmap之间的一些分歧，发现有时FPmap似乎跳到了错误的染色体上。因为Cmap基于三组独立的地图数据，所以我们使用Cmap来检测和纠正这种脱轨，并创建“校正指纹图”（CFPmap）。然后，我们使用此CFPmap将初始组件放置到30家牛染色体。我们还使用CFPmap校正了54个CelAsm支架，方法是将其拆分为两个或多个片段，然后将这些片段分别放在染色体上。

然后，我们在染色体上放置额外的连接物和支架，如果它们通过三个或更多一致的母体-对链接与放置的支架相连。我们将“一致”定义为：所有配对表示相同的相对方向；每个配对对的隐含位置的标准偏差与库中的标准偏差一致。

使用奶牛-人类比对定位contigs

仅使用单个标记映射到染色体上的支架（一组相连的连体）不能仅根据标记信息确定方向。我们利用牛和人之间的整体保守联系来定向许多这些支架。首先，所有的牛支架都使用细胞核与人类基因组对齐[14]使用其最大唯一匹配（mum）选项，以避免重复序列的对齐。对于之前未定向的脚手架与人的每次对准，每侧100 Kbp以内的所有对准都被拉出进行分析。A分数S公司计算每个无定向脚手架，考虑周围脚手架S公司在牛的两侧被映射到人类的一组一致的位置。如果周围的脚手架S公司如果左右两侧的大多数脚手架都同意方向，则S被指定为该方向。使用该程序，对含有4011个连续骨的1840个支架进行定向。

我们开发了一种类似的程序，将未定位的连续染色体分配给染色体，再次依赖于牛和人之间的保守联系。首先，所有未定位的contigs均如上所述对齐。然后，使用Mummer的“delta-filter”程序计算未定位contig到人类的一对一映射，以便在人类的每个区域只考虑最佳对齐contig。对于每个未定位的contig与人类的最佳对齐，通过我们的人-牛同步图识别奶牛中的匹配区域，并从该区域提取所有contig进行检查。我们只考虑在家牛如果奶牛周围的contigs的顺序和方向与人类的相应区域相匹配，则为染色体。如上所述，我们检查了附近奶牛的连体骨的排列，这些连体骨排列在人类未定位连体骨100 kb范围内。如果牛-人共生性区域不包含重排，则将未放置的contig放置在这些排列指示的位置。使用这个程序，在染色体上放置了1046个contigs。这一过程的一个结果是完成了许多未完全定位的基因（基于mRNA比对）。

单倍型变异去除

在评估组装的正确性时，我们发现了许多沿染色体放置的contigs的例子，这些contigs与附近的Contig几乎一致。当二倍体基因组中每个染色体的两个拷贝充分分化时，基因组组装者将无法将来自两个单倍体的读取合并成一个单一的一致序列。相反，它将读取划分为两个单独的连续。在这种情况下，两个contigs都与周围的contigs有mate-pair链接，汇编程序可以将它们放在程序集中彼此非常接近的位置（通常是相邻的）。虽然这个问题的理想解决方案是为每个染色体制作两个完整的拷贝，每个父母单倍型一个，但在目前的技术下，这个解决方案是不可能的。因此，我们必须保留其中一个单倍型，并删除另一个单倍型。

为了检测和纠正单倍型变异问题，我们将每个重叠群与附近的所有重叠群对齐。那些与>97%的同源性一致且长度>90%的基因从组装中移除，并放入单独的单倍型变体文件中。该程序删除了3010个contigs，总计约6 Mbp的序列。

单核苷酸差异评估

我们使用MUMmer程序套件对齐了程序集，并确定了所有位置，其中1个碱基失配的两侧都有50个碱基，每侧都完全匹配，我们还要求每个程序集至少有4个与这些位置对齐的读取。差异包括替换、插入和删除。请注意，此方法排除了具有多个紧密间隔SND的区域。然后，我们将所有SND区域（每个101 bp）与所有SND区进行匹配家牛读取，用精确的20-mer匹配播种排列。如果整个SND区域与最多五个错误的程序集匹配，则认为SND与读取的对齐有效。

与完成的六个进行比较家牛BAC，从GenBank下载了以下克隆：gi |171461043、gi |1171461042、gi#171461041、gi _171461040、gi=171461039和gi |167744683。所有六个克隆均由BCM测序并完成。

Contig缝合

CelAsm中的scaffolder根据读取之间的mate-pair关系将contigs排序并定向为scaffold。当连拱末端的质量低、顺序错误时，架子工会将连拱放置在相邻的位置，即使连拱实际上重叠，也无法将其合并。为了纠正这个问题，我们对支架进行后处理，用单个连接的连接替换重叠的连接，使用之前描述的连接方法的简化版本阴道毛滴虫[16]. 首先，我们与纽姆结盟[17]连续骨末端之间的间隙估计小于1Kbp。如果比对结果显示，相邻序列重叠至少40 bp，同源性94%，悬垂序列最多20 bp，并且重叠所暗示的间隙大小小于估计间隙大小的3个标准偏差，我们将这对相邻序列缝合在一起。缝合序列由穿过重叠区域的左contig序列组成，与经过重叠区域的右侧翼序列区域相连。缝合按顺序处理每个脚手架，这样可以将多个连体链缝合在一起，形成一个大连体。缝合过程用534个拼接拼接（平均尺寸：91.7 Kbp）替换了1076个拼接（平均大小：45.9 Kbp），闭合了542个间隙（平均间隙大小：-822 bp）。

通过“放炮”方法缩小差距

整个基因组组装中的许多缺口是由于重复序列造成的。对于这些序列，组装者必须非常小心，不要将基因组的两个非相邻区域连接起来。在许多情况下，汇编程序完成后留下的空白可以通过仔细利用Mat-pair信息来解决。我们开发了一种算法来跨越脚手架中的间隙，该算法枚举了重叠图（由重叠读取定义）中的所有可能路径。如果其中一条路径正好与主对距离一致，那么我们可以沿着该路径“拍摄”穿过间隙。使用该算法，我们能够缩小4612个缺口，总跨度约为8.34 Mbp。

人-狼共性图的构建

整个人类基因组与家牛使用MUMmer程序套件，用至少40 bp的精确匹配锚定定线，并要求定线锚的长度至少为100 bp。对齐区域的同源性从82%到94%不等，大多数对齐长度为500-5000 bp，可能与编码区域相对应。