肌球蛋白II调节哺乳动物的延伸、生长和模式耳蜗导管

耳蜗长度和细胞变化的测定图案

在特定的发育时间点从胚胎中解剖耳蜗，发育中的耳蜗上皮暴露，细胞边界和前体细胞用指骨肽和抗p27标记^基普1（CDKN1B-小鼠基因组信息学）如前所述(McKenzie等人，2004年).前感觉域的长度和宽度的变化被确定为前面描述过(McKenzie等人。，2004). 为了确定单个细胞形状的变化耳蜗感觉上皮位于耳蜗周围50%的位置对耳蜗长度的基-顶轴进行成像。图像J(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)和Metamorp（通用成像）软件包用于确定区域内每个单元格的长度、宽度和面积。至少三个每个时间点分析不同窝龄的耳蜗。通过标记细胞来确定特定细胞类型数量的变化用指骨肽标记细胞边界，并用特定标记物标记细胞，如毛细胞抗肌球蛋白6和抗p75^NTR公司（NGFR-小鼠基因组信息学）。

逆转录聚合酶链反应

用嗜热菌素(蒙库基奥和凯利，2003)提取总RNA。cDNA的合成使用ABI cDNA合成试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。序列用于底漆组我9，我10和我的14在以下时间可用请求。

定量RT-PCR

总RNA的制备如上所述。对于使用的实验我的10空白小鼠，从两个耳蜗上皮提取总RNA对于每个基因型。cDNA与Power SYBR Green PCR Master Mix混合（Applied Biosystems）并使用ABI PRISM 7000序列检测系统（应用生物系统）。所有反应一式三份。mRNAs的相对数量通过以下公式计算使用标准曲线法。作为不变控件，我们使用鼠标阿贝普(卢比0-小鼠基因组信息学）mRNA(Yabe等人，2003年). 序列如有要求，可提供底漆套件。

免疫组织化学

对于整个坐垫，耳蜗的准备如Jacques等人所述。(Jacques等人，2007年). 对于切片免疫组化分析，耳蜗被解剖，固定4%多聚甲醛，通过蔗糖梯度冷冻保护，嵌入Tissue Tek（MILES，Elkhart，Illinois，USA），并在低温恒温器上切片。

主要抗体为：兔抗MYH9和抗MYH10（1:500，多克隆，Covance）；兔抗MYH14[1:500，多克隆(Golomb等人，2004年)]; 兔子抗肌球蛋白6（1:1000，多克隆，变形杆菌生物科学）；兔子抗p27^基普1（1:100，多克隆，Lab Vision）；和兔子抗p75^NTR公司（1:1000，多克隆，Chemicon）。的特异性western blot证实了抗MYH9、抗MYH10和抗MYH24抗体（参见补充材料中的图S1）。肌动蛋白丝可见用Alexa488-共轭的卵磷脂（1:200，Invitrogen-Mollecular Probes）。

用Alexa488-或Alexa546-偶联物观察一级抗体二级抗体（Invitrogen-Mollecular Probes）。所有荧光图像在LSM510激光扫描显微镜（卡尔蔡司）上获得。

细胞-细胞边界方向变化的测定

如前所述，E14胚胎的耳蜗被标记为阴茎倍体蛋白。发育中的毛细胞是根据肌动蛋白积累增加而鉴定的(McKenzie等人，2004年). 细胞位于内毛细胞内侧边缘7μm范围内分类为柱状细胞域和位于7至14之间的细胞距离内毛细胞内侧边缘μm的区域被分类为外毛细胞区。所有细胞-细胞边界至少沿每个样本包括50μm的基底至顶端轴每个位置至少包括三个单独的耳蜗。

耳蜗伸展评估

在E14从小鼠胚胎中解剖耳蜗。解剖后，在中点切开耳蜗导管，建立下半部分作为外植体培养。外植体在体外保存4天。在每个实验结束后，用抗肌球蛋白6和感觉上皮的生长程度和宽度变化为根据毛细胞的分布确定。至少七个对每个对照组或实验组的多个枯枝落叶的外植体进行分析组。

耳蜗外植体培养

除耳蜗上皮残留外，耳蜗按上述方法分离完整的。为了观察感觉上皮，导管的顶部是远离的。按照前面的描述维护解释(Montcouquiol等人，2003年).对于只含有发育中的耳蜗上皮的培养物，耳蜗如前所述进行解剖，用嗜热菌素(Montcouquiol等人。，2003). 感觉上皮的长度和宽度为按照生长试验所述进行测定。

细胞形状的改变与耳蜗的伸展有关管

确定E14至E16期间单个单元格形状的变化进一步，确定了每个前感觉细胞的管腔尺寸用指骨肽标记皮质肌动蛋白(图1D、E). 平均管腔在一个区域内测定了500多个前感觉细胞的形态位于耳蜗顶轴中点的耳蜗导管耳蜗。在E14，大多数原感觉细胞具有圆形腔长度（沿根尖轴线测量）到宽度（测量）的轮廓沿内侧轴）～1.4的比率和平均管腔表面面积约5.0μm²(图。1楼). 到E16，内腔表面在长度和宽度导致平均表面积加倍。在此外，长宽比有小幅度但显著的增加，表明每个细胞的长度不成比例。观察结果表明单个单元格宽度实际上在E14和E16之间增加，而感觉上皮的总宽度减小，表明图1可能低估了出现的收敛量。最后，内腔增加每个细胞的表面积，以及感觉宽度的减小上皮细胞，导致前庭密度显著降低顶叶轴和近轴细胞(图1F).

我9，我10和我的14在耳蜗中表达上皮

上述数据表明，CE和增长在OC的发展。确定NM II是否在这些方面发挥作用事件，发育过程中所有三个NMHC的mRNA表达测定感觉上皮。RT-PCR分析结果表明，除了其他组织外，所有三个MYH基因都在E13.5和E16.5的耳蜗上皮（参见附录中的图S2材料）。没有报告的拼接变体我的10(伊藤和阿德斯坦，1995年)是在耳蜗中观察到，但所有的剪接变体我的14(Golomb等人，2004年)是存在。

其次，每个MYH基因表达水平的发育变化耳蜗内通过定量RT-PCR测定（见图S2补充材料）。的表达式我的9稳步下降E12.5和E16.5之间。的表达式我的10期间也减少了同一时间段，但相对下降水平小于我的9相比之下我的14几乎增加了E12.5和E16.5之间的六倍。此结果与之前的结果一致结果表明我的14在成人组织中更为丰富(Golomb等人，2004年).

MYH10和MYH14在发育中的耳蜗中不对称分布感觉上皮细胞

确定每个MYH的细胞和亚细胞分布发育中耳蜗内的蛋白质，免疫组织化学定位在E13.5和E16的整个底座和低温恒温器部分进行。MYH9年免疫反应性是有限的，并且在这两个时间都弥漫在整个耳蜗中周期（参见补充材料中的图S3），尽管观察到MYH9在其他组织中，如神经管。相比之下，在E13.5 MYH10和MYH14均匀分布在所有细胞的管腔表面发育中的感觉上皮（数据未显示）。检查中的更改MYH10和MYH14在耳蜗伸展期间的分布研究了这两种蛋白在E16耳蜗中的定位。感官耳蜗上皮发育成从基底到顶。在E16，耳蜗底部的感觉上皮是相对成熟，具有可识别的毛细胞模式和支持细胞。相比之下，E16处的耳蜗顶点似乎未分化没有明显的细胞图案。因此，发展变化可以在单个耳蜗中检测MYH蛋白的分布。在未分化的耳蜗尖，MYH10的分布主要是同质，表达略有增加，形成一条模糊的线条沿根尖轴定向，位于感觉上皮(图2A).在耳蜗的中顶端和中部，MYH10的两条线是明显，一个（与在顶部区域观察到的模糊线连续）这与内毛细胞和内柱之间的边界有关细胞（IPC）和第二个位于感觉上皮（参见图2B用于解释OC中的细胞图案）。在中基底区MYH10的第三行，位于IPCs和第一排外毛之间细胞，是显而易见的。此外MYH10降低（从平均10.06μm降至7.56μm），一致感觉上皮汇聚。最后，在基底区MYH10的三条线持续存在，第一条和第二条之间的距离线条进一步减少。此外，MYH10的附加线路沿延伸轴（顶叶轴）定向，位于发育中的外毛细胞排。

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图2。

MYH10和MYH14沿E16.5耳蜗。(A类)在顶端区域，MYH10分布（红色）在所有细胞边界上基本一致，除了微弱的靠近感觉内侧边缘的强度增加线（箭头）上皮（成熟OC细胞模式图见图2B）。这个发育中的内毛细胞（IHC）的位置用于定向。在中顶端和中间区域，有两条线，一条线位于在IHC和IPC之间（箭头），与顶部的线连续区域，以及位于OC最外侧边缘的第二条线（箭头）。在基底中部区域，第三条线位于边界IPC和OHC之间也存在（有角度的箭头）。在基底区每行OHC之间也存在较短的行。(B类)图表显示OC中的细胞模式。(C类)2014马来西亚令吉的分配（红色）。在中尖区，MYH14分布均匀，略IHC和IPC之间边界处的标记更亮（箭头所示）。在更多成熟地区，MYH14在PC、IHC和IPh的所有边界上都很突出，但OHC地区的标签数量大大减少。(D类,E类)E16.5处通过耳蜗导管的横截面，显示了MYH10（D）和MYH14（E）的分布。括号表示感官D中的上皮和E中的Kolliker器官。E中的星号表示感觉上皮细胞。内毛细胞；内指骨细胞；IPC，内部柱细胞；OPC，外柱单元；OHC，外毛细胞；SC，支持单元格。比例尺：A、C中为10μm；E为15μm（相同放大倍数D） ●●●●。

与MYH10相比，在E16耳蜗中，MYH14主要局限于发育中的IPC、内毛细胞和内指骨细胞。在心尖和中心尖区域，MYH14均匀分布于然而，感觉上皮在内侧有更明显的标记发展中的IPC的边缘，导致沿着延伸(图2C). 在中部和中部基底区，外毛中MYH14标记减少细胞区域，但在IPC和内毛细胞中变得更加突出区域。最后，在成熟的基底区，MYH14显著分布在IPC和内指骨细胞中，也可能在内毛中表达细胞。相比之下，外层毛发几乎完全没有标签细胞区域。每个抗体的特异性通过western blot和no得到确认主要控制（参见补充材料中的图S1和S3）。

感觉上皮细胞的形状变化与收敛与扩张

开发IPC中MYH10和MYH14的显著分布表明这些细胞可能在耳蜗CE中起重要作用。以前的结果表明细胞形状的变化，特别是细胞长度的增加延伸轴，至少为CE提供一些驱动力(Bertet等人，2004年). 这个发育中感觉器官细胞形态变化的初步分析E14和E16之间的上皮细胞在整体上仅显示微小变化感觉上皮内所有细胞的长宽比(图1F). 然而，在此期间分析，具有平行于在发育中的内毛细胞附近观察到伸长率的方向，与开发IPC的位置一致的位置(图3A). 确定是否这些细长的细胞可能表明有一个正在延伸的区域平行、垂直或中间定向的细胞-细胞接触的长度伸长率轴(图3B、C). 为了进行比较，位于上皮不同区域或同一区域的细胞但在早些时候，我们也进行了分析。结果表明，细胞位于发育中的内毛细胞附近，发生显著变化细胞形状包括沿根尖轴延长耳蜗并沿中-外侧轴缩短。定位的单元格距离发育中的内毛细胞区域稍远，但仍在发育中的感觉上皮细胞相似但不太明显形状改变，而位于感觉上皮内侧的细胞没有改变改变形状。

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图3。

发育中的柱状细胞经历一致的细胞形状变化与CE合作。(A类)E14耳蜗中部。单元格位于发育中的柱细胞（PC）和外毛细胞（OHC）结构域，靠近发育中的内毛细胞（箭头）呈扁平状。(B类)的大纲三个不同区域的单个细胞（为清晰起见着色）耳蜗。方向见A。靠近发展中内部的细胞与位于内侧的细胞相比，毛细胞（星号）扁平或位于发育中的感觉上皮的侧面。(C类)单元格边界被分类为平行（0°至30°，蓝色）或垂直（61°至90°，绿色）或中间（31°至60°，红色）至延伸轴（黑色双向箭头）。(D类)比较细胞边界不同方向的比率，如C中所述E13和E14之间的感觉上皮。平行边界增加以牺牲中间和垂直边界为代价。(E类)同一区域内不同区域的细胞边界与D中的细胞边界的比较E14处的耳蜗。更大比例的细胞-细胞边界是平行于柱状细胞区域的延伸轴与无感觉区域相比。外毛细胞区域显示出类似的边界方向分布，但数值不显著不同于非感觉区。E14柱状细胞区域的数据为与D中的E14相同。比例尺：10μm。^*P（P）<0.01.

显性阴性表达我的10禁止扩展和破坏耳蜗中的细胞模式

为了确定肌球蛋白II是否在耳蜗延伸中起作用，小鼠分析了每个MYH基因的靶向突变。删除我的9E7.5导致胚胎死亡(Conti等人，2004年). 自这是在耳蜗发育开始之前，没有耳蜗分析扩展可能发生在我的9突变体。相比之下，我的10空白小鼠存活至E15(Tullio等人1997年)和我的14空白小鼠是可行的。然而，没有在耳蜗的长度或整体形态上观察到缺陷任一突变体（数据未显示）。考虑到所有三种MYH蛋白在胚胎耳蜗中表达，具有功能或遗传补偿在胚胎心脏中被报道(Tullio等人，1997年)，似乎可能。虽然定量PCR用于我的14在里面年10月突变体的水平没有变化我的14表达式（数据未显示），无法裁定转录后水平的补偿退出。

因此，为了检验降低的MYH功能的影响，我们分析了小鼠耳蜗携带假定显性阴性突变（R709C）我的10(Ma等人。，2004). 以前的研究表明保守的R709残基破坏了肌动蛋白激活的MgATPase活性体外运动以及抑制野生型MYH的活性(Kim等人，2005年). 激活的我的10^R709C型突变（称为我的10^{DN（公称直径）})内耳使用福克斯1^Cre公司（详见材料和方法）。这个结果我的10^{公称直径/公称直径};福克斯1^Cre公司/+小鼠存活直到E16.5，并以预期的孟德尔比率获得。

为了确定肌球蛋白II是否调节伸展前感觉域是在实验中确定的(我的10^{公称直径/公称直径};狐狸g1^Cre公司/+)和控制(我的10^+/+;福克斯1^Cre公司/+)E16的耳蜗(图4A-D). 显示的结果实验性耳蜗前庭区明显缩短与对照胚胎(图。第4页). 前文理论的宽度相应增加除耳蜗尖部外，实验性耳蜗中未观察到结构域(图4B). 然而，平均原感觉细胞的腔表面显著减少(图4E)，而密度沿基底-顶端轴的细胞数量显著增加(图4E). 这些结果暗示我的10^{DN（公称直径）}抑制两者细胞密度增加所观察到的收敛和延伸，以及细胞生长，基于细胞内腔表面积的减少前驱区。

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图4。

我的10^{DN（公称直径）}抑制CE并干扰细胞图案。(A类,B类)E16耳蜗的整体安装控制（A）和我的10^{DN（公称直径）}突变体（B）。检察官域用p27标记^基普1注意感觉上皮在突变体中沿着长度看起来更短，并且在顶端看起来更宽。(C类)上部面板显示了耳蜗中部发育中的感觉上皮（紫色）来自E16的对照胚胎。下部面板显示毛细胞的图案（红色）。(D类)与C中的视图类似，除了年10月^{DN（公称直径）}突变体。平均而言，细胞形态被破坏与之相比，细胞尺寸变小，肌球蛋白6的表达降低这可能是直接下调监管的结果。也，毛细胞排列被破坏。(E类)量化形态计量参数。感觉上皮长度显著在中减少我的10^{DN（公称直径）}耳蜗，但宽度不变由于细胞密度显著增加。(F-K公司)对照组和我的10^{DN（公称直径）}耳蜗。（F）中段感觉上皮的荧光图像来自E16对照胚胎的耳蜗。细胞边界用指骨肽标记（绿色）和毛细胞标记有抗肌球蛋白6（红色）。（G） 线路图来源于F中的图像，细胞类型标记如下：毛细胞，蓝色；支持细胞，黄色；柱状细胞，粉红色。（H） 与F相比的图像，但来自年10月^{DN（公称直径）}耳蜗。注意减小的单元格大小并扰乱组织。（一） G中的线条图，而不是单个行，存在多行柱状细胞（粉红色）。（J，K）感官E16对照组（J）和我的10^{DN（公称直径）}（K） 胚胎。内柱电池标有抗p75^NTR公司（红色）。单行内柱单元（箭头）为控件中存在。另外三个p75^NTR公司-阳性细胞是靠近发展中的内柱细胞排（就在箭头）。相比之下，突变体中存在两排内柱细胞（箭头）和附加抗p75^NTR公司-阳性单元格（箭头）为位于外毛细胞域。插图：内部线条图J和K中的柱状细胞（不按比例）。比例尺：A、C中200μm；10微米B、D、F（J、H、K的放大倍数相同）。^*P（P）<0.01,^**P（P）<0.02,^***P（P）<0.05.

IPC中MYH10和MYH14的强表达表明这些细胞的发育可能受到肌球蛋白II的特异性调控。收件人检查这种可能性，IPC区域在耳蜗在控制和年10月^{DN（公称直径）}实验性耳蜗。结果表明，IPC区域内的细胞数量增加实验胚胎的耳蜗（76.5 IPCs/100μm in我的10^直径实验与32.2 IPCs/100μm in控制，P（P）=0.004;图。4F-I型). 此外，所有这些细胞都保留了圆形形态而不是长方体或细长形状。这些人的身份用IPC标记物p75标记细胞，确认为IPC^NTR公司(图4J、K). 然而，类似的对照组和对照组耳蜗较成熟基底区的分析实验性耳蜗显示整体细胞的进步中的图案我的10^{DN（公称直径）}耳蜗，表示延迟，而不是细胞模式中的完全中断（未显示数据）。这些结果表明我的10^{DN（公称直径）}等位基因不完全抑制肌球蛋白II的活性。

最后，为了确定径向夹层的破坏是否可以导致在我的10^{DN（公称直径）}耳蜗，基底膜轴上皮厚度为从野生型和我的10^直径突变体。未观察到上皮厚度的变化（参见补充材料），表明径向夹层没有受到影响在里面我的10^{DN（公称直径）}突变体。

肌球蛋白II功能的药理抑制抑制伸展感觉上皮的

作为我的10^{DN（公称直径）}尚未确定，我们寻求进一步检测耳蜗外植体培养中肌球蛋白II的抑制作用使用三种不同的肌球蛋白II拮抗剂：布利司他丁，选择性地抑制肌球蛋白II(Straight等人。，2003;利穆泽等人。，2004;Kovacs等人。，2004); RHO-相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632(Kimura等人，1996年;Amano等人，1996年;Uehata等人，1997年); 和ML7，肌球蛋白轻链激酶抑制剂(Wadgaonkar等人，2005年;Bessard等人，2006年). 影响肌球蛋白II对耳蜗伸展的抑制作用用先前描述的体外生长试验(Wang等人，2005年)（请参见详细资料和方法）。在对照外植体中，平均延伸率感觉上皮的厚度为～600μm(图5A、B、G). 相比之下，布利司他丁治疗(图。5摄氏度)或Y27632(图。第五天)导致通过与未经处理或未接触N-苄基对甲苯的比较磺胺（BTS），骨骼肌肌球蛋白的特异性抑制剂(Cheung等人，2002年)、或至ML7级(图5G而数据不是如图所示）。在最高耐受浓度为10μ，感觉上皮的延伸减少到～150μm，占75%对照感觉上皮减少(图5G). 相比之下延伸，感觉上皮的宽度仅显著用最高剂量（10μM）的布利司他丁处理的外植体增加(图5H). 这些结果是与观察到的表型变化一致我的10^{DN（公称直径）}变异耳蜗。镇静剂治疗后细胞模式的破坏外植体看起来与破坏相当，但比破坏更严重在中观察到我的10^{DN（公称直径）}突变体(图5E、F). 除了多排IPC、外毛细胞和（在较小程度上）内毛细胞也无法与一排特征性的内毛细胞对齐和三排外毛细胞(图。5E、F). 此外，单个单元格的长度、宽度和总面积显示出与我的10^{DN（公称直径）}突变体(图。5I型). 最后，为了证实blebbistatin治疗没有导致连接复合体的破坏，紧密连接的表达在对照组和blebbistatin处理的外植体(图。5J、K). 尽管图案缺陷明显滤泡抑素，ZO1仍然局限于每个细胞的管腔边界，表明上皮完整性完好。

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图5。

肌球蛋白II活性的抑制会破坏耳蜗CE。(A类)通过切割完整的耳蜗来检测感觉上皮的生长导管位于其中点，然后在体外维持基底片。在随后72-96小时，感觉上皮从切口向外延伸外植体的末端。(B类)对照外植体的建立如A所述。初始切割位置用白色标记。感觉上皮（毛发标记为红色的单元格）从初始切割位置延伸。(C类)外植体与B中相同，但用10μM肌球蛋白II抑制剂处理从E14开始的blebbistatin。感觉上皮明显变短和更宽。(D类)一种外植体，如B中所述，但用10岩石抑制剂Y27632的μM。感觉上皮的表型为与C中的相似(E类,F类)感觉上皮的图像来自对照组（E）和10μM抑泡剂处理的（F）外植体，标记有抗肌球蛋白6（红色）和卵磷脂（绿色）。附加内柱单元（PC）存在于经抑泡剂处理的外植体中。IHC和OHC中的模式也被破坏了。中的缩写图。2. (G公司)用布利司他丁或Y27632治疗的结果感觉延伸显著且呈剂量依赖性下降上皮细胞。相比之下，骨骼肌肌球蛋白抑制剂BTS没有影响扩展。(H（H）)用10μM博来司他汀治疗可导致感觉上皮宽度显著增加。然而外植体中感觉上皮的宽度没有显著增加用10μM Y27632处理。(我)Blebbistatin治疗导致细胞形状的变化与年10月^{DN（公称直径）}突变体。(J型,K（K）)表面（上面板）以及控制（J）和消泡剂处理后的横截面（下面板）视图（K） 用紧密连接蛋白特异性抗体标记的外植体ZO1（绿色）。从两种情况和仅限于管腔表面。比例尺：B中50μm（相同放大倍数（C，D）；E为20μm（F、I、J的放大倍数相同）。^*P（P）<0.005,^**P（P）<0.001,^***P（P）<0.01.

肌球蛋白II的抑制导致内柱细胞的变化形态学

对细胞形态变化的分析表明IPC在延长期内变得更加平坦。要确定IPC形状的变化是否通过肌球蛋白II调节，IPC是在用布利司他丁处理过的外植体中特别标记从E14开始48小时。感觉上皮的总长度为滤泡抑制素处理的外植体较短，IPC排紊乱(图6). 此外单个IPC的管腔轮廓表明肌球蛋白II的抑制作用导致细胞无法变平。长度的量化单个IPC的宽度表明长度显著减少以及在使用镇静剂治疗的患者中，IPC宽度显著增加外植体(图6).

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图6。

blebbistatin治疗的耳蜗柱细胞形状受到影响外植体。(A类)对照外植体的低倍视图在E13处建立并在体外72小时后固定。支柱单元（绿色）沿着外植体的长度以单线延伸。(B类)低外植体的放大图，按A建立并标记，但经过处理在体外24小时后开始，用10μM布利司他丁持续48小时。这个上皮总长度较短，柱细胞排看起来没有那么条理。(C类)感官的高倍视图标记为a的对照外植体的上皮。柱细胞为排成一排。(D类)与C中相同的视图红色通道已移除。指示柱单元（箭头）。(E类)高10处理的外植体感觉上皮的放大观察μM布利司他丁，标签如A所示(F类)与E中的视图相同红色通道被移除。注意支柱单元排的组织结构不良形状更圆。(G公司)平均长度的量化对照组和抑泡剂处理的外植体中柱细胞的宽度。在经抑泡剂处理的外植体，柱细胞长度明显缩短，而柱状细胞的宽度明显更大，导致长宽比显著降低。比例尺：100μm in A（B中的放大倍数相同）；D为20μm（C、E、F的放大倍数相同）。

肌球蛋白II依赖性延伸发生在E14.5和E17.5之间

如上所述，以前的结果表明耳蜗的会聚和伸展量发生在E14和E16.5之间。收件人确定肌球蛋白II的作用是否局限于在E13.5建立耳蜗外植体，并用从0天、1天、2天或4天后开始服用布利司他丁48小时体外（相当于E13.5、E14.5、E15.5或E17.5；图7A、B). 所有外植体均为体外共固定6天后。另外，因为很难将其平分耳蜗在每个外植体中完全相同的位置，耳蜗完整建立，并完全清除了Reissner膜使感觉上皮完全暴露。存在完整的感官然而，上皮细胞似乎并没有显著影响延伸感觉上皮的平均宽度比已对分的外植体（数据未显示）。显著缩短和布利司他丁治疗时感觉上皮增宽在E14.5或E15.5启动(图7C、D). 启动在E13.5时使用布利司他丁并没有显著缩短感觉上皮(图7C),可能是因为肌球蛋白II依赖性生长在E14.5之前不开始。相比之下，在E17.5和E19.5之间使用布利司他丁治疗没有显著影响耳蜗长度，但确实导致显著增加感觉上皮的宽度，表明肌球蛋白II依赖于E17.5可能会完成延伸，但不会完成细胞重排。无论何时添加镇静剂，头发总数细胞未受影响。

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图7。

CE在感觉上皮内自主发生。(A类,B类)对照（A）和10μM博来司他汀（B）外植体处理从E14.5开始持续48小时。毛细胞被抗肌球蛋白6标记，blebbistatin治疗的感觉上皮更短更宽外植体。(C类,D类)处理的耳蜗外植体的长度和宽度在指定的时间段内使用10μM镇静剂。治疗从E14.5或E15.5开始，会导致感觉上皮。从E17.5开始的治疗导致加宽而不改变长度。(E类,F类)控制（E）和3μM滤泡抑制素处理的（F）外植体建立时没有间充质。这个布利司他丁的作用类似于在外植体中观察到的间充质。(G公司,H（H）)布利司他丁对长度和感觉上皮的宽度在具有和的外植体之间是可比较的没有间充质。比例尺：A中为50μm（B、E、F中的放大倍数相同）。^*P（P）<0.05,^**P（P）<0.01,^***P（P）<0.001.