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基因发育。2009年5月15日；23(10): 1177–1182.
数字对象标识：10.1101克/加仑51109
预防性维修识别码：项目经理2685533
PMID：19451218

组蛋白脱甲基酶JMJD3有助于表观遗传控制INK4a/ARF型通过致癌RAS

玛尔塔·巴拉达斯,1中，6 艾玛·安德顿,2,6 胡安·卡洛斯·阿科斯塔,1中，6 李思德,三，4 安娜·巴尼托,1 马克·罗德里格斯-尼登夫,2 戈德勒·梅尔滕斯,2 迈克拉·班克,5 周明明,4 马丁·J·沃尔什,三，4 戈登·彼得斯,2,8和杰苏斯·吉尔1中，7
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

这个INK4a/ARF公司肿瘤抑制基因座是细胞衰老的关键执行者，受转录抑制因子多囊群（PcG）成员调控。在这里，我们显示来自致癌RAS的信号转导覆盖了PcG介导的对INK4a公司通过激活H3K27脱甲基酶JMJD3和下调甲基转移酶EZH2。在人类成纤维细胞中，JMJD3激活INK4a公司，但不是农业研究基金，并导致p16INK4a公司-受抚养人逮捕。在小鼠胚胎成纤维细胞中，Jmjd3激活两者墨水4a和阿尔夫并引发p53依赖性阻滞，与RAS在该系统中的作用相呼应。我们的研究结果直接表明JMJD3参与了INK4a/ARF公司并表明JMJD3具有作为肿瘤抑制剂的能力。

关键词：多梳、衰老、组蛋白甲基化、INK4a、JmjC蛋白

这个INK4b–ARF–INK4a肿瘤抑制基因座编码细胞周期素依赖性激酶抑制剂INK4家族的两个成员p16INK4a公司和第15页墨水4b以及一种不相关的蛋白质，称为ARF，它利用INK4a公司在另一种翻译阅读框架中(夏普莱斯2005;吉尔和彼得斯2006). 这三种蛋白质都能引起细胞周期阻滞。INK4蛋白通过阻断视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的磷酸化和失活来实现这一目的，而ARF则阻断p53的泛素化和降解。鉴于编码蛋白的特性，该位点的表达受到严格调控，这部分是通过Polycomb群（PcG）蛋白的表观遗传沉默实现的(Gil和Peters 2006年)。

PcG蛋白参与两种类型的多蛋白复合物，称为PRC2和PRC1，分别建立并结合到H3K27me3（组蛋白H3在Lys 27上三甲基化）。PcG介导的抑制通过阻断谱系特异性转录因子的表达，对维持多能性很重要(Sparmann和van Lohuizen 2006年). 特定PcG基因的缺失导致过早衰老，主要是由于墨水4a/Arf(Jacobs等人，1999年). 衰老是一种不可逆的生长停滞状态，当原代细胞暴露于各种形式的压力下时，它会阻止致癌突变的影响(Campisi和d'Adda di Fagagna 2007年). 重要的是，肿瘤诱导衰老（OIS）可以在体内的癌前病变中观察到，并且被认为是肿瘤抑制的一个重要方面(Collado和Serrano 2006). 在这里，我们探讨了激活的RAS癌基因的信号如何诱导INK4a/ARF公司PcG蛋白引起的表观遗传沉默导致衰老。

结果和讨论

基于激活INK4a公司由于致癌RAS可能需要逆转PcG介导的阻遏作用，我们研究了接受OIS的人二倍体成纤维细胞（HDFs）基因座H3K27me3修饰的程度。为了便于进行这些分析，将IMR90株胎肺成纤维细胞和一株新衍生的乳腺成纤维细胞（BF）与他莫昔芬调节的活化H-RAS进行转导(Tarutani等人，2003年). 在添加4-羟基三苯氧胺（OHT）后，这些细胞发展出衰老的特征，伴随着p16的上调INK4a公司减少BrdU的加入(图1A–C; 补充图S1A、S2A）。与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的情况相反农业研究基金，通过定量RT-PCR（qRT-PCR）判断(图1C). 染色质免疫沉淀（ChIP）用于比较整个实验中H3K27me3与总H3的比率INK4a–ARF公司使用先前描述的引物集定位(图1D). 与公布的结果一致(Bracken等人，2007年;Kia等人，2008年)，H3K27me3标记出现在一个相对较宽的峰值中，该峰值集中在INK4a公司在添加OHT和激活RAS后，该位点H3K27me3的水平呈时间依赖性降低(图1E; 补充图S1B）。

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H3K27me3在INK4a/ARF公司发生OIS的细胞中的位点。(A类)衰老和p16的诱导INK4a公司IMR90-ER中的表达：用OHT处理RAS细胞0、3和7天(B类,C类)如图所示，在用OHT处理的IMR90-ER:RAS细胞中，BrdU阳性细胞的百分比以及通过qRT-PCR测量的INK4a和ARF mRNA的相对水平。结果代表了三个独立的实验。(D类)人体示意图INK4b–ARF–INK4a轨迹（不按比例）。编号的线显示了用于ChIP的引物集的大致位置（补充表S1）。(E类)H3K27me3在INK4b–ARF–INK4aIMR90-ER基因座：经OHT处理0、3和7天的RAS细胞。使用扩增细胞周期蛋白D1基因（CD1）的引物集作为阴性对照。结果显示为通过ChIP分析判断的H3K27me3与总H3的比率。

我们推断，除了核小体交换外，H3K27me3水平变化最可能的解释是甲基转移酶EZH2的下调(Sparmann和van Lohuizen 2006年)或H3K27me3脱甲基酶、UTX或JMJD3之一增加(Agger等人，2007年;De Santa等人，2007年;Hong等人，2007年;Jepsen等人，2007年;Lan等人，2007年;Lee等人，2007年;Xiang等人，2007年). 通过qRT-PCR评估相关mRNA的表达。在RAS激活后的3天内可观察到JMJD3水平增加，并且水平持续上升至7天(图2A、B; 补充图S2B）。免疫荧光显示，早在添加OHT后的第1天和第2天，蛋白质就积累了，主要在细胞核中(图2B; 补充图S2D）。无论采用何种策略激活RAS–RAF–MEK通路，在不同的HDF菌株中都观察到了这种效应(图2C; 补充图S1C）。我们发现UTX的表达几乎没有变化，但EZH2的表达在RAS激活后显著下降(图2A). 之前已经证明EZH2是一个E2F依赖基因(Bracken等人，2003年)在复制衰老或各种遗传毒性胁迫下，其水平下降(Bracken等人，2007年). 有趣的是，定量免疫荧光和免疫印迹表明，RAS最初导致EZH2蛋白水平略有增加，随后显著降低，可能反映了mRNA表达的损失（补充图S2C-F）。鉴于这些复杂性，很难断定EZH2和JMJD3对INK4a公司轨迹。

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致癌RAS上调JMJD3(A类)qRT–PCR评估IMR90-ER中JMJD3、UTX和EZH2 mRNA的相对水平：经OHT处理7天的RAS细胞归一化为未处理细胞。(B类)RAS诱导后内源性JMJD3水平增加。使用DAPI的核染色显示在底部面板。(C类)用组成活性形式的RAF或MEK1转导的IMR90细胞中JMJD3 mRNA表达增加。(D类)ChIP分析显示JMJD3的结合增强，EZH2的结合减少INK4a/ARF公司IMR90-ER基因座：RAS细胞。(E类,左边)用两个shRNAs敲除JMJD3 mRNA。对照组和shRNA用于感染IMR90-ER:RAS细胞。(赖特)选择后，用OHT处理细胞48小时，用BrdU脉冲处理细胞16小时。这些结果是三个独立实验的代表。(F类)IMR90-ER:RAS细胞转染siRNAs或对照。两天后，用OHT处理细胞四天后，固定并进行免疫荧光。JMJD3阳性百分比(左边)或p16INK4a公司-积极的，积极的(正确的)显示单元格。

与RAS激活后H3K27me3的丢失一致，JMJD3在该位点的结合随时间增加，同时EZH2也相应丢失(图2D). 这两种蛋白都集中在INK4a公司类似于未处理细胞中PcG复合物和H3K27甲基化的分布，而在农业研究基金和墨水4b发起人。这些变化伴随着PcG蛋白CBX7和BMI1结合减少，这两种蛋白被招募到H3K27甲基化位点，以及SUZ12，这两个蛋白与EZH2和EED一起是PRC2复合物的组成部分（补充图S3）。我们还观察到RNA聚合酶II（Pol II）和H3K4三甲基化的关联性相互增加。后者与UTX和JMJD3与H3K4甲基转移酶复合物相关的报道一致(De Santa等人，2007年;Issaeva等人，2007年). 然而，我们在INK4a公司使用确认UTX在其他基因上结合的试剂和方案的基因座（补充图S4）。

这些发现的含义是，JMJD3可能有助于RAS/RAF/MEK下游OIS的实施。为了解决这个问题，我们询问针对JMJD3的shRNAs是否能缓解OIS。在IMR90-ER:RAS细胞中，JMJD3 shRNAs的稳定表达部分恢复了相对于对照细胞的BrdU掺入(图2E). 用独立的siRNA和shRNA以及在新感染RAS逆转录病毒的细胞中获得了类似的结果（数据未显示）。此外，我们确认JMJD3敲除降低了p16INK4a公司表达但不能完全阻断p16的激活INK4a公司通过RAS(图2F; 补充图S5）。

现在人们认识到OIS是体内肿瘤发生的重要屏障，许多研究表明，癌前病变表达衰老的标记物和效应物(Collado和Serrano 2006). 例如良性黑色素细胞痣，通常含有活化的B-RAFV600E型等位基因和显示衰老特征，包括p16升高INK4a公司水平(Michalloglou等人，2005年;Gray-Schopfer等人，2006年). 有趣的是，已发布配置文件的数据挖掘(Talantov等人，2005年)使用Oncomine(http://www.oncomine.org)表明黑色素细胞痣的JMJD3水平显著高于正常皮肤(P（P）= 0.041) (图3A)，而UTX表达式在两者中基本相同(P（P）= 0.9359). 由于人体组织中缺乏可靠的免疫组织化学（IHC）抗体，因此无法在蛋白质水平验证这种相关性。然而，使用允许小鼠组织内IHC的抗体，我们在小鼠表皮观察到Jmjd3阳性染色。尽管存在一些差异，但老龄小鼠皮肤中Jmjd3阳性细胞的比例显著增加，反映了p16随年龄增长而增加的情况INK4a公司(图3B)。

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JMJD3的异位表达激活p16INK4a公司在HDF中。(A类)的表达式INK4a公司,JMJD3公司、和UTX公司黑色素细胞痣与正常皮肤Talantov等人（2005）. (**)P（P）< 0.001; (*)P（P）< 0.05. 这个P（P）-值对应于非参数未配对t吨-测试。(B类)Jmjd3和p16的免疫组织化学墨水4a小鼠背部皮肤石蜡包埋切片中的蛋白质。HA染色作为阴性对照。在小鼠尾部皮肤中也获得了类似的结果（未显示）。(C类)p16的免疫印迹INK4a公司在用JMJD3或CD构建物转导的Hs68成纤维细胞中。使用CDK4作为负载对照。(D类)qRT–PCR显示全长JMJD3或CD的表达上调INK4a公司在HDF的指示菌株中。(E类)免疫印迹显示p16上调INK4a公司JMJD3（CD）的HA标记CD，而不是催化失活突变（Mut）。在BF和IMR90细胞中获得了相同的结果。(F类)JMJD3 CD在BF和IMR90细胞中的异位表达上调INK4a公司但不是农业研究基金. (G公司)JMJD3的表达降低了H3K27me3修饰的程度，并增加了JMJD3在INK4a公司IMR90细胞中的位点。

作为对JMJD3监管能力的更直接测试INK4a/ARF公司，我们用逆转录病毒载体感染HDFs，逆转录病毒载体编码HA标记的全长蛋白版本或对应于催化结构域（CD）的截短形式。如前所述，CD的表达水平高于全长蛋白（数据未显示），但两者都导致p16的表达显著增加INK4a公司mRNA和蛋白质(图3C、D). 在其他HDF菌株中也观察到类似的效果(图3D)并且依赖于JMJD3脱甲基酶活性。因此，损害JMJD3活性的点突变(Agger等人，2007年)也会削弱其激活能力INK4a公司(图3E、F). 催化惰性全长蛋白也获得了类似的结果（数据未显示）。注意UTX的异位表达没有激活INK4a公司（补充图S6）。p14的低水平农业研究基金在HDF中，免疫印迹法无法检测到，但我们观察到农业研究基金信使核糖核酸(图3F). 与此一致的是p53，它被p14稳定农业研究基金，似乎未受JMJD3的影响（补充图S7A）。此外，尽管外源JMJD3被招募到INK4a公司基因座并导致局部H3K27甲基化降低(图3G)，已经很低的H3K27me3水平在农业研究基金启动子（引物集2）。类似结论适用于用CD版JMJD3转导的细胞（补充图S7B）。

正如p16的积累所预期的那样INK4a公司，HDFs中JMJD3的异位表达诱导了衰老特征，包括细胞和细胞核尺寸增大、BrdU掺入减少、生长停滞和衰老相关异染色质灶（SAHFs）的形成(图4A、B; 补充图S7C–G）。尽管全长蛋白和CD诱导了所有这些变化，但催化失活的版本没有。在这些实验中，RAS被作为阳性对照，而Cbx7对p16有负面影响INK4a公司表达和衰老。有趣的是，根据γH2AX病灶的出现判断，RAS也引发了DNA损伤反应(图4C; 补充图S7H），我们没有检测到用JMJD3转导后γH2AX染色强度或γH2AX阳性细胞数量的增加。JMJD3的作用与外源性p16的作用更为相似INK4a公司这表明JMJD3调停的逮捕可能取决于INK4a公司而不是全球H3K27me3脱甲基的结果。为了解决这种可能性，我们将JMJD3与HPV16的E6和E7蛋白共存，这两种蛋白分别使p53和pRb失活。如补充图S8、A和B所示，E7单独或E6+E7的共表达减轻了JMJD3的影响并使其能够增殖，而用E6或空载体转导的细胞被JMJD3阻止。沿着类似的细胞系，p16的表达INK4a公司使用shRNA减少(图4D)与对照组相比，JMJD3对逮捕的敏感性显著降低(图4E). 此外，p16的莱顿毒株INK4a公司-缺乏成纤维细胞，对RAS诱导的阻滞具有抵抗力(Drayton等人，2003年)对JMJD3的阻滞也有抵抗力（补充图S8C，D），这意味着在HDF中，JMJD3诱导的阻滞依赖于INK4a/pRb而不是ARF/p53轴。

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JMJD3导致p16INK4a公司-HDF中的依赖性生长停滞。(A类)IMR90细胞被指示的逆转录病毒感染。感染后10-15天结晶紫染色。(B类)JMJD3、CD和激活的RAS导致SAHFs的出现，而Cbx7延缓HDF的衰老。对每个核至少200个进行量化。(C类)γH2AX的免疫荧光表明RAS在IMR90细胞中引起DNA损伤反应，而JMJD3或p16INK4a公司不要。结果显示于A–C是三个独立实验的代表。(D类,E类)p16的shRNA敲除INK4a公司减轻异位JMJD3引起的逮捕。免疫印迹显示p16INK4a公司用免疫荧光法定量BrdU掺入，绘制相对数。两个独立的实验显示了类似的结果。

与HDF相比，MEF在衰老的实现方面存在显著差异，包括阿尔夫(夏普莱斯2005;吉尔和彼得斯2006). 两个p19阿尔夫和第16页墨水4a随着MEFs的传代而积累，并且两者都由致癌RAS诱导。然而，阿尔夫−/−细胞逃避衰老，而墨水4a−/−单元格不(Kamijo等人，1997年;Krimpenfort等人2001;夏普莱斯等人，2001年,2004). 因此，探索Jmjd3在小鼠调节中的作用非常重要墨水4a/Arf轨迹。在MEF中，H3K27me3在整个Ink4b–Arf–Ink4a轨迹，包括阿尔夫启动子和第一外显子(图5A). 重要的是，RAS表达后信号显著降低，同时内源性Jmjd3结合增加，Ezh2和Cbx7结合减少。我们没有在该位点发现Utx结合的证据（补充图S4B）。活性转录标记H3K4me3和RNA Pol II也在整个位点增加。最明显的变化发生在墨水4a和阿尔夫(图5A). 与这些变化一致，JMJD3或RAS的异位表达上调了阿尔夫以及墨水4a信使核糖核酸(图5B)导致衰老样的生长停滞(图5C). 重要的是，这两种基因在MEF未合子中的作用都不明显p53，Ink4a/Arf（未显示数据），或阿尔夫，而墨水4a−/−MEF对JMJD3和RAS的生长抑制仍然敏感(图5D). 野生型和野生型BrdU掺入的比较阿尔夫−/−MEF证实了这一观察结果（补充图S9B）。如前所述(Bracken等人，2007年)，我们还观察到H3K27me3水平在墨水4a/Arf正常MEF持续传代时的位点，伴随着Jmjd3的逐渐增加及其与墨水4a/Arf位置（补充图S9C，D）。这些发现与Arf/p53通路在小鼠细胞衰老中的中心作用一致。

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在MEF中，JMJD3激活了阿尔夫和墨水4a导致依赖Arf的生长停滞。(A类)MEF感染了对照载体或激活的RAS。选择后，使用指定的抗体和引物集对细胞进行ChIP（补充表S1）。所用底漆组的大致位置如图所示。(B类)在正常MEF中，JMJD3或RAS的异位表达导致两者的上调阿尔夫和墨水4a抄本。(C类)在MEFs中JMJD3或RAS的异位表达导致衰老样停滞。这个顶部感染后10-15天，面板显示结晶紫染色。这个底部面板显示出典型的衰老样形态。(D类)JMJD3和RAS导致正常和墨水4a−/−MEF，但不在第53页−/−或阿尔夫−/−MEF公司。用结晶紫染色法测定相对细胞数。这些数据代表了每个基因型的两到六个独立实验。

总之，我们的数据证实了组蛋白甲基化的动态性质，并说明了信号转导途径如何影响基因表达的表观遗传控制。具体来说，我们将JMJD3确定为激活INK4a/ARF公司致癌RAS位点和OIS的实施。通过RAS–RAF–MEK通路的信号传递通过上调JMJD3和下调EZH2来降低该位点H3K27me3的范围，从而导致PcG介导的抑制丧失。与RAS本身一样，JMJD3对INK4a/ARF公司基因座与环境相关，导致小鼠上调阿尔夫但不是人类的农业研究基金这就增加了老鼠和人类之间差异的可能性农业研究基金在各自的基因组位点中是固有的。

我们工作的另一个推论是JMJD3具有与肿瘤抑制兼容的特性。类似于p16INK4a公司我们可能会看到良性和癌前病变中JMJD3水平升高，这反映了它在实施OIS中的作用。初步证据表明，这确实是黑色素细胞痣的情况，将这些观察扩大到其他良性病变显然很重要。相反，人们可能会看到JMJD3在逃离OIS的侵袭性更强的肿瘤中表达缺失。Oncomine数据库(http://www.oncomine.org)包含JMJD3在多种肿瘤类型中表达减少的证据，以及对CONAN（拷贝数分析）数据库的检查(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi)表明杂合性缺失JMJD3公司在770例多发性肿瘤中，有478例被记录在案（数据未显示）。然而，正如Cloos等人（2008年）,JMJD3公司位于染色体17p13.1上，位于TP53型这使得很难区分这些缺失是对肿瘤有利还是副作用TP53型删除。EZH2的过度表达(Varambally等人，2002年;Bracken等人，2003年)以及抑制H3K27甲基化对肿瘤细胞的负面影响(Tan等人，2007年)，再加上JMJD3对分化的影响(De Santa等人，2007年;Jepsen等人，2007年;Burgold等人，2008年;Sen等人，2008年)和衰老(Agger等人，2009年; 这项研究），所有人都主张JMJD3在肿瘤发生中的作用。

材料和方法

细胞培养与逆转录病毒感染

IMR90和Hs68来自美国型培养物收藏。描述了FDF菌株(Brookes等人，2004年)BF应变来源于乳房缩小术的样本。将细胞保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。的MEF墨水4a/ARF−/−;墨水4a−/−;阿尔夫−/−，或第53页−/−基因型来自S.Lowe、M.Serrano、C.Sherr和A.Berns。用于逆转录病毒生产和感染、结晶紫染色和BrdU掺入的方法在别处详述(Brookes等人，2004年;Gil等人，2004年;Acosta等人，2008年)。

质粒和载体

编码人类JMJD3和shRNAs的质粒在补充材料中有详细描述。从Paul Khavari中获得一个编码ER:RAS的质粒，并用于生成LNCX-ER:RAS.p16的敲除INK4a公司使用经验证的shRNA实现(Drayton等人，2003年)。

qRT–PCR分析

使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）或高纯度RNA试剂盒（Roche）提取总RNA。使用SuperScript II（Gibco）或TaqMan（Applied Biosystems）进行逆转录。使用Power SYBR Green Master Mix或TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）在ABI 7900HT（应用生物系统）上进行PCR反应。补充表S1列出了使用的引物集和TaqMan 6-羧基荧光素（FAM）基因表达测定（应用生物系统）。

炸薯条

按照所述执行ChIP(Ananthanaarayanan等人，2004年)使用EZ-Magna ChIPTM G套件（目录号17-409，Millipore）。使用补充表S2中所述的抗体进行交联染色质的免疫沉淀。免疫沉淀后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）提取DNA，并使用补充表S1中描述的寡核苷酸引物通过实时qPCR扩增小份DNA。为了确认目标富集，通过终点PCR对每个PCR产物进行评估。

免疫荧光和免疫印迹

使用的抗体为人类p16INK4a公司（JC-8，CRUK），鼠标p16墨水4a（M-156，sc-1207，Santa Cruz Biotechnologies），β-微管蛋白（H-235，sc-9104，Santa Cruz Biotechnologies），p53（DO-1，sc-126，Santa Cruz Biotechnologies），HA（16B12，MMS-101P，Covance；或Y-11，sc-805，Santa Cruz Biotechnologies），CDK4（H-22，sc-601，Santa Cruz Biotechnologies），EZH2（AC22，3147，细胞信号传导），γH2AX（05-636，上游生物技术）和JMJD3(ARP40102标准，Aviva；和ab38113，Abcam）。使用自动化高通量显微镜（InCell Analyzer 1000，GE）进行免疫荧光检测。使用InCell调查员软件（GE）进行图像处理和量化。

免疫组织化学

将年轻（6-12周）和老年（14-18个月）小鼠的皮肤样本固定在4%PFA中过夜，并嵌入石蜡中。在10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中微波提取抗原10分钟。通过在Power Block通用封闭试剂中培养10分钟（10×PowerBlock；Biogenex）阻断非特异性结合。初级抗体在PBS 1%BSA中稀释。使用EnVision+System-HRP（DAB）兔初级抗体（Dako）试剂盒检测抗体。

数据库分析

我们用了Oncomine(http://www.oncomine.org)比较正常皮肤和痣样本，分析可用微阵列数据中不同基因的表达(Talantov等人，2005年)通过使用未配对t吨-测试（双尾）。使用Prism 5生成图形和统计值。

致谢

我们感谢H.Peretz、R.Shafir、P.Kavhari、S.Lowe、M.Narita、M.Serrano、A.Berns、C.Sherr、R.Festenstein和T.Rodríguez提供试剂。我们感谢D.Beach、M.da Costa、S.Raguz和A.Muñoz的有益评论；P.Moemeni寻求帮助；技术支持：J.Tsao；E.Hernando、G.Stamp和M.Nohadani为免疫组织化学提供帮助；和K.Helin在出版前分享结果。M.B.由国防部前列腺癌指令的培训奖和NIDDK/NIH的KO8奖资助。A.B.由FCT资助。M.J.W.获得了NIH PHS奖项的支持。G.P.由CRUK资助。J.G.由MRC、CRUK和AICR的拨款以及EMBO青年研究员计划资助。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社