细胞死亡不同。作者手稿；PMC 2009年5月18日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院71655
DIAP1与dOmi/HtrA2的相互作用调节细胞死亡果蝇属
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FS汗
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
M藤冈
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
P数据
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
T费尔南德斯·阿尔内姆里
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
JB Jaynes公司
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
ES Alnemri公司
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
1美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症研究所细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系
*通讯作者：ES Alnemri，细胞凋亡研究中心生物化学和分子生物学系，托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症研究所，地址：233 S10th Street，Philadelphia，PA 19107，USA电话：+215 503 4632；传真：+215 923 1098；电子邮件：ude.ujt.icj.liam@irmenla_e 2这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
线粒体蛋白质，如细胞色素c（c）Smac/DIABLO和Omi/HtrA2在哺乳动物细胞的细胞死亡途径中发挥重要作用。在果蝇属线粒体在细胞死亡中的作用尚不清楚。在这里，我们报告了果蝇属人类Omi/HtrA2的直系图。我们证明了这一点果蝇属Omi/HtrA2被导入线粒体，在线粒体中进行蛋白水解成熟，产生两种亚型，dOmi-L和dOmi-S。dOmi/L包含一个典型的N末端IAP-结合基序（AVVS），而dOmi/S包含一种独特的N末端基序（SKMT）。DIAP1能够通过其BIR1和BIR2结构域与这两种亚型结合。这导致DIAP1连接区在BIR1和BIR2结构域之间断裂，并通过dOmi的蛋白水解活性进一步降解BIR1结构域。DIAP1与dOmi的结合也导致了DIAP1介导的dOmi-多泛素化，这表明DIAP1可以靶向dOmi/进行蛋白酶体降解。与此一致，DIAP1在果蝇属眼盘保护它们免受dOmi诱导的眼球消融，这表明DIAP1在保护细胞免受dOmi潜在致命影响方面发挥着重要作用。IAP与线粒体蛋白（如dOmi）结合并泛素化的能力可能是一个关键的保守功能，以抵消这些蛋白意外释放到胞浆中时的致命影响。
关键词：Omi、HtrA2、Reaper、DIAP1、凋亡，果蝇属
像许多高等生物一样，黑腹果蝇在发育、形态发生和体内平衡过程中广泛使用受控的细胞死亡或凋亡来塑造和维护各种组织和器官。在哺乳动物中，大量实验证据表明线粒体在固有细胞死亡途径中起着重要作用，这一点令人信服。1然而，在果蝇属线粒体蛋白在固有细胞死亡中的作用和机制尚不清楚，2尽管有细胞色素改变的报道c（c）细胞死亡前立即在苍蝇中显示，三以及存在两种Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）样蛋白，Debcl/dBorg1/dRob1（促凋亡）和dBorg2/Buffy（抗凋亡）。4然而，最近的一份报告表明线粒体断裂在果蝇属细胞凋亡。5
在果蝇属凋亡抑制蛋白（IAP）的几种拮抗剂Reaper、Grim、Hid、Sickle和Jafrac-2统称为IAP拮抗剂，已被鉴定为在细胞死亡中发挥重要作用。6–10在哺乳动物中，只有两种IAP拮抗剂Smac（第二线粒体衍生激活剂）/DIABLO（低pI的直接IAP结合蛋白）和Omi/HtrA2得到了很好的鉴定。11与果蝇属IAP拮抗剂主要位于胞浆中，Smac/DIABLO和Omi/HtrA2是位于线粒体膜间隙的线粒体蛋白。The only structural or sequence homology between the果蝇属哺乳动物IAP拮抗剂是一种位于N末端的四肽，它构成了一个典型的IAP结合基序（IBM）。12在果蝇属注定死亡的细胞，其抗凋亡功能果蝇属IAP1（DIAP1）被IAP拮抗剂阻遏。12IAP拮抗剂通过破坏DIAP1-胱天蛋白酶的结合和/或通过蛋白酶体途径诱导DIAP1的自身泛素化和降解，从而减轻其对胱天蛋白酶的抑制，从而促进细胞死亡。6,10,13–19
最近的几项研究表明，哺乳动物Omi/HtrA2是一种丝氨酸蛋白酶，作为前体合成，转移到线粒体膜间空间，在那里通过蛋白水解裂解加工成成熟形式，导致其IBM暴露。20–23在凋亡刺激下，Omi/HtrA2被释放到胞浆中，在胞浆中促进caspase依赖性凋亡，其部分机制与Smac/DIABLO类似，24,25通过阻止XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶结合，或通过破坏已经形成的XIAP–半胱氨酸蛋白酶复合物。此外，Omi/HtrA2可以通过降解和灭活IAP间接诱导caspase依赖性凋亡。26–28Omi/HtrA2也在半胱天冬酶非依赖性细胞死亡中起作用，20也许是因为它是一种蛋白酶，可以切割细胞的重要结构和调节成分。除了其凋亡功能外，Omi/HtrA2还作为应激传感器和伴侣在细胞稳态中发挥重要作用。29,30
如果一个细胞不想死亡，IAP拮抗剂和IAP需要分开。在哺乳动物中，这是通过在线粒体中隔离IAP拮抗剂Smac/DIABLO和Omi/HtrA2来实现的果蝇属然而，IAP拮抗剂位于细胞溶质中，并在凋亡过程中转移到线粒体。5因此，细胞生存要么是通过缺乏IAP拮抗剂基因转录，要么是通过IAP拮抗物的翻译后修饰，如磷酸化或泛素化来实现的（在Meier中综述et（等） 阿尔。,31迪泽尔和迈尔，32还有Vaux和Silke33). 迄今为止，还没有关于哺乳动物Smac/DIABLO或Omi/HtrA2的类似调节机制的报告。
由于细胞死亡途径在苍蝇和哺乳动物之间保存得很好，我们询问苍蝇中是否存在线粒体隔离IAP拮抗剂。为了解决这个问题，我们搜索了果蝇属Smac/DIABLO和Omi/HtrA2同源物的基因组数据库。在本研究中，我们描述了果蝇属线粒体丝氨酸蛋白酶，我们将其命名为dOmi/HtrA2(D类嗜红细胞增多症 奥米)因为它与哺乳动物Omi/HtrA2高度同源。我们证明dOmi/HtrA2是一种直接IAP结合蛋白，并定义了其在细胞死亡调节中的作用。当这篇论文在准备时，Igaki等。34和查拉等。35报告了dOmi/HtrA2的特征及其与IAP的相互作用。我们的结果扩展了他们的观察，提供了成熟dOmi/HtrA2亚型的精确N端氨基酸序列，这与他们的研究中预测的不同，以及DIAP1中的精确dOmi/HtrA2裂解位点，这两个位点都是由Edman直接降解决定的。此外，我们首次表明热应激激活了转基因dOmi/HtrA2果蝇属通过DIAP1转基因表达可以挽救眼盘诱发眼球消融。我们的生化数据表明，DIAP1介导的dOmi/HtrA2的多泛素化可能与DIAP1的这种保护作用有关。
结果
dOmi定位于线粒体，在细胞凋亡过程中释放到胞浆中
要识别果蝇属哺乳动物Omi/HtrA2的同源基因，我们搜索了D.黑腹果蝇公共GenBank数据库使用tBLASTn程序，用于编码与人类Omi/HtrA2蛋白高度同源的蛋白质的基因。这导致识别出一个果蝇属染色体3R上的基因（CG8464），编码422氨基酸蛋白（GenBank登录号{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“AAF55062”，“term_id”：“7299887”}}AAF55062型)其与人Omi具有51%的同源性并且在下文中被指定为dOmi/HtrA2。用PSORT（蛋白质排序）算法进行的计算机分析表明，dOmi在其N末端（残基1-60）包含一个线粒体靶向序列（MTS），然后是跨膜结构域（TM，残基64-73），因此被预测为线粒体蛋白质，就像其哺乳动物的直系同源物一样。在TM结构域之后，dOmi包含类胰蛋白酶蛋白酶结构域（残基74-337）和C末端PDZ结构域（338-410）(). 全长cDNA克隆({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BF499650”，“term_id”：“13691508”}}BF499650型)从基因组及其表达的集成分子分析（IMAGE）联盟获得，并通过测序进行验证，以编码全长dOmi。
dOmi的表达、亚细胞定位和蛋白水解活性。(一)的域结构示意图果蝇属与人类Omi/HtrA2相比，Omi显示MTS、TM域、蛋白酶域和C末端PDZ调节域。指出了分别产生成熟dOmi-L和dOmi-S的A74和A93处的两个加工位点。成熟人类Omi/HtrA2通过A133处理产生。(b条). dOmi在全蝇裂解物中的内源性表达。用SDS-PAGE分离越来越多的苍蝇裂解物（5–30µg），然后用抗dOmi抗体进行蛋白质印迹。(c（c）)用抗dOmi多克隆抗体对未感染的Sf9细胞（1和2道）和dOmi-杆状病毒感染的Sf9细胞（3和4道）的线粒体（MF）和细胞溶质（CF）部分进行Western blot分析。请注意，内源性Sf9-Omi在MF中检测到，但在未感染Sf9细胞的CF中未检测到（第1道）。过度表达的dOmi主要存在于线粒体部分（通道4）。由于过度表达，在细胞溶质部分可检测到低水平的dOmi（第3通道）。(d日)在紫外线诱导的细胞死亡过程中，内源性dOmi从线粒体转移到细胞质果蝇属S2电池。紫外线处理后，用抗dOmi抗体免疫沉淀细胞溶质（CF）和线粒体（MF）组分，然后用相同的抗体进行免疫印迹分析。(e（电子）)昆虫Omi对非生理底物β-酪蛋白的蛋白质分解活性。内源性Sf9-Omi（第8和第9道）或过度表达的dOmi，分别来自未感染Sf9或dOmi-杆状病毒感染的Sf9细胞，使用dOmi－抗体或非特异性前免疫血清（IgG）进行免疫沉淀（IP），如图所示。IP与35S标记的β-酪蛋白，然后通过SDS-PAGE分离，然后进行放射自显影。通道1显示与缓冲对照培养后的β-酪蛋白。通道2和通道4与纯重组dOmi孵育后显示β-酪蛋白
为了表征dOmi/HtrA2的功能，我们制备了一种针对细菌产生的dOmi（残基92-422）的多克隆抗血清，并用它来检测dOmi的表达和亚细胞定位。对成年苍蝇全细胞裂解物的Western blot分析显示存在三种蛋白质物种：最大的物种对应于未加工的dOmi，而两个较小的加工物种可能代表成熟的dOmic形式(). 为了确定dOmi的亚细胞定位，我们从Sf9昆虫细胞中分离出细胞溶质和线粒体部分，并对其进行western blot分析。抗dOmi抗体在线粒体部分检测到两种成熟形式的内源性Omi，但在细胞溶质部分未检测到(，第一和第二车道）。使用编码全长dOmi的杆状病毒短暂过表达全长dOmi，导致这些细胞线粒体部分中成熟dOmi的表达水平急剧增加(，第四条车道）。然而，可能是由于杆状病毒诱导的细胞死亡和dOmi的过度表达，在细胞溶质部分也发现了少量成熟的dOmi(，第三条车道）。这些结果表明，dOmi和它的哺乳动物同源基因一样，是一种线粒体蛋白。
为了确定凋亡刺激对dOmi亚细胞分布的影响，我们果蝇属S2细胞，然后将细胞分离成胞浆和线粒体部分。由于dOmi在S2细胞中低水平表达，我们从细胞溶质和线粒体部分免疫沉淀dOmi。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离免疫沉淀物，并用免疫印迹法进行分析。如所示紫外线处理S2细胞导致dOmi从线粒体转移到胞浆。这些结果表明，dOmi与哺乳动物的直系同源物一样，在细胞凋亡过程中从线粒体中释放出来，进一步表明其功能可能与哺乳动物的Omi类似。
为了验证dOmi具有蛋白水解活性，我们用35S标记的β-酪蛋白。如所示，重组dOmi能够将β-酪蛋白切割成放射自显影可见的较小片段。我们还用dOmi特异性抗体从未感染和dOmi-杆状病毒感染的Sf9细胞中免疫沉淀内源性dOmi35S标记的β-酪蛋白(). 本实验表明内源性Sf9-Omi和重组dOmi都能裂解35S标记的β-酪蛋白，表明昆虫Omi具有蛋白水解活性。
线粒体中dOmi的成熟产生两种具有不同IBM的亚型
线粒体中Omi/HtrA2的成熟涉及N-末端MTS的蛋白水解去除。在人类Omi/HtrA2的情况下，这种成熟暴露出一个具有AVPS序列的保守N-末端IBM，20–23其中Ala是第一个N末端残基。在细胞死亡期间，成熟Omi/HtrA2释放到细胞液中后，它通过其IBM与IAP结合，并阻止它们与活性半胱天冬酶结合和/或直接降解为非活性片段。26–28为了确定线粒体中的dOmi成熟是否产生N端IBM，我们用C端His表达了dOmi的全长前体形式6-使用重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中标记。该重组dOmi在Talon珠上进行亲和纯化，并通过SDS-PAGE进行分离。考马斯蓝染色()通过western blotting发现两种加工后的亚型大小与在苍蝇裂解物中观察到的dOmi成熟亚型相似()除未加工的前体形式外。通过自动Edman降解对两种加工亚型进行的序列分析表明，较大亚型（dOmi-L）始于Ala75，而较小亚型（d Omi-S）始于Ser94。dOmi-L（AVVS）的前四个残基的N末端序列与在其他IAP-结合蛋白中发现的典型IBM非常一致(). 相反，较小的dOmi-S亚型（SKMT）的前四个残基的N末端序列与标准的IBM不一致。然而，以Ser残基开始的其他具有IBM的蛋白质已被证明与IAP结合，例如caspase-7的小亚基（SGPI）36谷氨酸脱氢酶（SEAV）。37这些观察结果表明，两种成熟的dOmi亚型可能与果蝇属IAP，就像成熟的Omi/HtrA2与哺乳动物IAP结合一样。
成熟dOmi的N末端含有IAP结合基序。(一)考马斯蓝染色膜显示全长（未加工）dOmi和两种加工成熟形式dOmi-L和dOmi-S。dOmi-的制备是从Talon珠上感染dOmi-baculovirus的Sf9细胞的线粒体部分纯化而来，然后通过SDS-PAGE进行分离。(b条)显示几种含IBM-蛋白的加工N末端序列的图表。保守的IBM序列以红色显示。dOmi-L和dOmi-S与其他IBM具有相似性(c（c）)体外与…互动35他的标有S的XIAP（上面板）或DIAP1（下面板）6-固定在塔龙树脂上的dOmi标记变体（dOmi-L、dOmi-A/P和dOmi-S）。伊斯6-标记的hOmi（第6车道）和Smac（第7车道）被用作阳性对照。伊斯6-标记的GST（第2车道）用作阴性对照。dOmi-L-（A/P）代表突变体dOmi-L，其中IBM中的第一个Ala残基突变为Pro
为了测试成熟的dOmi亚型是否能与IAP结合，我们固定了C末端His6-在泰龙珠上标记dOmi-L和dOmi-S亚型，然后在4°C下用在体外-翻译的35标有S的XIAP和DIAP1。塔龙珠结合谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-His6用作阴性对照。显示dOmi-L和dOmi-S都与XIAP和DIAP1强结合。成熟的dOmi亚型与XIAP和DIAP1的结合效率与成熟形式的人Omi/HtrA2和Smac/DIABLO的结合效率相当。然而，当IBM的第一个丙氨酸残基被脯氨酸取代时（第四通道上面板和第五通道下面板），dOmi-L与XIAP和DIAP1的结合显著减少，证实了第一个丙酸在IAP结合中的作用。我们没有观察到GST-His之间的任何交互作用6和DIAP1或XIAP，表明dOmi亚型和IAP之间的相互作用是特定的。
dOmi结合并分裂果蝇属国际会计准则
IAP降解是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在发育过程中激活的重要机制。33这个果蝇属IAP拮抗剂在发育或DNA损伤期间诱导，与DIAP1的BIR2（杆状病毒凋亡抑制重复序列2）结构域结合，导致其泛素化并随后通过蛋白酶体途径降解。38鉴于dOmi是一种丝氨酸蛋白酶，我们询问成熟dOmi-亚型是否与果蝇属IAP还可以通过dOmi的蛋白水解活性导致其降解。因此，我们在室温下将DIAP1或DIAP2与越来越多的野生型（WT）dOmi-L或非活性S266A-dOmi/L突变体孵育1小时。如所示，WT dOmi-L，但不是蛋白水解不活跃的S266A-dOmi/L突变体，以剂量依赖的方式将DIAP1和DIAP2切割成更小的片段，表明这些蛋白质是dOmi的生理底物。
dOmi结合并降解DIAP1和DIAP2。(一)35如图所示，在25°C下，将S标记的DIAP1（上面板）或DIAP2（下面板）与越来越多的野生型dOmi或非活性S266A突变型dOmic（50、100和250 nM）孵育1小时。然后通过SDS-PAGE对样品进行分级，然后进行放射自显影。(b条)35S标记的DIAP1（上部面板）或DIAP2（下部面板）与指示的6-标记GST、GRIM或野生型dOmi或固定在Talon珠上的非活性S266A突变体dOmi4°C下1小时。结合后，清洗珠结合复合物，然后在室温下再培养30分钟。然后用SDS-PAGE对样品进行分级，然后进行放射自显影。(c（c）)考马斯染色SDS凝胶显示DIAP1被dOmi-L或dOmi-S裂解。在4°C下，dOmi/L或dO mi-S与谷胱甘肽琼脂糖珠上的GST标记的DIAP1（DIAP1-C-GST）或GST结合1小时。结合后，清洗珠结合复合物，然后在室温下再培养30分钟。然后用SDS-PAGE对样品进行分级，然后进行考马斯染色。(d日)DIAP1连接子突变对成熟dOmi-L降解DIAP1的影响。等量的细菌表达全长野生型（WT）DIAP1（2-4道）、DIAP1-I165D（5-7道）或DIAP1-1162和165D（8-10道）与谷胱甘肽Sepharoset™4B珠结合，然后与1或2µl成熟dOmi-l在22°C下培养1小时，如图所示。孵育期结束后，清洗珠结合蛋白，然后进行SDS-PAGE，然后进行考马斯染色。注意，DIAP1突变体（通道5、6、8和9）经历了不完全降解，而WT DIAP1（通道2和3）经历了完全降解。DIAP-115165D（表示为*)和DIAP1-I162和165D（表示为**)，表明与WT DIAP1（用←表示）相比，卵裂位点发生了移动。WT和突变DIAP1-GST中的卵裂位点如图所示，位于凝胶上方。箭头表示解理位置
为了确定dOmi-生成的DIAP1或DIAP2片段是否包含完整的BIR结构域，因此与dOmi保持关联，我们在室温下用Talon bead-bound WT dOmi-L或非活性S266A-dOmi-L突变体培养DIAP1和DIAP2。Talon珠边GRIM和GST-His6用作对照。孵育期结束后，清洗珠子，通过SDS-PAGE对珠子结合复合物进行分级，并通过放射自显影术进行可视化。如所示（左上方面板），dOmi-L对DIAP1的裂解产生了一个独特的裂解片段，该片段仍然与结合珠的dOmi/L相关，表明它包含一个完整的BIR结构域。相反，没有一个DIAP2片段与dOmi-L相关，表明dOmi/L对DIAP2的裂解破坏了DIAP2 BIR结构域(，左下面板）。正如预期的那样，当DIAP1或DIAP2与蛋白水解不活跃的S266A-dOmi-L突变体结合时，未观察到其分裂（右侧面板）。此外，未观察到GRIM结合的DIAP1或DIAP2降解，也未观察到DIAP与GST-His的显著结合6已检测到。
dOmi对DIAP1的切割产生一种独特的切割产物，该产物保留了与dOmi相互作用的能力(). 为了鉴定这个切割位点，我们在细菌中产生了一个重组DIAP1融合蛋白，其C末端带有GST标记。将DIAP1-C-GST融合蛋白固定在谷胱甘肽琼脂糖微球上，然后在4℃下与细菌产生的成熟dOmi-L或dOmi-S结合1h。清洗珠结配合物，然后用SDS-PAGE进行分析。如所示dOmi-L或dOmi-S与DIAP1-C-GST结合产生60-kDa DIAP1裂解产物。切割没有将DIAP1-dOmi复合物从谷胱甘肽sepharose珠中分离出来，这表明切割位点位于DIAP1的N末端，因为GST标记位于DIAP1C末端。事实上，通过自动Edman降解对裂解产物进行的N末端序列分析表明，裂解发生在DIAP1的I165和G166之间的剪切肽键中，该键位于BIR1和BIR2结构域之间的连接区。
P1位非极性脂肪族残基的选择性（紧邻可溶键的N端）似乎与人类Omi/HtrA2的类似。39为了确定用带电的天冬氨酸残基取代裂解部位的I165对dOmi介导的DIAP1裂解的影响，我们用dOmi-L培养WT或突变的I165D DIAP1-C-GST，然后用SDS-PAGE分析裂解产物。如所示用天冬氨酸替代I165可以减少dOmi-L和dOmi-S对DIAP1的切割，但并没有完全消除。有趣的是，I165D替代将切割转移到相邻的位置，正如突变型I165D DIAP1-C-GST中出现的两个切割产物，而不是WT蛋白中的一个切割产物所证明的那样。由于在位置162处有一个Ile，I165D突变体的额外切割产物可能是Ile162和Met163之间的剪切键断裂的结果。然而，用天冬氨酸残基取代I165和I162减少了但并没有消除裂解，从新产物的大小来看，裂解已立即转变为一个可剪断键，即N末端到Ile165和Ile162(). 总之，这些结果表明，dOmi与DIAP1的结合导致DIAP1中BIR1和BIR2之间连接区的dOmi-选择性断裂。
由于dOmi仍然与60-kDa的珠结合DIAP1裂解产物结合()，这表明dOmi优先绑定到DIAP1的BIR2域。为了证实这一点，我们在细菌中产生了N末端GST-标记的BIR1（GST-BIR1-1-165）和BIR2（GST-BIR2-RING-166-438）融合蛋白。这些蛋白与蛋白水解不活跃的S266A dOmi-L或dOmi-S突变体孵育，然后将所得蛋白复合物与谷胱甘肽sepharose珠结合。通过SDS-PAGE对珠结合复合物的分析表明，dOmi亚型结合到GST-BIR2-RING-166-438和GST-BIR1-1-165(). 然而，dOmi亚型与GST-BIR2-RING-166-438的亲和力高于GST-BIR1-1-165()表明dOmi亚型优先与DIAP1的BIR2结构域相关。有趣的是，当GST-BIR1-1–165或GST-BIR2-RING-166–438与WT dOmi-L或dOmi-S结合时，观察到GST-BIR-1-165的降解，而不是GST-BIR2-RING-166–438的降解(). 这些结果表明，dOmi亚型优先与DIAP1的BIR2结构域结合，但优先裂解连接区和BIR1结构域().
dOmi优先绑定到DIAP1的BIR2域。(一)全长DIAP1和分离的DIAP1-BIR结构域与成熟蛋白酶激活的dOmi-L或dOmi-S的相互作用。S266A dOmi_L或dO mi-S与C末端GST-标记的DIAP1（DIAP1-C-GST）或N末端GST标记的BIR1（GST-BIR1-1-165）或BIR2-RING（GST-BIR2-LING-166-438）结合，或谷胱甘肽-Sepharoset™4B珠在4°C下1小时的GST，如图所示。结合后，清洗珠结合复合物，然后通过SDS-PAGE进行分离，然后进行考马斯染色。注意，dOmi的两种成熟形式（dOmi-L和dOmi-S）都绑定到全长DIAP1-C-GST，并且优先绑定到GST-BIR2-RING-166-438。(b条)与中的相同(一)但使用野生型（WT）dOmi-L和dOmi-S。请注意，WT dOmi（dOmi/L和dO mi-S）的两种成熟形式都会裂解GST-BIR1-1-165，而不是GST-BIR2-RING-166-438。(c（c）)DIAP1的结构域图，显示BIR1、BIR2和RING指结构域，以及通过自动Edman降解确定的BIR1和BIR2之间的连接区中的dOmi切割位点。该图说明了dOmi通过其IBM绑定到DIAP1的BIR1和BIR2域，并切割了DIAP1 BIR1与BIR2之间的链接器区域。(d日)35如图所示，在室温下用WT dOmi（WT）或非活性S266A突变dOmi（S266A）培养S-标记的DIAP1-BIR1-连接域（DIAP1-165）1小时。然后通过SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分级
为了提供更多证据证明dOmi与DIAP1的BIR1-linker区域的结合会导致额外的N末端对I165的裂解，我们将纯化的dOmi-L或dOmi-S与35S标记的DIAPI-BIR1（残基1-165）。如所示dOmi-L或dOmi-S与DIAP1-BIR1-连接区的孵育导致其进一步降解为更小的片段，这表明dOmi不仅在I165处裂解，而且还进一步降解结合的BIR1-链接区，使其完全失活。这些结果强调了Omi的蛋白水解活性不是混杂的概念，但选择性地靶向蛋白质底物中的特定区域如DIAP1的BIR1和连接区。
dOmi减轻DIAP1抑制中的胱天蛋白酶
已显示DIAP1抑制果蝇属效应器半胱天冬酶DCP-1和DRICE(果蝇属白细胞介素-1β-转化酶）通过其BIR1结构域。10dOmi与DIAP1结合并降解其BIR1-linker区域的能力表明，dO mi可能会消除DIAP1的半胱天冬酶抑制活性。因此，我们测试了纯化的dOmi-L和dOmi-S蛋白对DIAP1抑制DCP-1和DRICE能力的影响在体外caspase激活系统。用四肽底物DEVD-AFC测定，DCP-1或DRICE与DIAP1孵育会抑制其caspase活性。然而，向反应混合物中添加dOmi-L或dOmi-S几乎完全抑制了DIAP1活性，这可以通过恢复果蝇属半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（DCP1）和DRICE活性(). dOmi-L（A75P）或dOmi-S（S94P）的IBM中的点突变完全取消了它们的caspase促进活性，这表明dOmi/L和dOmi_S抑制DIAP1活性的能力主要取决于它们与DIAP1结合的能力。有趣的是，蛋白酶活性位点（S266A）的点突变显著降低但没有消除dOmi-L和dOmi-S的caspase促进活性，这表明dOmi降解DIAP1对最大caspase激活也很重要。总之，我们的结果表明，dOmi特异性地靶向DIAP1的BIR1结构域，并且其IBM和蛋白酶活性都是DIAP1 caspase抑制活性的最大拮抗所必需的。
dOmi使DIAP1的caspase抑制活性失活。(一)野生型dOmi-L和dOmi-S对DIAP1活性的抑制。纯化的DCP1（10 nM）与DIAP1（250 nM）预先孵育，然后增加所示dOmi变体的数量（50、100和250 nM。在25°C下，在DEVD-AFC（100µM）作为底物存在下进行反应15分钟。每个反应的活性表示为从底物释放的相对荧光单位（RFU）。dOmi-L-（A/P）表示IBM中第一个Ala残基突变为Pro的突变dOmi/L。dOmi-S-（S/P）表示IBM中第一个Ser残基突变为Pro的突变dOmi-S。(b条)与相同(一)除了用纯化的DRICE（10 nM）替换DCP1并用200 nM DIAP1预培养
DIAP1抑制dOmi诱导的细胞死亡果蝇属眼盘
Omi被隔离在线粒体中，通过其PDZ和蛋白酶域之间的广泛分子内相互作用而保持非活性构象。40最近的研究表明，在应激条件下，Omi通过PDZ结构域与错误折叠的蛋白质结合或通过p38介导的磷酸化来保护线粒体而被激活。41,42研究线粒体定位Omi蛋白水解活性失调对果蝇属在眼睛发育过程中，我们利用pGMR（Glass multimer reporter）载体，在Glass转录激活剂的控制下，生成了表达全长dOmi或组成活性dOmi-ΔPDZ的转基因果蝇。玻璃在眼睛发育过程中表达，从幼虫的眼睛影像盘（成人的前身）开始果蝇属眼睛）。在蛹和成年发育期间，它继续在眼睛中特异表达。43我们发现，在大多数转基因株系（14/19株系）中，甚至在纯合子中，pGMR衍生的全长线粒体定位dOmi的表达并没有扰乱眼睛的发育(，面板2）。相反，pGMR-衍生的组成性活性dOmi-ΔPDZ的表达在大多数行（25/31行）中引起了眼球消融(，面板3）。这些结果表明，WT-dOmi在其适当环境（线粒体）中的过度表达不会导致细胞死亡，可能是因为dOmi与哺乳动物Omi一样，在正常条件下处于非活性构象。41,42这与奥密克戎在线粒体中的生存功能一致。29,30然而，通过删除PDZ结构域来失调dOmi的蛋白酶活性会导致细胞死亡，这表明必须严格调节dOmi的活性才能使细胞存活。
dOmi过度表达对果蝇属眼睛发育。(一)体外表达全长dOmi和ΔPDZ-dOmi对果蝇属眼睛发育。面板1显示野生型（WT）眼睛（GMR-Gal4作为阴性对照）；第2组，GMR驱动全长dOmi（纯合转基因）过度表达的典型眼部表型；小组3，由GMR驱动的dOmi过度表达引起的眼部表型，其中一个负调控域被移除（ΔPDZ，纯合转基因）。展板4-6展示果蝇属抗dOmi免疫染色眼影盘。请注意，与野生型（第4组）相比，第5组和第6组中的dOmi水平增加，并且dOmi的过度表达水平与ΔPDZ形式类似(b条)热应激激活dOmi可诱导眼球消融，DIAP1的表达可抑制这种眼部表型。转基因果蝇属（雌性，X染色体上的转基因）在眼睛中表达全长dOmi，当维持在25°C时显示正常的眼睛表型（第一组）。然而，当幼虫期保持在30°C时（见材料和方法），它们表现出严重的眼部消融表型（第二组）。这种消融完全依赖于dOmi的表达（第三组：对照组仅显示DIAP1的表达；WT苍蝇保持在301°，以及DIAP1过度表达的苍蝇保持25°，也显示WT表型，未显示）。这种眼部表型被眼睛中共同表达的DIAP1抑制（第四组）。(c（c）)DIAP1诱导dOmi泛素化。净化了他的6-标记的dOmi（100 ng）与泛素（3µg）、DIAP1（400或800 ng）和果蝇属如图所示，胚胎提取物（10µg）在37°C的泛素化缓冲液（20µl）中放置1小时。然后用抗-His抗体进行免疫印迹分析反应，以检测dOmi泛素化。注意dOmi在含有DIAP1和果蝇属胚胎提取物（第四和第五通道），但不存在DIAP1（第三通道）。(d日)DIAP1诱导的dOmi泛素化依赖于dOmi中完整的IBM基序。净化了他的6-标记的突变体dOmi-A74P（第一到第四车道）或dOmi-WT（第五和第六车道）进行泛素化，然后按照(c（c）). 注意，DIAP1不会诱导dOmi-A74P突变体的泛素化，因为A74P突变破坏了dOmi的N末端IAP结合基序。(e（电子）)dOmi诱导DIAP1的自动泛素化。净化了他的6-标记的dOmi-WT（第一至第四泳道）或突变体dOmi-A74P（第五泳道）与DIAP1一起或不与DIAP1一起孵育，如在类似于(c（c）). 然后用抗DIAP1抗体（上面板）或抗His抗体（下面板）进行免疫印迹分析反应产物
最近的结果表明，应激刺激通过p38应激激酶途径激活Omi。41由于已知热应激可激活p38通路，我们研究了热应激对WT dOmi过度表达果蝇眼睛发育的影响。GMR-dOmi幼虫要么在室温下保存，要么在30°C下孵育5天。然后对新封闭的成虫的眼睛进行检查。如所示（第1组），在室温下饲养的GMR-Omi苍蝇的眼睛是正常的。相比之下，热应激的GMR-dOmi苍蝇的眼睛显示出与GMR-dOmi-ΔPDZ苍蝇相似的异常(，图2），表明dOmi活性在应激条件下增加。在301C-处理的未过度表达dOmi的WT苍蝇中未观察到这种表型，这表明这种效应是由热应激下dOmi-活性增加介导的(，面板3）。
考虑到DIAP1可以与dOmi特异性相互作用，我们测试了DIAP1在应激条件下保护细胞免受dOmi-活性增加的可能性。因此，我们将GMR-dOmi苍蝇与GMR-DIAP1苍蝇杂交，并测试热应激对眼睛发育的影响。有趣的是，DIAP1的过度表达大大降低了dOmi过度表达引起的热应激诱导的眼部异常(，面板4；与面板2相比）。
DIAP1多泛素dOmi
鉴于DIAP1具有泛素连接酶活性，DIAP1可能通过直接靶向dOmi的泛素化和蛋白酶体降解来对抗dOmi.的活性。为了检验这种可能性，我们在含有或不含有DIAP1的反应混合物中培养dOmi-L果蝇属胚胎提取物和泛素。如所示dOmi在有DIAP1存在时是多泛素化的，但在没有DIAP1时不是。此外，DIAP1诱导的dOmi泛素化依赖于完整的dOmi IBM基序，因为用Pro替代Ala75可以完全阻止dOmi-泛素化(). 由于A75P突变体dOmi-L与WT dOmi/L相比，对DIAP1的亲和力非常低()这些结果表明，需要dOmi与DIAP1的强烈相互作用来刺激DIAP1中的E3连接酶活性，以介导dOmi-的泛素化。
为了确定dOmi-L与DIAP1的相互作用是否也能刺激其自身泛素化活性，我们将DIAP1与WT或A75P突变体dOmi/L和果蝇属胚胎提取物和泛素，然后用DIAP1特异性抗体进行免疫印迹分析反应产物。如所示，WT dOmi能够诱导DIAP1（第四车道，上面板）的强大自动泛素化，并且自身被DIAP1泛素化（第四通道，下面板）。相反，A75P突变体dOmi-L诱导的DIAP1（第五通道，上面板）的自泛素化更少，并且没有被DIAP1泛素化（第五车道，下面板）。综上所述，我们的数据表明，dOmi和DIAP1之间的相互作用调节了dOmi与DIAP1的泛素化，并且该过程可能在细胞死亡和存活的调节中发挥重要作用。
讨论
DIAP1是发育性细胞死亡的重要调节因子果蝇属，其丢失会导致胚胎死亡。DIAP1结合并直接抑制果蝇属引发剂caspase Dronc(果蝇属Nedd2-like caspase）和效应caspase DCP1和DRICE（在Meier中综述等。,31迪泽尔和迈尔，32还有Vaux和Silke33). IAP拮抗剂Reaper、Hid、Sickle和Grim缓解了对Dronc、DCP1或DRICE的DIAP1抑制，这是在程序性细胞死亡过程中诱导的细胞质蛋白。6,10,13这些蛋白质对发育中的细胞死亡也至关重要果蝇属它们通过破坏DIAP1–caspase关联和/或通过蛋白酶体途径诱导DIAP1的自泛素化和随后的降解来触发。15–19
本研究描述了第一个线粒体隔离IAP拮抗剂dOmi/HtrA2的特性D.黑腹果蝇虽然dOmi可以通过直接诱导其降解来拮抗DIAP1抗凋亡活性，但我们证明DIAP1可以诱导dOmi的多泛素化，也可以拮抗dOmi-诱导的细胞死亡，提示DIAP1可能在防止dOmi（以及潜在的其他线粒体IAP结合蛋白，如果它们存在于果蝇属)进入细胞质。
我们的数据显示，在培养的细胞中，dOmi在诱导细胞凋亡时从线粒体中释放果蝇属S2电池。与哺乳动物同类一样，dOmi在线粒体中进行蛋白水解处理以去除其MTS。然而，dOmi的蛋白水解成熟会产生两种具有不同IBM的异构体。使用大规模亲和纯化过程，我们从昆虫细胞线粒体中纯化了这些亚型，并通过Edman降解测定了其精确的N-末端氨基酸序列。这种直接的蛋白质序列分析表明，在G74↓AVVS产生dOmi-L亚型，在A93↓SKMT生成dOmi-S亚型。我们的结果与Challa最近报告的结果不同等。,35它使用SignalP计算机算法预测处理发生在A79↓AIIQ和A92↓ASKM生成两种成熟的dOmi亚型。这些差异引起了人们对计算机预测的成熟dOmi亚型获得的细胞死亡和IAP结合结果的生理相关性的极大关注。35事实上，与之前的结果相反，之前的结果仅证明了BIR2结构域的选择性结合，35我们的生化数据表明，这两种dOmi亚型与DIAP1的BIR1和BIR2结构域结合，但与BIR2结构区的亲和力较高。此外，与Challa的结果相反等。,35我们的数据表明，dOmi在与DIAP1的BIR2结构域结合时未能诱导或抑制DIAP1自身泛素化(). 这些不同的结果显然是由于我们的dOmi亚型的IBMs与之前研究中使用的计算机预测亚型的IBM之间的差异。35
我们的研究结果表明，dOmi与DIAP1的BIR1和BIR2结构域结合的能力可能会影响这两个结构域的caspase抑制活性。由于引发剂caspase Dronc和IAP拮抗剂与DIAP1的BIR2结构域的结合被证明是互斥的，6我们预测，dOmi与其他IAP拮抗剂一样发挥作用，从DIAP1中取代Dronc，从而阻止DIAP1介导的Dronc靶向泛素化。dOmi对DIAP1的作用延伸至DIAP1中的BIR1结构域，其功能是抑制效应半胱天冬酶DCP1和DRICE。我们的结果表明，dOmi与DIAP1的BIR1或BIR2结构域的结合促进了dOmi-介导的这些结构域之间连接区的断裂，并进一步降解BIR1结构域，导致DCP1和DRICE从DIAP1抑制中解放出来(). 这种dOmi介导的切割可能绕过在诱导凋亡过程中通过蛋白酶体途径泛素化和降解DIAP1的需要。在dOmi将DIAP1从效应半胱天冬酶中移出后，这种机制可能会阻碍半胱氨酸天冬酶-DIAP1再结合，并导致细胞凋亡。或者，dOmi介导的DIAP1降解可能使低浓度IAP拮抗剂诱导细胞凋亡，这与最近的观察一致，即线粒体通透性增强了对果蝇属IAP拮抗剂诱导的细胞。5由于小鼠遗传数据表明Omi在发育细胞死亡途径中不起关键作用，29,30我们推测，dOmi可能对发育性细胞死亡也不是必需的果蝇属然而，dOmi与DIAP1结合并通过直接降解或诱导其自身泛素化来对抗其生存活性的内在能力可能会在线粒体渗透和dOmi-释放到胞浆后，导致细胞死亡。
虽然生化数据表明DIAP1可以与dOmi相互作用，但这种相互作用是否发挥任何生理作用尚不清楚体内一种可能性是，这种相互作用可能是一种保护机制，以防止在线粒体应激条件下dOmi意外释放到细胞质中。事实上，我们的数据表明果蝇属眼盘诱发严重的眼球消融，这可以通过DIAP1的过度表达来挽救。鉴于DIAP1具有E3泛素连接酶活性，我们推测DIAP1通过IBM与dOmi结合可以刺激其E3泛素连接酶的活性，从而促进dO mi的多泛素化及其随后通过蛋白酶体途径的破坏。与这个假设相一致，我们的数据表明DIAP1确实可以以IBM-依赖的方式诱导dOmi的多泛素化。
总之，我们的数据表明，IAP的抗凋亡活性一般不限于直接抑制caspase，而可能扩展到保护含有IBM-的蛋白（如Omi）免受caspase非依赖性致死活性的伤害。鉴于许多线粒体蛋白质在线粒体中成熟后具有N末端IBMs，37我们的结果支持这样一种假设，即如果这些IBM通过IAP的E3泛素连接酶活性无意中释放到细胞质中，那么它们在线粒体蛋白中的存在标志着它们被破坏。因此，细胞质中IAP和含有IBM的蛋白质的相对浓度可能决定细胞是活是死。例如，在正常应激条件下，细胞细胞质中现有的内源性IAP可以处理少量释放的含有线粒体IBM的蛋白质。然而，当含有IBM-的蛋白质的量超过IAP的内源性水平时，例如当dOmi在线粒体中过度表达时，其应激诱导释放将导致细胞死亡。这可以解释为什么DIAP1的过度表达可以防止热应激激活的dOmi诱导的细胞死亡。
材料和方法
重组蛋白的cDNA克隆与表达
全长dOmi cDNA克隆来自IMAGE联盟（Invitrogen；GenBank™登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BF499650”，“term_id”：“13691508”}}BF499650型). 构造编码C端子His6-标记的全长dOmi或截短突变体是使用改良的互补PCR适配器引物通过PCR产生的。编码包含全长DIAP1、DIAP1-BIR1（1-165）或DIAP1-BIR2-RING（166-438）的C-末端GST融合蛋白的质粒在大肠杆菌菌株BL21（DE3）使用我们实验室制造的改良pET21a载体（该载体具有C末端GST）。全长XIAP、DIAP1和DIAP2为在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 使用前面描述的Flag-C-pcDNA3构建物，网织红细胞裂解物中的蛋氨酸。20成熟dOmi及其突变体在BL21（DE3）细菌中作为C末端His过度表达6-使用pET-21a载体标记蛋白质。细菌产生的蛋白质缺乏引发剂蛋氨酸，因为它在甲硫氨酸氨肽酶翻译后被去除。因此，从不同氨基酸残基开始生产蛋白质是可能的。
Sf9昆虫细胞中成熟dOmi的大规模生产
一种编码全长dOmi并带有C末端His的杆状病毒6通过标准程序使用pVL-1393转移载体生成标签。将Sf9细胞接种在20个T175组织培养瓶中，然后感染dOmi杆状病毒。感染后48小时，收集细胞并在缓冲液A（20 mM 2-[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]-乙磺酸，pH 7.5，10 mM KCl，1.5 mM MgCl）中溶解2，1 mM乙二胺四乙酸，1 mM-乙二醇双（二甲氧基乙醚）N、 N，N’，N’-四乙酸、250 mM蔗糖、1 mM二硫苏糖醇、0.1 mM苯甲基磺酰氟，含蛋白酶抑制剂混合物）。总裂解物在800×克去除细胞核，然后以12500×克获得线粒体颗粒。粗线粒体颗粒在含有洋地黄素的缓冲液中溶解，以14000×克，然后将所得上清液与TALON™琼脂糖在4°C下结合1小时。将珠结合的蛋白质洗涤三次，然后通过SDS-PAGE进行分级。与dOmi成熟形式对应的条带用考马斯蓝染色，从凝胶中切除，然后进行Edman降解。
更多实验细节和试剂见补充信息.
致谢
我们感谢Bruce Hay的反DIAP1。我们还感谢布卢明顿库存中心果蝇属股票。本研究得到了NIH拨款GM076176（ESA）、CA78890（ESA”）和GM50231（JBJ）以及NSF拨款IOB-0416760（JBJ”）的支持。FSK得到了NRSA奖T32-CA09678的支持。
缩写
| BIR公司 | 杆状病毒凋亡抑制因子重复序列 |
| 迪亚布罗 | 低蛋白I的直接IAP结合蛋白 |
| 直径1 | 果蝇凋亡抑制蛋白1 |
| DCP1（DCP1） | 果蝇半胱天冬酶1 |
| 多米 | 果蝇属奥米 |
| DRICE公司 | 果蝇属白细胞介素-1β转化酶 |
| Dronc公司 | 果蝇属类Nedd2半胱天冬酶 |
| GMR公司 | 玻璃多聚物报告器 |
| 消费税 | 谷胱甘肽-S公司-转移酶 |
| IAP公司 | 凋亡抑制蛋白 |
| 国际商用机器公司 | IAP-结合基序 |
| 图像 | 基因组的分子集成分析及其表达 |
| MTS公司 | 线粒体靶向序列 |
| 第PAGE页 | 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| PSORT公司 | 蛋白质分类 |
| 环 | 真有趣的新基因 |
| Smac公司 | 第二线粒体衍生激活物 |
| TM（TM） | 跨膜 |
| 重量 | 野生型 |
工具书类
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