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临床癌症研究。作者手稿；PMC 2009年5月12日提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2007年9月1日；13(17): 5001–5009.
数字对象标识：10.1158/1078-0432.CCR-07-0024
预防性维修识别码：项目经理2680916
尼姆斯：美国国家卫生研究院111129
PMID：17785550

骨髓微转移瘤的分离和分子分析扭转1乳腺癌患者早期肿瘤复发的标志物

马克·沃森,1 卢尔德·R·伊拉甘,1 凯瑟琳·特林考斯（Kathryn M.Trinkaus）,2 威廉·吉兰德斯,三 迈克尔·诺顿,4 凯瑟琳·魏尔巴彻（Katherine N.Weilbaecher）,4 蒂莫西·弗莱明,三和丽贝卡·拉夫特三，5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

目的

骨髓中检测到的微转移细胞对乳腺癌有预后意义。这些细胞是异质的，可能不表现出统一的生物学行为。为了了解骨髓中弥散癌细胞的分子多样性，我们在一项前瞻性临床试验的背景下，对接受新辅助化疗的临床II期/III期乳腺癌女性患者，丰富了该细胞群，并进行了全球基因表达谱分析。

实验设计

富集TACSTD1系统使用免疫磁珠从乳腺癌患者骨髓中获得（EpCAM）表达细胞。比较5名正常志愿者和23名新辅助化疗后乳腺癌患者的浓缩细胞群和全骨髓的基因表达谱。还分析了乳腺癌患者治疗前或1年随访时骨髓样本中的富集细胞（共87个数据集）。在一个独立的骨髓样本队列中，使用定量逆转录-PCR，乳腺癌患者富集细胞群中特异性检测到的转录物表达与1年临床结果相关。

结果

对富含EpCAM的骨髓细胞的分析显示一亚组转录物的特异性表达，包括转移调节因子，扭转1.确定的大多数成绩单，包括扭转1，在正常志愿者丰富的骨髓中没有表达，这表明该表达谱反映了化疗后持续存在的乳腺癌骨髓微转移的特征。在任何治疗前获得的一组独立骨髓样本中，扭转1表达与早期疾病复发相关。

结论

化疗后骨髓中的弥漫性乳腺癌细胞具有独特的转录特征。在这些细胞群中表达过多的基因，如扭转1，可能被证明是乳腺癌患者早期远处复发的良好标志。

转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。人们普遍认为，原发性肿瘤中只有一小部分独特的细胞具有转移潜能。因此，单纯通过去除增殖细胞来减轻原发性肿瘤质量的治疗往往无法治愈患者(1). 此外，原发性、异质性肿瘤的分子特征可能与最终进展为转移的肿瘤细胞的分子特征相似性有限(2). 为了了解转移过程并开发新的治疗策略来控制复发性疾病，转移肿瘤细胞的分子特征是至关重要的。

一些临床研究表明，乳腺癌患者骨髓中的播散性肿瘤细胞（DTC）是转移性疾病发展和整体预后不良的独立预测因子(三). 这项临床观察的拟议生物学基础是，骨髓是一个重要的贮存库，可使DTC适应并传播到其他器官(4). DTC可以持续数年，并且仍然是疾病复发的预测因素(5). 然而，超过60%的诊断时可检测到DTC的患者在中位随访6年后仍无复发(6)这表明并非所有DTC都有可能形成转移性疾病。化疗后骨髓中检测到DTC的患者预后特别差，这表明化疗并不能消除所有DTC，而细胞毒化疗后存活下来的DTC亚群具有很高的转移潜能(7). 差异基因和蛋白质表达研究证实了DTC的异质性(8)辅助治疗后，这种异质性降低(9).

DTC很少见；因此，需要一些有效的富集方案来在分子水平上表征这些细胞。许多浓缩方案依赖于阳性免疫磁性细胞分离和抗体TACSTD1系统抗原（EpCAM），因为其在上皮细胞上频繁且相对特异的表达(10,11). 约68%（范围48-100%）的细胞角蛋白阳性骨髓DTC为EpCAM阳性(12). 此外，乳腺癌中EpCAM的过度表达通常与预后不良和转移性疾病的发展有关(13). 到目前为止，EpCAM似乎是微转移细胞免疫选择的最佳靶点(11).

在本研究中，我们假设从乳腺癌患者化疗后骨髓中分离的DTC的基因表达谱将丰富具有高转移潜能的化疗持续性DTC，并确定与早期肿瘤复发相关的新的生物相关基因转录物。我们分析了23例临床Ⅱ/Ⅲ期乳腺癌患者的骨髓，这些患者接受了四个周期的新辅助表阿霉素/泰索帝化疗。在丰富的DTC人群中发现了一组表达的转录物，但在正常志愿者经过类似处理的骨髓中不存在。然后，在一组独立的相同治疗的患者中，这些转录物的一个子集的表达与1年内疾病复发的存在或不存在相关。其中一份记录，扭转1，是一个已知的肿瘤转移标志物，这表明该方法将产生其他潜在有用的标志物，用于预测乳腺癌患者转移疾病的发展。

材料和方法

研究人群

2003年至2006年，120名临床诊断为II或III期乳腺癌的患者被前瞻性纳入新辅助化疗试验。该方案得到了华盛顿大学机构审查委员会的批准，所有患者都签署了书面知情同意书。在开始治疗前、表柔比星/泰索帝四个周期完成后以及诊断后1年收集骨髓抽吸物。半数患者每3周接受一次唑来膦酸治疗。所有患者均在华盛顿大学的Siteman癌症中心接受治疗，并前瞻性地获得随访数据。平均随访时间为2年。所有分子分析均不考虑患者的临床病理状态。按照机构审查委员会批准的方案，在知情同意后，从五名健康志愿者采集骨髓样本。用于初始微阵列发现集和后续定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证研究的临床试验研究设计和骨髓样本来源见图1.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-111129-f0001.jpg

微阵列和qRT-PCR验证分析的研究设计和样本选择。从共120名参与表柔比星/泰索帝新佐剂试验的患者中，使用从25名新佐剂治疗前后患者中获得的79份样本进行微阵列分析(左边). 这些样本包括未分离的骨髓以及经过EpCAM或其他六种细胞表面抗原免疫选择的匹配骨髓样本。对于通过EpCAM免疫选择富集的样本，其中10个样本来自任何治疗前的患者，23个样本来自四个化疗周期后的患者，9个样本来自诊断后1y-16个月的患者，2个样本来自正常志愿者。对12例患者的双侧骨髓样本进行分析。在6例患者中，对新辅助治疗前后骨髓样本的表达谱进行了长期比较。在用六种抗体中的一种选择EpCAM后，来自两名患者的四份骨髓样本也进行了第二次浓缩。最后，对17个EpCAM选择的骨髓进行微阵列分析，但均未产生生物素化靶点(n个=7）或导致阵列上的探测集调用非常低(n个=10），表明没有从样品中捕获细胞。在任何治疗之前，从同一试验中的30名患者中选取50个样本作为独立组进行生物标记物验证(正确的).

骨髓抽吸和DTC浓缩

从乳腺癌患者的左右髂前嵴收集20毫升骨髓，并进行低渗红细胞溶解。对于全骨髓样本，5×106将有核细胞制成颗粒并快速冷冻，以便随后进行RNA分离。用于免疫富集，~5×107将有核细胞与EpCAM免疫磁珠（DAKO）在4°C下摇晃培养1h。磁隔离重复五次以优化细胞捕获。随后用冷PBS/1%FCS洗涤免疫磁珠，如先前报道的那样(11). 在一些实验中，剩余的流出物与六种生物素化抗体中的一种（CXCR4、骨桥蛋白、SCA-1、CD44、ABCG-2、EMMPRIN）孵育，这些抗体与亲和素磁珠偶联。使用磁粉浓缩器（Dynal MPC）分离免疫磁珠。然后将捕获的细胞进行snap冷冻以分离RNA。对于细胞角蛋白染色和qRT-PCR实验，使用标准Ficoll-Hypaque梯度技术富集整个骨髓中的单核细胞。

RNA分离和基因表达谱分析

最初对25名参与试验的患者的79份骨髓样本进行了微阵列表达谱分析。这些患者的特征总结如下补充表S1使用TRIzol试剂（Invitrogen）从整个骨髓或免疫选择的骨髓细胞中分离出总RNA。对于免疫选择的细胞样品，该方法缩小了10倍，并将酵母tRNA作为共沉淀剂添加到细胞裂解液中。使用安捷伦生物分析仪和RNA纳米芯片分析法对与免疫选择样品平行处理的总骨髓样品中的RNA进行定量和定性评估。由于免疫选择细胞的RNA产量预期较低，因此这些RNA没有进行定性评估。

将骨髓总RNA稀释至50 ng/μL，并使用1μL进行双循环生物素化cRNA靶合成（Affymetrix）。将免疫选择的细胞群体的全部RNA产量浓缩至3μL，并进行类似的使用。使用Affymetrix双循环靶制备方案和制造商提供的试剂合成生物素化cRNA靶。结果对生物素化cRNA进行定量，并将产生>15μg cRNA的样品用于基因芯片杂交。在17例病例中，来自免疫选择细胞群的RNA未能产生标记的cRNA靶点，可能是因为样本中缺少免疫捕获细胞和相应的RNA。

按照标准方案，将片段化、生物素化cRNA与Affymetrix Human Focus基因表达微阵列杂交。按照制造商的协议对阵列进行杂交、清洗和扫描。阵列图像使用Affymetrix Microarray Analysis Suite（MAS5）统计算法进行处理。将所有阵列缩放到1500的目标强度，并将数据导出到Siteman癌症中心生物信息学核心设施6用于探针集注释和进一步分析。完整的微阵列数据集可以在上述URL中找到。

定量RT-PCR

使用Omniscript逆转录酶（Qiagen）和随机六聚体将每个完整骨髓RNA的两微克转化为第一链cDNA。将所得cDNA稀释至相当于5 ng/μL的输入RNA。所示转录物的引物/探针组购自Applied Biosystems。每个反应由10μL cDNA、TaqMan Master Mix（Applied Biosystems）和总体积为50μL的引物/探针组组成，遵循制造商的标准协议。对于每个转录物/样品，在ABI 7500 FAST序列检测系统中进行重复或三次反应。导出结果循环阈值数据以进行进一步分析。

免疫组织化学

通过免疫组化分析200万个用抗细胞角蛋白抗体混合物AE1/AE3（DAKO）染色的单核骨髓细胞，独立鉴定骨髓中的细胞角蛋白阳性细胞。

数据分析和统计

使用结果中描述的多种方法分析注释微阵列数据输出。在进一步分析之前，删除所有样本中Affymetrix算法评分为不可检测的探针集（“A”）以及对照探针集。使用功能基因组学软件DecisionSite（Spotfire）进行数据过滤、可视化和方差分析。使用2.21版的微阵列显著性分析算法进行类别区分分析(14). 对于分层聚类，首先将标准化微阵列信号数据转换为平均值0和标准差1(Z轴-分数计算）。

对于qRT-PCR数据，具有循环阈值的重复或三次反应(C类T型)进一步分析排除了>1.5的值差异。使用特定引物/探针组进行的每次试验均标准化为C类T型在同一cDNA样本上使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶引物/探针设置的值。通过使用平均Δ，该值在整个样本集中进行了标准化C类T型使用ΔΔC类T型方法(15). 然后将转录物表达水平的数据表示为相对于正常骨髓平均值的倍数差异。在未检测到特定转录本的样本中(C类T型>40），表达的倍差定义为1.0（等于正常骨髓平均值）。

为了将基因表达与临床变量相关联，进行了Fisher精确检验。在这些分析中，如果骨髓中的表达水平至少比志愿者三份骨髓样本的平均表达水平高出2个SD，则认为患者样本表达了感兴趣的基因。在所分析的两个骨髓样本（左侧或右侧）中至少一个样本中检测到患者的生物标记基因表达或细胞角蛋白阳性细胞时，患者被视为“阳性”。使用Logistic回归估计每种标记物阳性患者与阴性患者的1年复发率。

结果

样品选择和特征

我们最初试图确定与乳腺癌患者化疗后骨髓DTC持续性相关的基因表达模式。用于初始微阵列发现集和随后qRT-PCR验证研究的临床试验研究设计和骨髓样本的来源见图1收集临床Ⅱ/Ⅲ期乳腺癌患者治疗前、四个化疗周期后和诊断1年后的骨髓抽吸物。大多数情况下，骨髓是从左右髂嵴采集的。对本次新佐剂表柔比星/泰索帝试验入选的25名患者的79份骨髓样本进行了表达谱分析，这些患者被随机分为唑仑膦酸（唑美他）组。13例（52%）肿瘤为雌激素受体阳性/孕激素受体阳性/Her2/neu阴性；6例（24%）肿瘤未表达任何肿瘤生物标志物（三阴性）；四个肿瘤（16%）过度表达Her-2/neu。研究队列的其他特征总结如下补充表S1对于经EpCAM免疫选择富集的样本，其中10个样本来自任何治疗前的患者，23个样本来自四个化疗周期后的患者，9个样本来自诊断后12至16个月的患者，2个样本来自正常志愿者。对12例患者的双侧骨髓样本进行分析。在6例患者中，我们能够比较新辅助化疗前后骨髓样本的表达谱。17个EpCAM选择的骨髓样本进行了微阵列分析，但未产生生物素化产物(n个=7）或导致阵列上的探测集调用非常低(n个=10），表明没有从样品中捕获细胞。

使用EpCAM抗原对DTC进行有效免疫富集

我们使用先前记录的方法，通过使用TACSTD1系统抗原，EpCAM(11). 使用该技术估计的污染量在0.74%至74%之间(11). 正如我们实验室的一项初步研究表明，这种方法可以选择性地分离注入正常骨髓的乳腺肿瘤细胞，回收率>80%（数据未显示）。确认EpCAM免疫选择增强了DTC体内，我们检测了一些DTC表达的标记基因(16). 的表达式TACSTD1系统（EpCAM）本身在许多（但并非所有）免疫选择样本中比相应的全骨髓富集5倍以上(图2). 角蛋白19和钼球蛋白(SCGB2A2型;参考17)在一些免疫选择细胞样本（即患者3422）中也富集了100倍。EpCAM表达的丰富并不像预期的那样深刻，但这一结果可能是由于总骨髓中转录表达的背景水平。

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EpCAM的选择丰富了肿瘤细胞标记物的表达。肿瘤细胞相关转录物EpCAM的表达(TACSTD1系统)，细胞角蛋白19(19韩元)和乳腺珠蛋白(SCGB2A2型)显示为微阵列信号值X（X）每个图形的轴。点，在没有抗体、EpCAM或其他六种肿瘤细胞表面抗原抗体之一的骨髓细胞样本中每个转录物的表达。○, 免疫选择的样本中，每个转录物相对于未选择的细胞的比例过高，参考的患者研究编号为补充表S1.

EpCAM抗原可能不会在所有DTC中表达，事实上，可能在继续表达其他标记物（如细胞角蛋白）的临床相关DTC亚群中缺失(9). 因此，我们检查了使用其他细胞表面标记进行的类似免疫选择是否能有效捕获不同的DTC亚群。在从两名患者采集的四份骨髓样本中，未使用EpCAM免疫磁珠捕获的细胞随后与抗ABCG2公司,CD44细胞,CXCR4系列,BSG公司（EMMPRIN），SPP1系列（骨桥蛋白），以及CASP3公司（Sca-1）抗原。据报道，这些基因中的每一个都是与DTC、乳腺癌干细胞或乳腺癌转移相关的标记(18-22). 如所示图2，这些后续富集方案均未进一步选择用于细胞角蛋白表达细胞群。此外，如所示图3，使用每种不同抗体选择的细胞的分子特征通常与彼此和整个骨髓无法区分，与许多EpCAM选择的样本的分子特征非常不同。基于这些数据，我们得出结论，使用与乳腺癌相关的靶抗原进行第二次免疫选择并不能识别具有独特特征的细胞群。该结果可能与用于分析的两个患者标本有关。

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基因表达谱显示乳腺癌患者中不同类别的EpCAM选择的骨髓细胞。这个Z轴-使用7000个转录物的分数标准化表达对基因表达微阵列分析的所有87个样本进行无监督的分层聚类。每行代表一个样本，而每条垂直线代表一个单独的探针集。每个样本中每个探针组的相对表达由低表示(蓝色)至高位(红色). 芯片号，唯一阵列标识符。患者，唯一的患者研究编号。骨髓采集侧（左或右髂嵴前）用于分析。在某些情况下，采集时未显示侧边。新辅助治疗前骨髓采集的状态、时间点(之前)在完成四个周期的治疗后，在最终手术切除时(岗位)，或在1y(1年)或16个月(16个月）跟进。来自正常志愿者的样本用红色表示(荷兰). 细胞，同一骨髓标本免疫细胞化学检测的细胞角蛋白阳性细胞数(ND（无损检测），无可用数据）。AB，用于细胞免疫选择的抗体[电动自行车、EpCAM(TACSTD1系统);操作，骨桥蛋白(SPP1系列);cx公司,CXCR4系列;44，CD44；供应链，sca-1(CASP3公司);相对长度单位，EMMPRIN公司(BSG公司);ab公司，ABCG2]。EpCAM选择的样本以红色突出显示。没有符号表示未选择的骨髓样本。显示出类似表达谱的样本簇(一个-G公司)和黄色方框表示转录本在EpCAM选择的样本的选定子集中过度表达，如正文所述。

乳腺癌患者骨髓显示不同的基因表达谱

基于约7000个基因转录物的表达，对本研究中使用的所有样本进行了无监督聚类分析，见图3从这个分析中，几个不同的基因转录类别是显而易见的。特别是，主要来自治疗后患者（“D”和“E”）的EpCAM选择的骨髓样本的两个子集与未选择的骨髓、正常骨髓和主要来自治疗前患者（“F”和“G”）的EpCAM选择骨髓形成了一个不同的表达簇。我们认为D组和E组的样本代表化疗后持续存在的含有DTC的骨髓，并显示出明显独特和功能相关的分子特征。事实上，在D组患者中，许多显著的转录物过度表达，包括那些与肿瘤侵袭和转移相关的转录物(火花塞1,基质金属蛋白酶2,跨国公司,FMOD公司,TIMP4（时间管理模块4）、和扭转1)、上皮细胞与乳腺癌(电磁脉冲1,电磁脉冲2,AMPH公司,ESR1系列、和BCAR3号机组)以及与乳腺癌进展相关的生长因子(MDK公司和VEGFC公司). 相反，E簇中过度表达的转录物包括核糖体蛋白、翻译起始因子、细胞周期和DNA修复基因的优势(PCNA公司,CCNB2号机组,CDC2（CDC2）,MYC公司,CHEK1（检查1）,XRCC1型,BCCIP公司,巴西航空公司1、和RAD51系列)和乳腺癌生物标记物(BCAS2公司,MUC1公司、和TACSTD1系统).

扭转1基因表达是DTC特征的一部分

为了最大限度地确定与化疗后持续存在的DTC相关的独特基因，我们直接比较了来自完成四个化疗周期的患者的12对匹配的全骨髓和富含EpCAM的样本。为了确定富集的细胞表达谱是EpCAM选择所特有的还是细胞处理的无关紧要的结果，我们还将这些表达谱与使用上述六种其他抗体选择的细胞群体的表达谱进行了比较。最后，作为阴性对照，我们将这些表达谱与从健康志愿者骨髓中获得的EpCAM选择的细胞进行了比较。

使用微阵列算法的显著性分析(14)，我们鉴定了627个探针集，它们的表达在12对EpCAM选择的和未选择的样本之间存在显著差异，预测的错误发现率为5%。虽然这些基因的表达在选定和未选定样本之间存在显著差异，但我们无法确定它们是在少数细胞中高度表达还是在大多数DTC中存在。如中所列补充表S2，67个独特的转录物在EpCAM选择的样本中过度表达，其水平等于或大于EpCAM抗原的水平(TACSTD1系统)自身。此外，在EpCAM选择的和未选择的健康志愿者骨髓中均未检测到其中25个转录物。我们使用67个转录集对未用于初始分析的40个剩余样本进行聚类。如所示图4这一基因特征不仅能将EpCAM选择的细胞与总骨髓区分开来，而且能将患者分为两个不同的类别。6名患者的治疗后骨髓样本中DTC特征的表达增强，而其余患者（治疗前和治疗后）和健康志愿者的样本中相对缺乏DTC特征。有趣的是，在四名患者（2153、1092、6268、5385）的相应预处理标本中未观察到DTC特征的增强表达。目前，关于这组患者以及这些具有DTC特征的患者是否会有较短的无病生存期的随访信息不足。

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基于DTC签名的独立研究样本集的聚类。这个Z轴-67份被定义为“DTC签名”的转录本的分数标准化表达（参见补充表S2)用于对原始创建的特征基因列表中省略的40个未选择或EpCAM选择的骨髓样本进行分层聚类。数据表示和列注释如中所述图3.

尽管DTC签名中确定的大多数单个转录物的生物学意义并不明显，但这组基因中的一个，扭转1，与乳腺癌转移和伴随的上皮间充质转化有关(23). 因此，我们选择调查扭转1乳腺癌患者骨髓中的表达。

扭转1DTC的表达与早期复发相关

临床上最有用的生物标记物将是一种能够显示DTC在整个未分化骨髓中存在的潜力，在任何治疗干预之前的某个时间形成远处转移的标记物。为了解决这一概念，在对30名患者进行任何治疗干预之前，额外采集了50份骨髓样本(图1)用qRT-PCR分析了几个DTC特征基因的表达。在该验证集中，15名患者在1年内进展或发展为转移性疾病，其余15名患者在1年内没有疾病证据。两组标本的雌激素受体、孕激素受体和Her-2/neu表达相匹配。验证集中的所有患者随后均接受相同的化疗方案。进展或早期转移疾病的发展与其他肿瘤标志物（雌激素受体、孕激素受体、Her-2）、肿瘤分级或原发肿瘤对新辅助化疗的反应之间没有统计学意义上的关系（数据未显示）。重要的是，根据传统免疫细胞化学评估，1岁时的进展与骨髓中细胞角蛋白阳性细胞的存在无关(图5).

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DTC特征基因与乳腺癌患者早期转移或进展的相关性。在任何新辅助化疗之前，从30名女性的50份骨髓样本中检测细胞角蛋白19的表达(19韩元),扭转1,SNAI2公司,FZD7型,161加仑,个人识别码和乳腺珠蛋白(SCGB2A2型)定量RT-PCR。这些相同的样品也通过细胞角蛋白免疫细胞化学进行了评估。每个转录物相对于其在正常志愿者骨髓中平均表达的过度表达的倍数显示在Y（Y）-轴。单个骨髓样本放置在X（X）-轴。正常骨髓中平均表达高于2SD的样本(填充符号)由单个患者编号引用。圆形，1岁时有转移或局部进展的患者；三角形，患者病情稳定。该表总结了每种生物标记物阳性的患者数量以及与第1年临床状态的相关性。

的表达式扭曲1，以及161加仑和个人识别码(补充表S2)除了细胞角蛋白19（与上皮细胞相关的标记物）和乳腺癌细胞相关的标志物乳腺珠蛋白的表达外，还检测了(24).161加仑和个人识别码由于它们的表达特征而被选择用于进一步分析。两者都很低q个-value%分数（错误发现的一个指标），两者在正常骨髓中均不表达，且每一个分数的表达水平高于TACSTD1系统（分别为5倍和7.7倍）。因为最近有证据表明，与扭转1乳腺癌转移和WNT公司通路信号传导，我们还测量了SNAI2公司和FZD7型用于比较的成绩单(25). 总的来说，在所分析的50份骨髓样本中，所有七种转录物的表达都存在显著差异。在大多数标本中，在正常骨髓的背景水平以上未检测到转录表达。鉴于未经选择的骨髓中可能存在的DTC数量相对较少，这可能并不意外。然而，一些患者标本确实显示转录表达有选择性增加。如所示图5，两者都是个人识别码和161加仑在患者标本中检测到表达，但均与1年时的局部进展或转移无关。同样，细胞角蛋白19和乳腺珠蛋白也表达，但与早期临床进展无关。有趣的是，细胞角蛋白19转录物的表达也与来自同一骨髓标本的细胞角蛋白染色无关，这一发现以前曾被其他人报道过(24,26). 相比之下，在诊断后1年内出现临床进展的15名患者中，有7名患者表达了扭转1背景以上的成绩单。这一差异具有统计学意义(P（P）< 0.0063). 尽管SNAI2公司和FZD7型在临床进展患者中也检测到转录物（分别为15例中的5例和15例中2例），与之不同扭转1，在首次诊断后1年无疾病患者的骨髓中也经常检测到表达。

讨论

在本研究中，我们使用免疫磁性捕获策略来富集乳腺癌患者骨髓中的EpCAM表达细胞。随后使用这些细胞的全局基因表达谱来识别潜在的转录特征，这些转录特征指示功能显著的微转移肿瘤细胞及其进展为临床明显转移疾病的潜力。在鉴定的转录物中，转移调节因子的表达扭转1在乳腺癌患者化疗前骨髓中经常观察到。的表达式扭转1与初次诊断后1年内远处转移或局部进展的快速发生相关，而细胞角蛋白的传统免疫细胞化学或qRT-PCR分析则没有。

一些研究人员使用类似的方法，使用捕获抗体（如EpCAM）从分子水平上表征患者骨髓中的DTC(10,11). 然而，众所周知，缺乏EpCAM表达的DTC确实存在，尤其是在化疗后可能更为突出(9). 因此，从形式上来说，不可能区分那些失去EpCAM表达且未被捕获的细胞，与那些保留Ep CAM表达但由于细胞角蛋白表达缺失而未被检测到的细胞。这可能解释了通过细胞角蛋白染色检测到的骨髓细胞数量与EpCAM选择之间缺乏相关性。在本研究中，我们试图通过使用针对转移性乳腺癌细胞或乳腺癌干细胞上表达的其他六种表面抗原的抗体进行后续选择，在样本子集中分离EpCAM靶向可能无法捕获的DTC。使用这些抗体分析的样本均未表现出独特的表达谱，这表明我们无法根据这些抗原的表达进一步选择其他DTC亚群。

骨髓中DTC的识别和分子特征由于这些细胞的频率极低而受到阻碍，即使在患有晚期疾病的患者中也是如此。在这项研究中，即使在每百万有核骨髓细胞中有10到20个DTC的流行率下，我们预计从分析的样本中只能回收400到800个细胞。使用基于PCR的策略对这少数细胞进行转录检测相对简单，尽管线性转录扩增和微阵列分析更成问题(27). 事实上，本研究中许多EpCAM选择的样本（包括几个来自正常骨髓捐赠者的样本）未能产生微阵列结果，这表明这些样本中用于分析的细胞太少。

EpCAM的表达对肿瘤细胞也不是绝对特异的，可能在正常骨髓的某些细胞成分上表达(28). 因此，本研究中确定的许多表达特征（包括来自EpCAM选择的正常骨髓的表达特征）可能来自非DTC来源。然而，许多被鉴定的转录物对乳腺癌患者的EpCAM选择样本的子集是特异的，并且在正常骨髓中没有检测到，这表明这些标记物对DTC是特异的。有趣的是，即使这些特征基因的表达并非直接来源于DTC本身，由于肿瘤-环境信号相互作用，其他骨髓元素的表达特征可能对其内DTC的存在和转移潜能具有同等的信息量(29,30). 在未来，确定有多少“DTC签名”转录本实际上是由其他骨髓元素表达的将是一件有趣的事情。

一些证据进一步表明，本研究中确定的表达特征确实反映了DTC的存在。Woelfle等人(31)表明免疫选择过程本身并没有实质性改变细胞表达谱。我们的研究证实了这一发现，即选择具有替代抗体的细胞和从正常骨髓中选择的细胞并不能重现从乳腺癌患者的EpCAM选择的细胞中获得的特征。在EpCAM选择的细胞中，一些已知的肿瘤标记物，如细胞角蛋白19(19韩元)和乳腺珠蛋白(SCGB2A2型)在许多样本中富集，表明成功分离出真正的DTC。最后，在一组独立的样本中，DTC签名并没有简单地将EpCAM选择的骨髓与未选择的骨髓分开，而是定义了两类不同的患者，可能是那些有或没有化疗持续性DTC的患者。

识别的DTC特征最初由大量转录物组成，这些转录物在EpCAM选择的细胞中表达丰富。然而，只有少数转录本显示出与EpCAM转录本本身相当的富集程度，TACSTD公司在正常骨髓中仅检测不到这些转录物的进一步子集。许多单独DTC转录本的生物学意义尚不明确，但有一个显著的例外，扭转1. The扭转1基因是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，指导中胚层细胞的命运(32). 表达与上皮-间充质转化有关，这是转移级联的关键组成部分，转化的上皮细胞失去正常的细胞-细胞相互作用并采用间充质表型(25). 的表达式扭转1在包括黑色素瘤、乳腺腺癌和胶质瘤在内的多种肿瘤中预后不良(23,33,34). 此外扭转1蛋白质水平与细胞毒药物的耐药性或敏感性降低有关(35).

在最初的微阵列分析中，有目的地选择化疗后获得的骨髓样本，以识别与持续性DTC相关的基因特征，这些基因特征更有可能对转移和总体生存率具有临床意义。为了确定基因表达对临床结果的预测强度，选择来自相同临床方案的独立患者子集的治疗骨髓样本进行标记物验证。DTC签名的两份抄本，个人识别码和161加仑，与该验证集的临床结果无关。除了对该结果的许多可能的技术解释外，化疗暴露可能会选择DTC亚克隆或改变DTC表达谱，从而使这些基因的表达与预处理样品无关。然而，最重要的是，我们能够证实扭转1即使在预处理骨髓中的表达也与1年时远处转移或局部进展的发生相关，而其他传统方法则不相关。

在上皮-间充质转化调控途径中，扭转1可能起到类似蜗牛基因的作用(32). 蜗牛家族成员参与E-cadherin的抑制、细胞运动、乳腺癌复发和转移发展(36-39). 该家族的基因可能参与乳腺癌的进展，因此，与扭转1，可能是转移潜能的标志。在这项研究中，我们发现SNAI2公司在三分之一的骨髓样本中表达。不同于扭转1然而，表达并非全部SNAI2公司-阳性患者在1年内发生转移性疾病或临床进展。对这些患者的进一步随访将使我们能够更好地确定SNAI2公司与扭转1骨髓表达。

最后，我们观察到早期转移疾病的发展与其他两种常用于检测血液、骨髓和淋巴结中DTC的转录物（细胞角蛋白19和乳腺珠蛋白）的表达之间没有相关性(24). 与这两个标记不同，我们建议扭转1可以提供更准确的DTC功能指标，具有高转移潜能。在这个意义上，扭转1与目前可用的任何其他常规病理或分子标记物相比，通过本研究概述的方法鉴定的其他转录物可能是预测乳腺癌患者某些亚群临床结局的更可靠标记物。

我们研究的一个局限性是收集样本的专利队列。所有患者都接受了统一的化疗方案，结果集中在早期复发疾病的患者身上。因此，我们的研究结果将通过多变量分析在接受多种化疗方案的更大队列患者中得到证实。

补充材料

表1——补充

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表2增补

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致谢

我们感谢Daniel Link博士在采购正常志愿者骨髓方面的帮助，感谢Alvin J.Siteman癌症中心组织采购和多重基因分析核心的工作人员提供的卓越技术援助。

赠款支持：国家癌症研究所拨款CA111530-01，巴恩斯犹太医院基金会（R.L.Aft），阿尔文·J·斯特曼癌症中心支持拨款P30 CA91842，华盛顿大学斯特曼癌症研究中心临床试验核心和密苏里州圣路易斯巴恩斯犹太教医院M.A.Watson，T.P.Fleming，华盛顿大学可能会从与哺乳动物珠蛋白相关的许可中获得特许权使用费收入(SCGB2A2型)基因。

脚注

注释：本文的补充数据可从临床癌症研究在线获得(http://clincancerres.aacrjournals.org/).

6http://bioinformatics.wustl.edu

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