肝素杂志。作者手稿；可在PMC 2010年3月1日获得。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院100715
有证据表明，在大鼠酒精性脂肪性肝炎发生之前，长期饮酒会促进肠道氧化应激、肠道高渗透性和内毒素血症
,1,2,三 ,1,三 ,1,5 ,1 ,4 ,1 ,1,2和1
阿里·克沙瓦尔齐安
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
2美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学药理学系
三美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学分子生物物理与生理学系
阿什坎·法哈迪
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
三美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学分子生物物理与生理学系
克里斯托弗·福赛斯
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
5美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学生物化学系
Jayanthi Rangan公司
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
Shriram Jakate先生
4美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学病理学系
马利哈·谢赫
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
阿里·巴南
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
2美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学药理学系
杰里米·菲尔兹
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学内科（消化疾病和营养科）
2美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学药理学系
三美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学分子生物物理与生理学系
4美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学病理学系
5美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学生物化学系
通讯作者：Ali Keshavarzian，医学博士，医学教授，药理学和分子生物物理学及生理学教授，拉什大学医学中心消化疾病和营养主任，1725 W.Harrison，Suite 206，Chicago，IL 60612，USA，电话：+1-312-563-3890，传真：+1-32-563-3883，电子邮件：Aliude.hsur@naizravahseK 摘要
背景/目标
并非所有的酗酒者都会患肝病（ALD）。因此，过度饮酒是必要的，但不足以诱发酒精性脂肪性肝炎（ASH）和ALD。由于ALD患者存在内毒素血症，有人提出肠源性循环内毒素是ASH的必要辅因。但是，内毒素血症是ALD的后果还是触发因素尚不清楚。因此，本研究的目的是确定在ASH动物模型中，内毒素血症是否发生在ASH发生之前，肠道泄漏是否是导致内毒素血症的主要原因。
方法
在每日灌胃酒精10周期间，评估大鼠肠道高渗透性、一氧化氮生成、肠道氧化损伤、内毒素血症和肝脏损伤的发展时间进程。
结果
2周后，肝脏脂肪和血清转氨酶升高，但8周后出现肝细胞损伤和炎症（ASH）。肠漏、肠氧化损伤和内毒素血症发生在第2-4周，随后进展。
结论
脂肪性肝炎之前酒精诱导的肠道渗漏和内毒素血症表明它们不是ALD的结果。我们的数据支持这样一种假设，即导致内毒素血症的肠道渗漏是ASH的关键辅助因素（触发因素）。
关键词：肠道高渗、酒精性脂肪性肝炎、一氧化氮、氧化应激、内毒素血症、酒精性肝病
介绍
酒精中毒最严重的并发症是酒精性肝病（ALD），包括酒精性脂肪性肝炎（ASH）和肝硬化(1–5). 现在人们普遍认为脂肪性肝炎是肝硬化发展所必需的。但是，将EtOH摄入与脂肪性肝炎联系起来的机制尚未完全确定。因为只有大约30%的酗酒者会患ALD(4)除大量EtOH消耗外，还必须考虑其他因素。
最可能的候选者是肠源性内毒素。事实上，最近的一些临床观察和实验研究强烈表明内毒素是关键的辅因子(6–10). 然而，这些研究并没有：（a）排除内毒素血症是ASH的结果而不是原因的可能性，（b）确定导致内毒素血症的潜在机制。
为了解决第一个问题，即因果关系问题，我们进行了一项时间过程研究，以验证由慢性EtOH喂养引起的内毒素血症先于ASH发生的假说。为了解决内毒素血症的机制问题，我们测试了内毒素血症是由酒精诱导的肠道泄漏引起的假设。我们探索了这一机制，因为我们最近发现，只有患有ALD的酗酒者，而不是那些没有ALD的，才具有肠道高渗透性(10). 我们还报道了补充燕麦可以防止酒精喂养大鼠的肠道渗漏和肝脏损伤(11). 这些发现表明，肠道渗漏是导致ALD相关内毒素血症的机制(11).
同样不清楚的是，介导EtOH诱导的肠道渗漏的机制。一些证据表明，罪魁祸首是乙醇诱导的组织氧化应激。首先，氧化应激被认为是酒精诱导的器官损伤的关键机制，如中枢神经系统损伤(12)，胰腺(13)，心脏(14)和肝脏(15). 第二，在体外研究表明，酒精激活氧化途径，包括iNOS的上调(16–18). 第三，我们最近体外研究研究表明，酒精破坏了肠细胞单层的屏障完整性，酒精诱导的破坏是由于细胞骨架的氧化损伤(17). 这种机制需要研究体内.
本研究的目的是通过开展一项研究来填补我们知识中的上述空白，以确定大鼠每日灌胃10周期间肠道高渗透性、肠道氧化损伤、内毒素血症和肝脏损伤的发展时间进程。
材料和方法
动物受试者
雄性Sprague-Dawley大鼠（摄入250–300 g）取自印第安纳州哈兰市。在实验期间，每只大鼠每天2次胃内灌胃（通过灌胃；2 cc）酒精或等量葡萄糖。剂量每2至3天逐渐增加，最多2周后达到6 g/kg/天。研究第1天被定义为大鼠第一天摄入6 g/kg/天的酒精。大鼠随意进食，并每天称重。在处死前测量肠道通透性。给大鼠注射6 g/kg酒精2周、4周、8周和10周后处死大鼠（参见每组N）。牺牲是由CO完成的2吸入，然后立即进行心脏穿刺（抽血）并采集肠道和肝脏。
表1
| 组 | 第2周 | 第4周 | 第8周 | 第10周 | 特定肝病标准 |
|---|
| 葡萄糖喂养大鼠 | 0 (7) | 0 (6) | 0 (7) | 0 (6) | 坏死火焰组织学评分 |
| 酒精喂养大鼠 | 0 (11) | 0 (12) | 2*(±0.2) (10) | 4*(±0.5 ) (6) | 坏死火焰组织学评分 |
| 葡萄糖喂养大鼠 | 0.16 (±0.2) | 0.13 (±0.2) | 0.16 (±0.2) | 0.13 (±0.02) | 肝脏MPO（U/mg组织） |
| 酒精喂养大鼠 | 0.15 (± 0.2) | 0.26 (± 0.05) | 0.58*(± .07) | 2.37*(± 0.3) | 肝脏MPO（U/mg组织） |
| 葡萄糖喂养大鼠 | 65.27 (± 7) | 65.27 (± 7) | 65.27 (± 7) | 65.27 (± 7) | 血清ALT（U/dl） |
| 酒精喂养大鼠 | 90.74*(± 10) | 79.29*(± 8) | 100.84*(± 11) | 90.37*(± 10) | 血清ALT（U/dl） |
| 葡萄糖喂养的大鼠 | 82.38 (± 9) | 82.38 (± 9) | 82.38 (± 9) | 82.38 (± 9) | 血清AP（U/dl） |
| 酒精喂养大鼠 | 90.75 (±10) | 110.83 (±12) | 264.39*(± 27) | 220.47*(± 21) | 血清AP（U/dl） |
拉什大学动物护理和使用委员会（IACUC）根据美国国立卫生研究院实验动物福利办公室制定的指南和出版物（美国。测试、研究和培训中使用的脊椎动物使用和护理的政府原则，以及实验动物护理和使用指南。尽一切努力减少动物的疼痛或不适。
肠道通透性
正如我们所描述的那样，我们使用口服糖测试来评估肠道通透性(11,19,20). 禁食8小时后，给大鼠灌胃2.0 ml含有107 mg/kg乳果糖、30 mg/kg甘露醇、15 mg/kg三氯蔗糖和570 mg/kg蔗糖的溶液。将大鼠单独安置在代谢笼中，收集尿液样本5小时。为了促进排尿，在给糖之前，给每只大鼠皮下注射10毫升乳酸林格溶液。正如我们报告的那样，尿糖水平是通过气相色谱法测量的(19,20).
血浆内毒素
献祭时从老鼠身上采集血液。然后使用试剂盒（Kinetic-QLC；Whittaker Bioproducts）对血清样本进行内毒素分析。
肝脏损伤
a。肝脏组织学
福尔马林固定的肝组织用H&E染色。GI病理学家（SJ）进行盲法评估。组织切片通过脂肪变性、坏死、炎症和纤维化分级评估肝脏疾病(11). 我们的评分系统基于一种广泛用于肝病评分的系统(21). 脂肪变性的严重程度（含脂肪肝细胞的百分比）评分为1+4+，与含脂肪的肝细胞分数相对应。分别为<25%、26-50%、51-75%和>75%。坏死被量化为坏死灶数/mm2以及每个HPF的理事机构数量和坏死严重程度分级为0-4。炎症的严重程度根据范围【每HPF的炎症灶数量和有炎症灶的HPF数量】和炎症灶的密度（从少量炎症细胞到密集的炎性浸润）按0-4分进行分级。采用三色染色法对纤维化的严重程度进行0至4分的评分。然而，所有大鼠的纤维化评分均为零，因此组织学评分中不包括纤维化等级。然后计算总组织学评分（包括脂肪肝分级）和坏死炎症评分（炎症和坏死评分代表脂肪性肝炎的存在和严重程度）。最大组织学评分和坏死炎症评分分别为12和8。在评估病理学研究的载玻片时，每个大鼠至少要研究3个不同的切片。酒精性脂肪性肝炎（ASH）定义为肝脏中存在炎症细胞浸润、斑点状坏死和肝细胞坏死。
b。肝脏脂肪含量
如前所述，用重量法测量肝脏总脂肪(22)并被我们使用(20).
c。肝髓过氧化物酶水平
MPO存在于中性粒细胞等髓系细胞中，并被可靠地用于评估炎症的存在和严重程度(23). 使用髓过氧化物酶检测试剂盒（加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市Cytostore）测量肝脏MPO，最终值以MPO单位/mg组织表示。
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和碱性磷酸酶（AP）
拉什大学医学中心临床实验室在盲血清样本中测量ALT和AP，数据单位为/dl±S.E。
肠粘膜和尿液中的NO水平
使用硝酸盐/亚硝酸盐比色分析试剂盒（开曼化学公司，密歇根州安阿伯）测量尿液和组织样品中的亚硝酸盐和硝酸盐（μM/ml或μM/mg）。
诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平分析
组织均匀化，样品（20μg蛋白质/条）用7.5%SDS-PAGE分离并按规定进行定量(17).
氧化（羰基化）和硝化（硝基酪氨酸化）的定量槽免疫印迹
通过使用我们之前描述的slot-blotting方法测量蛋白质羰基和蛋白质硝基酪氨酸的形成来评估粘膜蛋白质的氧化和硝化(24,25).
数据和统计分析
数据以平均值±S.E表示。对于两组的参数分析，我们使用了Student的t检验；当我们比较多个组时，使用方差分析。最小标准差（LSD）用于事后分析，配对t检验用于比较配对数据，如肠道通透性。p≤0.05为显著。
结果
酒精喂养大鼠的体重增加明显少于葡萄糖对照喂养大鼠（第10周，葡萄糖喂养大鼠395±10g，而酒精喂养的大鼠为365±10g；p≤0.05）。以下是与本研究所解决的七个关键问题相关的结果。
（i） 长期饮酒会破坏大鼠的肠道通透性吗？
在开始服用6 g/kg酒精后的2周内，每天给大鼠喂食酒精会破坏肠道屏障功能。早在第2周，酒精喂养大鼠的五小时尿乳果糖（小肠通透性指数）显著高于对照大鼠(，p=0.04）。10周时，酒精喂养大鼠的尿乳果糖也显著高于葡萄糖喂养大鼠（p<0.015）。在饮酒大鼠中，尿三氯蔗糖（全肠[小肠+大肠]通透性指数）也增加，到第10周时差异显著（p≤0.05，).
图1a。通过尿乳果糖测定肠道通透性。用尿乳果糖测定肠道通透性（方法）。在整个研究过程中，两组的5小时尿乳果糖（小肠通透性的标志物）均增加。在第2、4、6、8和10周，酒精喂养组的乳果糖水平显著高于对照组（p<0.05）。仅显示第2周和第10周。数据是每个时间点N=6或更多大鼠恢复的口服剂量分数（例如，016=1.6%恢复）±S.e.的平均值。
图1b：。用尿三氯蔗糖测定肠道通透性。在整个研究过程中，五小时尿三氯蔗糖（全肠通透性的标志物）增加，尽管在第10周时，酒精喂养组的三氯蔗糖水平仅显著高于对照组。数据是每个时间点N=6或更多大鼠恢复的口服剂量分数±S.E.的平均值。
（ii）长期饮酒会导致大鼠内毒素血症吗？
在牺牲时从血液中获得的血清中评估内毒素。在整个研究过程中，喂食葡萄糖的大鼠的血清内毒素值保持较低且不变。相反，早在4周时，每天饮酒就会导致严重的内毒素血症。在8周和10周时，血清内毒素水平甚至更高（上升约6倍）(，p≤0.05）。
血清内毒素水平。按照方法中所述，在指定的周内，测定对照组和酒精喂养大鼠的血清内毒素。在整个研究过程中，血清内毒素水平升高。早在第4周，酒精喂养大鼠体内的水平显著升高。对于N=6或更多的大鼠，每个时间点的数据表示为每毫升血清的平均内毒素单位（EU）±S.E。
（iii）长期饮酒会导致大鼠脂肪性肝炎吗？
每天给大鼠喂食酒精导致肝脏脂肪含量在10周内逐渐增加(). 早在2周时组织学就能检测到脂肪变性(). 相反，酒精性脂肪性肝炎（ASH）的定义是存在炎症细胞浸润、斑点状坏死和肝细胞坏死，直到第8周才在组织学上见到(). ASH的严重程度（由坏死炎症评分和肝脏MPO水平定义）在第10周时最高()出现肝细胞坏死和议员身体(). 炎性细胞浸润和肝细胞坏死分布于肝腺泡中央周围区。酒精喂养大鼠的血清转氨酶（ALT）水平也升高()最早2周。每天饮酒也会导致4周后血清碱性磷酸酶升高()喂食酒精8周后血清水平显著升高，组织学检查发现肝脏炎症的最初症状，10周时仍保持升高。
总肝脂肪。处死后测定两个治疗组的肝脏脂肪含量（方法）。酒精喂养大鼠肝脏脂肪含量增加。早在第4周，在酒精喂养的大鼠中它就显著升高，此后仍高于对照组。数据是每个时间点N=6或更多大鼠的总肝脂肪（mg脂肪/100gm肝组织）±S.E.的平均值。
肝组织的组织学分析。牺牲时获得的肝组织被固定并用H&E染色（方法），并显示代表性样本。面板一显示了一只对照大鼠的正常肝脏切片。面板b条结果表明，酒精喂养大鼠早在第2周就观察到肝脏中的大囊泡和微囊泡脂肪变性（箭头所示），尽管直到第4周才有显著差异（图4）。面板c（c）显示10周时酒精喂养大鼠肝脏中的炎症细胞和斑点状坏死（箭头）。面板d日显示了10周时酒精喂养大鼠酒精性肝硬化（ALD）的坏死肝细胞“议员体”（箭头）特征。
（iv）内毒素血症是否与酒精性脂肪性肝炎的发生有关？
我们总结的时间进程数据()表明内毒素血症（4周）发生在脂肪性肝炎（MPO，8周）发生之前，因此内毒素血症极不可能是肝脏炎症的结果。相反，我们的数据支持内毒素血症参与肝坏死炎症级联反应启动和酒精性脂肪性肝炎（ASH）发展的模型。
酒精喂养大鼠的通透性（乳果糖）、内毒素血症、肝脏脂肪和肝脏MPO的时间进程总结。尿中乳果糖、血清内毒素、肝脂肪和肝脏MPO的值按所述进行测定（方法），前面的数据显示了其重要性。数据以第2、4、8和10周的百分比变化±S.E.表示。
（v） 肠道渗漏会导致酒精引起的内毒素血症吗？
具有统计学意义的小肠漏（尿乳果糖增加；)每天灌胃酒精后2周发生内毒素血症，4周酒精暴露后发生内毒素血症。在额外几周的酒精暴露后发生结肠渗漏（尿三氯蔗糖增加代表小肠和结肠渗漏），这与更严重的内毒素血症有关(). 这些发现表明，肠道渗漏可能是酒精喂养大鼠内毒素血症的机制，至少部分是这样。
（vi）酒精引起肠道渗漏的机制是什么？
我们发现，每日饮酒会导致氧化应激，尿中总NO（NO）水平为9倍2+否三)（第10周对照组为92±9μM，喂食酒精组为857±92μM；p≤0.05）。为了确定酒精诱导的组织氧化应激的来源，我们测量了结肠粘膜中的iNOS蛋白。每日饮酒可上调粘膜iNOS(（p<0.05）。粘膜iNOS增加到对照值的400%。这种增加与肠粘膜总NO的增加有关，NO是这种酶的反应产物()更重要的是，长期饮酒导致肠粘膜氧化应激，组织蛋白硝化显著升高（硝基酪氨酸水平；)和蛋白质氧化（蛋白质羰基水平；)酒精喂养大鼠空肠、回肠和结肠粘膜。
结肠粘膜iNOS蛋白。通过western blotting检测对照组和酒精喂养大鼠结肠粘膜iNOS蛋白（130kDa）的表达（方法）。除来自大鼠大脑（Cayman Chemical）的通道6 iNOS阳性对照组（10μg）外，每条通道装载等量的蛋白质（50μg）。印迹代表了三个以上的实验。
结肠粘膜总NO总NO（NO2+否三)从对照组和酒精喂养大鼠的结肠粘膜组织中测定（方法）。数据是每个时间点N=6或更多大鼠的总NO（μM/mg）±S.E.的平均值。
肠组织中硝基酪氨酸水平的缝隙印迹和密度测定。氧化应激标记物硝基酪氨酸表位的水平通过狭缝印迹法和定量密度测定法测定，这些组织样本取自回肠（图8a）、空肠（图8mb）和结肠（图8c）粘膜（方法）。所示数据为N=6或更多大鼠的相对密度±S.E.平均值，以及每个时间点的N=3个斑点。此外，结肠粘膜的代表性缝隙印迹数据图像如图8c所示。
肠组织中羰基水平的缝隙印迹和密度测定。在从回肠（图9a）、空肠（图9b）和结肠（图9c）粘膜（方法）牺牲后获得的组织样品中，通过缝隙印迹和定量密度测定法测定氧化应激标记物羰基表位的水平。所示数据是每个时间点N=6或更多的相对密度±S.E.的平均值。此外，结肠粘膜的代表性缝隙印迹数据图像如图9c所示。
（vii）氧化应激是否与酒精诱导的肠道泄漏有关？
每日灌胃酒精后2周出现具有统计学意义的小肠泄漏（尿乳果糖增加），这是在暴露于酒精4周后出现肠氧化应激和内毒素血症之前。因此，我们的时间进程实验与酒精诱导的氧化应激可能（至少在一定程度上）导致酗酒大鼠肠道渗漏的观点一致。
讨论
几项研究提供了证据，表明肠道衍生细菌产物是少数酗酒者发生ALD的必要辅因子(6–10). 例如，患有ALD的酗酒者的血清内毒素水平较高，而血清内毒素水平与ALD的严重程度相关(26). ALD患者的外周血单核细胞被激发产生细胞因子和氧化剂（活性氧和氮），这种激发似乎是由内毒素引起的(27–29). 还有其他研究表明，患有肝损伤的酒精喂养大鼠的门静脉内毒素水平较高，内毒素水平与这些大鼠的肝损伤严重程度之间有很强的相关性(30).
事实上，众所周知，酒精与内毒素协同作用，对肝脏产生损害作用。例如，单用酒精或单用内毒素（至少不是低内毒素水平）都不会导致严重的肝损伤，但这两种药物的联合使用足以导致显著的肝损伤。内毒素可以激发和激活长期接触EtOH的大鼠的巨噬细胞（Kupffer细胞），从而过度产生细胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-8(8,31). 这些细胞因子不仅直接损伤肝细胞，还可以引发肝脏坏死炎症级联反应，包括白细胞（包括中性粒细胞）向肝脏的迁移(15,31). 这些白细胞会产生有害的产物，尤其是一氧化氮产生的氧化剂(16)如过氧亚硝酸盐，可导致肝细胞坏死。EtOH-内毒素协同作用，以及EtOH对肝脏的其他直接代谢作用（例如，缺氧、NO-依赖性通路的扰动），不仅可以引发肝损伤，还可以形成一个恶性循环，维持慢性坏死炎症过程并加速肝衰竭的发生。
然而，这些研究并没有排除内毒素血症是ALD的结果而非先决条件的可能性。口服非吸收性抗生素降低血清内毒素水平的研究(7)或乳酸菌(6)减轻酒精喂养大鼠酒精诱导的肝损伤支持内毒素是促进严重肝损伤的关键，但不能直接证明内毒素是ASH的触发因素。我们的时间进程研究首次证明，内毒素血症先于ASH，因此支持内毒素不是肝病的后果，可能是ASH发展的诱因的观点。我们发现脂肪肝发生早于明显内毒素血症之前，这支持了以下假设：单纯性脂肪变性主要是由于酒精对肝脏脂质代谢的直接影响，并不依赖内毒素(32). 与脂肪变性不同，脂肪性肝炎似乎依赖于内毒素。尽管酗酒者内毒素血症的机制尚未完全确定，但很明显，内毒素的来源是肠道菌群。内毒素由肠腔中的细菌产生，渗入门脉循环，然后到达肝脏，通常在那里被库普弗细胞吸收和清除。因此，血液内毒素水平异常升高（内毒素血症）可能是由于：（i）小肠细菌过度生长或肠道菌群异常（失调）导致内毒素生成增加，（ii）内毒素通过肠壁的渗透增加（肠道渗漏），（iii）晚期肝病和门脉高压症中发生的门脉血分流导致肝脏清除率降低，和/或（iv）肝脏库普弗细胞功能缺陷导致内毒素清除率降低。肠道渗漏可能有特别大的影响，因为它可以增强其他三种机制。这可能是因为肠道屏障的完整性是一个门卫。肠屏障完整性的改变可以减弱或加重内毒素血症其他可能机制的影响。
小肠和结肠细菌都可能是内毒素血症的来源。因此，重要的是评估小肠和结肠的通透性，以确定肠道泄漏是否是内毒素血症的来源。不幸的是，没有公认的评估方法体内肠道通透性。但是，使用吸收不良的糖来评估小肠和大肠的通透性已经在健康和疾病状态的几项研究中得到验证(33,34). 甘露醇（M）和乳果糖（L）在小肠吸收不良，其在尿液中的浓度（或L/M比值）是小肠渗漏的有效标志。由于乳果糖和甘露醇都被结肠细菌广泛代谢，因此它们不是评估结肠通透性的合适底物。相反，吸收不良的糖三氯蔗糖不会被细菌代谢，因此是评估肠道（小肠和结肠）总通透性的合适标志物(35).
我们使用糖测试来解决肠道渗漏是否与酒精诱导内毒素血症有关的问题，如果是，肠道渗漏的部位在哪里。我们现在的报告显示，肠道泄漏确实发生在每日饮酒后，肠道泄漏和内毒素血症的时间过程表明，肠道泄漏至少在一定程度上是导致饮酒大鼠内毒素血症的原因。我们目前的研究结果证实了我们之前在酒精受试者中的观察结果(10)和酗酒大鼠(11). 其他人也认为肠道渗漏是酗酒者内毒素血症的来源(15). 事实上，其他报告显示，饮酒会严重干扰人类和动物的肠粘膜结构和功能(18,36–39). 我们的时间进程研究为肠道渗漏在酒精诱导内毒素血症中的重要性提供了另一个更直接的证据。我们还首次报道，酒精会破坏整个肠道的屏障功能。酒精对小肠屏障功能的有害影响（尿中乳果糖增加）似乎更快，并且只在暴露2周后发生。相反，要打破结肠屏障（尿三氯蔗糖增加），则需要每天长时间接触酒精。有趣的是，在喂食酒精的前4周，当小肠出现渗漏时，内毒素血症的程度是适度的；而在第二个月（4-8周）的酒精暴露中，当出现肠道完全泄漏时，内毒素血症更为严重。这一发现与结肠高内毒素含量的渗透相一致。但是，还应考虑损伤肝脏对内毒素清除缺陷的贡献。需要进一步研究以确定小肠破裂和结肠屏障功能之间时间进程差异的机制。
酒精是如何引起肠道渗漏的还没有确定。肠屏障功能的完整性取决于健康的上皮细胞和完整的细胞旁通路，这似乎是内毒素等大分子渗透的主要途径(33). 由于氧化应激是酒精诱导的组织损伤和器官衰竭的原因，对调节这种细胞旁途径的关键蛋白的氧化损伤是一种可能的机制(40–42). 更具体地说，酒精会增加氧化应激(16,43,44)和其他(45,46)表明氧化应激破坏单层屏障。我们的数据现在支持了组织氧化损伤在酒精诱导的肠道渗漏中的关键作用。我们的数据还表明，酒精引起的肠道氧化损伤是iNOS上调的结果。iNOS的上调导致NO、过氧亚硝酸盐和超氧物的过度生成。NO可以通过一个称为NOS解偶联的过程产生超氧化物，该过程指的是NADPH氧化的解偶联以及细胞色素C功能的破坏(47,48). 最终，过氧亚硝酸盐和超氧阴离子会导致负责屏障完整性的关键蛋白质发生硝化和羰基化，从而导致肠道渗漏。我们的在体外研究(16,17,49)提示以下级联反应：酒精激活NF-kB，导致iNOS上调。iNOS增加会增加NO的生成，并增加过亚硝酸根和超氧物的水平，从而导致紧密结合蛋白和细胞骨架蛋白的硝化和羰基化。这些关键蛋白质的氧化损伤破坏了肠屏障的完整性。我们的大鼠模型无法区分酒精对肠道的管腔效应和血流效应。但是，由于顶部和底部施用酒精都会促进单层的高渗透性，因此可以得出结论，酒精的局部和全身效应都可能与肠道渗漏有关。
总之，我们的发现首次证明了酒精介导的肠道渗漏和内毒素血症先于酒精性肝病的发展，因此可能是ASH发展的必要触发因素。还需要进一步研究，以确定抑制酒精喂养大鼠iNOS上调是否可以防止肠道渗漏、内毒素血症和脂肪性肝炎。对酗酒者进行对照临床试验，以确定预防肠道渗漏和内毒素血症的干预措施是否能够预防ALD，必须等到制定出有效的预防肠道渗漏的干预措施。我们承认，预防ALD的最佳方法是节欲，但不幸的是，保持清醒的长期成功率很低。因此，预防肠道渗漏等替代方法仍将对有ALD风险或患有ALD的清醒酗酒者的生活质量产生积极影响。
致谢
本研究得到了NIH拨款AA13745（AK）的支持。
脚注
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