无转基因诱导小鼠多能干细胞的制备猪背肉转座子

使用转座子向量生成初级iPSC

我们接下来调查了猪背肉携带4或5个因子的转座子可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的重编程。协议如所示图2a。我们使用Lipofectamine2000用2.0μg的猪背肉转座子和2.0μg猪背肉转座酶在6孔板中的表达载体。转染后一天，将MEF以1:18的分割比重新放置在饲养层上，并使用含或不含丙戊酸（VPA）的血清型ESC培养基（F15L）培养5天。随后在第7天将培养基更换为无血清ESC培养基（K15L）。无血清培养先前显示可以增强小鼠和人类成纤维细胞的重新编程^17,18我们发现，与单独在两种培养基中培养相比，基于血清和无血清培养基的适当组合可以进一步增强重新编程，并使iPSC菌落数量最大化(补充图2). 在这些条件下，在没有VPA的第7天和有VPA的10天左右可以看到菌落。第14天，菌落足够大，可以采摘。尽管之前有报道称VPA可以提高小鼠和人成纤维细胞的重编程效率^17,19，我们无法观察到这种效果(图2b、e). VPA的显著作用是抑制未编程细胞的生长。未经VPA处理的菌落往往比VPA处理过的菌落大得多，其形态对于ESC菌落来说并不典型，尽管所有这些菌落的碱性磷酸酶（AP）染色均为阳性(图2b，c，顶部). 相比之下，VPA处理的菌落更为球形，在形态上与ESC菌落无法区分(图2c，底部). 所有ESC样克隆的Nanog表达和AP染色均为阳性(图2c，d，底部)，表明这些菌落的重新编程成功。有趣的是，Nanog免疫染色显示，未经VPA处理的非ESC样菌落包含许多Nanog阳性斑块(图2d，顶部). 所有未经VPA培养的菌落均含有至少一个Nanog阳性的小亚菌落，这表明确实发生了重新编程，但周围未经重新编程的细胞阻止了重新编程细胞的扩张和形成ESC样菌落。因此，VPA似乎可以抑制未重新编程的细胞生长，并促进重新编程细胞的扩展以形成菌落。使用5因子转座子，我们能够将菌落数增加约两倍于4因子转座元(图2e). 我们转染了10个⁶MEF的转染效率约为10%，获得约1000个菌落，因此，总的重编程效率约为1%，几乎等同于逆转录病毒方法。当转座子数量从2.0μg减少到0.5μg时，菌落数减少约10倍(图2e)。

在单独的窗口中打开

图2

利用piggyBac转座子产生初级iPSC

(一)转座子介导的重新编程的时间表。胚胎成纤维细胞培养基；F15L，基于血清的ESC培养基；K15L，无血清ESC培养基。三角形，中等变化。(b条)第14天菌落的碱性磷酸酶染色。“−”，使用eGFP表达载体进行阴性对照转染。(c（c）)经过（底部）和（顶部）VPA处理的AP染色菌落的放大图。(d日)在第14天进行（底部）和（顶部）VPA处理的Nanog免疫染色。左，相位对比；对，抗Nanog免疫染色。(e（电子）)通过基于转座子的重新编程获得的菌落数。OSKM*与OSKM相同，只是Sox2和Klf4通过F2A而不是T2A连接。(（f）)转座子拷贝数分布取决于转座子质粒数量。OSKM*载体用于2.0μg和0.50μg的转染，OSKML载体用于0.25μg转染。***实验中只鉴定出一个单拷贝转座子iPS集落。数据显示为平均值±标准差。每个条件下至少进行3次实验。**，第页<0.05（学生的吨测试）。比例尺，5 mm(b条)，100微米(c、 d日)

我们从VPA处理的培养物中挑选菌落，建立“初级”iPSC系，这些系在形态学上与ESCs没有区别，内源性Nanog表达阳性(补充图3a). 初级iPSC的建立效率通常超过90%。我们通过Southern blot分析研究了整合转座子的拷贝数(补充图3c). 使用2.0μg转座子DNA，大多数菌落有多次插入。20%的菌落有2拷贝整合(图2f)当转座子DNA量减少到0.25μg时，增加到45%(图2f). 在分析的100多个克隆中，我们只获得了1个具有单拷贝整合的克隆，这表明至少需要2个转座子才能使用我们的载体进行有效的重编程。这可以通过最近的证据来解释，这些证据表明成纤维细胞比其他细胞类型（如肝细胞或上皮细胞）需要更高水平的重编程因子表达²⁰。

从原代iPSC中去除转座子

接下来，我们试图从iPSC基因组中消除转座子。一旦切除，只有50%的转座子重新整合到基因组中²¹我们利用人类疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk公司)-FIAU选择系统在转染猪背肉转座酶表达质粒(图。 ​1a个1a个和​和3a）。3a年). 我们使用了三个不同的iPSC克隆，每个克隆都被证实携带了两个猪背肉转座子(补充图3d). Splinkerette-PCR用于识别整合位点(补充图4). 在瞬时转座酶表达和FIAU选择后，通过使用转基因特异性引物对的PCR筛选抗性菌落。我们从iPS25株系的5个FIAU抗性克隆中获得了4个无转座子克隆，从iPS28株系的7个克隆中获得7个克隆，从iPS216株系的11个克隆中得到2个克隆。在这些实验中，每个转染细胞的转座子去除效率约为10⁻⁵然而，FIAU选择使无融合iPSCs易于识别，因为50%的FIAU抗性菌落是无融合的。转座子阴性克隆被进一步扩增，并进行Southern blot分析，以检测5′重复序列猪背肉转座子。通过Southern blot分析，PCR阴性的所有克隆均已丢失转座子(图3b). 使用一系列额外的转基因探针也证实了转座子的去除(补充图5). 为了进一步验证这一点，我们使用转座子特异性引物和针对每个整合位点的引物对每个亲本初级iPSC系的2个克隆进行了基因组PCR(补充图4). 在所有亲本iPSC株系中，特异性宿主-转运子连接扩增很容易检测到，而MEF和无转座子iPSC没有产生任何PCR产物(图3c-e). 这也通过使用转座子特异的引物对得到了证实(补充图6). 此外，详尽的PCR分析没有显示转座子载体或猪背肉转座酶表达载体(补充图6). 因此，我们得出结论，在FIAU抗性iPSC菌落中成功地去除了转座子。

在单独的窗口中打开

图3

从已建立的iPSC系中去除转座子

(一)转座子移除示意图。之后猪背肉转座酶转染，转座子不转座或不移动到其他基因座的细胞对FIAU敏感，而转座子在其他地方不重新整合的细胞则具有FIAU抗性。(b条-e（电子）)Southern印迹分析显示无转座子iPSC系的证据(b条)和基因组PCR(c（c）-e（电子）). (b条)猪背肉以转座子5′重复序列为探针。亲本iPSC系有2个转座子整合拷贝（iPS25、28和216）。请注意，在Hin公司iPS28的dIII摘要，两个片段大小相似，迁移到相同的位置（另请参阅补充图3d). FIAU抗性亚克隆（命名为Δ）没有任何转座子。用控制探针重新混合印迹，以显示相等的样品负载。(c（c）-e（电子）)设计特异性引物检测单个转座子整合位点。MEF和每个初级iPSC克隆分别作为阴性和阳性对照。(（f）,克)iPS28衍生克隆中转座子切除后原始序列完全恢复的证据。顶部面板是原始基因组序列。中间的面板显示转座子整合位点，其中TTAA序列在转座子的两端重复。底部面板中的电泳图显示，iPS28衍生克隆在切除后的序列与MEF中的原始序列相同。chr.6上的集成站点1(（f）)和chr.15上的站点2(克)如图所示。

这个猪背肉转座子不会在切除的位点留下足迹。为了证实无转基因iPSC没有足迹突变，我们对包含整合/切除位点的基因组区域进行了PCR扩增，并直接对PCR产物进行了测序。如果存在足迹突变（例如核苷酸改变、插入或删除），TTAA后的序列猪背肉整合，将是来自野生型和切除等位基因的序列的混合。来自所有整合位点的信号与原始基因组序列相同(图3f，g和补充图7)，表明没有足迹突变。因此，我们通过去除转座子成功地“治愈”了转基因iPSC。

<2A肽链4或5因子盒>

鼠标10月4日,Sox2系统,Klf4公司和cMyc公司分别用引物对Oct4-B-U1和Oct4-F2A-S、Sox2-X和Sox2-F2A-S、Klf4-X和Klf4-F2A-S以及Myc-X和Myc-S进行PCR扩增。10月4日PCR产物用巴姆HI和萨尔一、 并克隆到pBluescriptIIKS+（pBS）中，得到pPB-Oct4F2A。Sox2系统,Klf4公司和cMyc公司将PCR产物克隆到TA克隆载体（Promega）中，分别得到pGEMT-Sox2F2A、Klf4F2A、cMyc。要在单个向量中组合4个因子Xho公司我-萨尔Sox2-F2A的I片段首先插入萨尔pBS-Ort4F2A的I位点，导致pBS-OfSf。然后是一个Xho公司我-萨尔Klf4-F2A的I框架插入萨尔I pBS-OfSf的位点，产生pBS-OffSfKf。最后，aXho公司我-萨尔cMyc的I片段被插入萨尔pBS-OfSfKf的I位点，产生pBS-4F。

要将Oct4和Sox2之间的F2A更改为T2ANsi公司我-Aat公司用OctT2ASox和OtS-seqL引物对产生的PCR片段替换pBS-4F的II片段，得到pBS-4FT。

为了进一步将Sox2和Klf4之间的F2A更改为T2AAat公司二-理学硕士用融合PCR产生的PCR片段替换pBS-4FT的I片段。简单地说，在单独的试管中使用引物对StK-U1和StK-L2以及StK-U2和StK-L1进行两次PCR。然后对这些PCR产物进行柱纯化，并将其用作第二次PCR的模板，该模板带有一对引物StK-U1和StK-L1。得到的载体称为pBS-4FTT。

要将Lin28添加到2A肽样4因子载体中，第28行用Lin28-U1和Lin28-L1对cDNA进行PCR扩增，并克隆到巴姆HI（高）-生态pBS的RI位点。T2A-Lin28片段侧翼为英国标准时间BI和Xho公司通过PCR（引物对MtL-U1/MtL-L1）扩增I位点并插入英国标准时间双-Xho公司pBS-4FTT的I位点，产生pBS-4FTTL。

中的OSKM、OSKM*和OSKML图2分别对应于4FTT、4FT和4FTTL。

<猪背肉基于转座因子的表达向量>

首先是CAG启动子驱动的表达载体pCAG。EBNXN，通过替换生态RI公司-Nsi公司pCAG-IP的I片段³³带有包含多克隆站点的链接器(生态RI、，Bgl公司二、，不是我，Xho公司我，Nsi公司一） ●●●●。第二，a猪背肉携带CAG启动子驱动表达盒pPB-CAG的载体。EBNXN，通过插入萨尔我-巴姆pCAG的HI片段。EBNXN进入Xho公司我-巴姆pPB-LR的HI位点。

<4因子或5因子表达载体>

通过插入巴姆HI（高）-萨尔四因子结构的I片段或巴姆HI（高）-Xho公司我将5因子结构片段整合到Bgl公司二-Xho公司I pPB-CAG的位置。EBNXN，分别产生pPB-CAG.4F、pPB-CAG.4FT、pPB_CAG.4FTT和pPB-CAG.4FTTL。最后，一个阴性选择标记，PGK-聚氨基甲酸酯Δtk公司盒，用Xho公司我消化并插入萨尔基于pPB CAG的因子表达载体的I位点。

<猪背肉带有eGFP盒的转座子载体>

首先，a猪背肉构建了携带人泛素C（UbC）启动子驱动表达盒的转座子载体。用引物UbC-U和-L以及bpA-U和-L.分别扩增了UbC启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列（bpA）。安Nhe公司我-生态UbC启动子的RI片段和生态RI公司-萨尔bpA的I片段被连接到Nhe公司我-萨尔pPB-LR5的I位点，产生pPB-UbC。其次，从pCX-GFP中切下一个eGFP片段并插入生态pPB-UbC的RI位点，产生pPB-Ub C.eGFP。最后，从PL452中切除PGKneo盒³⁴通过Xho公司我消化并插入萨尔pPB-UbC.eGFP的I位点，导致pPB-Ub C.eGFP-neo

细胞培养

MEF由e14.5野生型胚胎（近交系C57Bl/6）制备而成-提尔^c-溴/c-溴对于猪背肉研究，B6129S6F1和ICRB6F1用于逆转录病毒研究），并在含有10%FBS（HyClone）、2 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸和0.1 mM 2-巯基乙醇的DMEM中培养。在含15%FBS（HyClone）、2 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、0.1 mM 2-巯基乙醇和1000 U ml的DMEM血清型ESC培养基（F15L）中，在丝裂霉素C处理的MEF上培养了一个具有种系竞争力的小鼠ESC系（KY1.1、B6129S6F1背景；未发表）和小鼠iPSC系⁻¹LIF（化学试剂）。

使用转座子向量对MEF进行重新编程

MEF被镀在6孔板上（5×10⁵细胞/孔）转染前一天。第二天（第0天），2.0μg pCMV-mPBase³⁵以及含有猪背肉根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染转座子。在第1天，将转染的MEF进行胰蛋白酶处理，并在MEF培养基中以1:18的分流比重新放置到饲养层上。第2天，应用F15L培养基。将VPA添加到2 mM培养基中¹⁹从第2天到第7天。培养基每隔一天更新一次。第7天，培养基更换为无血清ESC培养基（K15L），其中含有15%的敲除血清替代物（Invitrogen），而不是FBS。培养基每隔一天更新一次。在第14天，用碱性磷酸酶检测试剂盒（Chemicon）对菌落进行染色并计数，或者采集菌落并进一步扩大。

逆转录病毒载体对MEFs的重新编程

逆转录病毒载体（pMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-c-Myc）²是从Addgene获得的。参考文献中描述了逆转录病毒的制备和MEF的感染。2。感染后一天，将细胞重新放置在含有3000个细胞/孔的饲养层的6孔板上。后续培养条件如所述补充图2。

从初级iPSC中去除转座子

这个猪背肉转座酶表达载体电穿孔成2×10⁶iPSC。细胞维持3天，以允许puΔtk蛋白的周转。5 × 10⁵然后将细胞接种到含有饲养细胞的10cm培养皿中。第二天，将FIAU添加到培养基（0.2μM最终浓度）中，并继续选择5天。在没有FIAU的情况下再培养5天后，采集并扩大产生的菌落。用PCR检测转座子去除情况，引物列于补充表2并通过Southern blot分析证实猪背肉转座子作为探针。5′端重复序列探针猪背肉在Southern杂交分析中，转座子特异性检测5′重复序列，而不检测3′末端重复序列。

无集成iPSC线的GFP标记

在Hepes缓冲盐水（20mM Hepes，pH 7.05，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na₂高性能操作₄，6mM葡萄糖），在230 V和500μF下，使用基因脉冲器II（Bio-Rad）。用嘌呤霉素（1μg ml）筛选细胞⁻¹)采集并进一步扩大产生的菌落。通过PCR和Southern blot分析验证了同源重组。为了普遍表达GFP，使用与上述相同的条件，用1μg pPB-UbC.eGFP-neo和5μg pCMV-mPBase对iPS25Δ1进行电穿孔，并用G418（180μg ml⁻¹). 挑选产生的菌落并进一步扩大。

夹板的制备

通过退火Spl-top和Spl-sau（对于产生5′-GATC突出端的酶）、Spl-blunt（对于产生钝端的酶而言）或Spl-CG（对于生成5′-CG突出端的酶类而言）来制备剥离体。这些寡核苷酸的序列列于补充表2在95°C下热变性10分钟后，通过在10 mM Tris-HCl（pH7.4）和5 mM MgCl中冷却11 pmol每条链的混合物来进行退火₂总体积为100μl。

转座子整合位点分析

用Splinkerette PCR测定转座子整合位点³⁶。用一个4碱基对切割器消化初级iPSCs（0.5μg）的基因组DNA，姆博我，海三、，铝我，南非兰特我，消息传递程序我Taq公司I、 以及Hin公司P1I在20μl中持续2小时。热灭活后，使用2μl消化混合物在20μl反应中与相应的脾小体适配器（11pmol）连接。然后对1μl结扎混合物进行巢式PCR。引物对Spl-P1/PB3-P1或Spl-P1/BB5-P1用于第一次PCR。在第二次PCR中，使用了一对Spl-P2/PB3-P2或Spl-P2/PB5-P2。最后，PCR产物直接测序以确定侧翼的基因组序列猪背肉终端重复。序列通过UCSC基因组浏览器上的Blat搜索进行分析。

RT-PCR分析

使用TriZol试剂（Invitrogen）提取总RNA。使用寡核苷酸（dT）引物通过SuperScriptII（Invitrogen）逆转录1μg总RNA，并使用中列出的引物进行PCR补充表2在ABI7900HT序列检测器（Applied Biosystems）上使用铂SYBR Green qPCR superMix（Invitrogen）进行定量RT-PCR。使用每个RT-PCR产品的系列稀释液生成标准曲线。单个转录物的表达水平标准化为Gapdh公司表达式。

测序法

使用EpiTect亚硫酸氢盐测序试剂盒（Qiagen）进行亚硫酸氢盐测序。使用的底漆列于补充表2。

蛋白质印迹分析

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000将4因子或5因子表达载体导入293T细胞。转染后48小时，收集细胞并悬浮在LDS样品缓冲液（Invitrogen）中，在4-15%梯度凝胶上分离蛋白质。使用抗Oct4（鼠单克隆，C-10，Santa Cruz）、抗Sox2（兔多克隆，H-65，Santa Cruz），抗Klf4（兔多基因，H-180，Santa Cruz）和抗cMyc（兔多基因组，ab11917，Abcam）、抗Lin28（兔多染色体，ab46020，Abcan）或抗肌动蛋白抗体（鼠单抗，AC-15，Sigma）分析蛋白质印迹。

免疫染色

室温下用4%多聚甲醛/PBS固定细胞15分钟，室温下用0.05%Triton-X100/PBS渗透10分钟，然后在室温下用1%BSA/PBS封闭1小时。用PBS洗涤细胞，并与抗Nanog抗体（1:300，兔多克隆，ab21603，Abcam）和/或抗Oct4抗体（1:50，小鼠单克隆，C-10，Santa Cruz）在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤（6×10 min）后，在室温下用Alexa488或555结合二级抗体（Invitrogen）标记细胞1小时。然后用PBS（3×10 min）清洗细胞，并在室温下用0.5μM的Toto-3在PBS中对细胞核进行1小时的复染。在用PBS进行最终清洗（3×10 min）后，使用荧光显微镜或Radiance2000共焦显微镜（Bio-Rad）对样品进行分析。根据制造商的说明，使用Vectastain ABC试剂盒（Vector laboratory）进行显色检测。

我们感谢Ruby Banerjee的核型分析，感谢Meng Li、Chikara Kokubu和Kyoji Horie的帮助、建议和评论。我们也感谢82队的每一个人和Wellcome Trust Sanger Institute的RSF对我们的支持。K.Y.由日本科学促进会博士后奖学金资助。这项工作得到了威康信托基金（WT077187）的支持。