神经元自噬诱导和自噬体清除与阿尔茨海默病自噬病理的关系

电子显微镜和后埋入。

对一名临床诊断为痴呆和明显运动障碍的74岁男性进行了皮层活检标本研究。患者接受了放置心室分流术的手术，在分流术穿透部位附近获得的额叶皮层组织显示出大量神经原纤维缠结和淀粉样蛋白核心斑块，这与先前描述的阿尔茨海默病的神经病理学诊断一致(Nixon等人，2005年). 组织用3%戊二醛/0.1固定米磷酸盐缓冲液，pH 7.4，后固定在索伦森磷酸盐缓冲液中的1%四氧化锇中。在乙醇中脱水后，将组织包埋在Epon（电子显微镜科学）中。将组织块连续切割成超薄（0.06μm）切片。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。表达人类APP瑞典突变（APP）的转基因小鼠_{K670米/N671升})和突变型PS1（PS1_M146升) (达夫等人，1996年)在16个月大时进行研究。大脑皮层的超薄切片从嵌入Epon的块上切下，放置在铜网格上进行结构分析。

通过去除培养基，在37°C无补充的Neurobastic培养基中洗涤（三次），并在0.1中添加4%多聚甲醛和1%戊二醛，将神经元固定用于电子显微镜（EM）米二甲氨基甲酸钠缓冲液，pH 7.2（电子显微镜科学），室温下放置3小时。固定后，将神经元在二甲氨基乙酸缓冲液中清洗（三次），后固定在1%四氧化锇中，在梯度系列乙醇（50–100%）中逐渐脱水，并包埋在Epon中。使用Rechert Ultracut S切片机从聚合物上切下1μm的薄片，然后切下超薄切片（70–80 nm），并放置在铜网格上进行结构分析。在用飞利浦电子显微镜（CM 10型）检查网格之前，用醋酸铀酰和柠檬酸铅短暂染色。使用Advantage CCD camera System软件（Advanced Microscopy Technologies Corporation）在数码相机（滨松；型号C4742-95）上拍摄图像。

瞬时DsRed–LC3和绿色荧光蛋白–Endo转染。

将绿色荧光蛋白（GFP）-LC3中LC3的PCR-扩增编码序列（由日本东京医学和牙科大学水岛信宝提供）亚克隆到pDsRed-单体C1载体（Clontech）中以创建DsRed-LC3，并通过测序进行验证。pEGFP-Endo报告载体是从Clontech获得的，它编码一个包含人类RhoB GTPase的融合蛋白。初级皮层神经元3-4天在体外根据制造商建议的条件，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染35 mm玻璃底皿中的（DIV）。简单地说，用转染培养基替换2ml条件培养基（转染前），转染培养液由1μg DNA、5μl脂质体2000、500μl Opti-Mem（Invitrogen）和1.5 ml不含B27的神经基底培养基组成。在37°C下用转染培养基培养神经元30分钟，然后用新鲜的Neurobastic培养基替换（三次）。处理前，将条件培养基读取到转染的神经元，并在培养箱中保存至少24小时。

BODIPY-胃蛋白酶抑制素-FL标记。

DsRed-LC3转染的初级皮层神经元与1μ米BODIPY-胃蛋白酶抑制素-FL（Invitrogen）在37°C的Neurobasic培养基中培养1小时，然后用新鲜Neurobased培养基替换（两次）。随后，用低荧光Hibernate培养基（BrainBits）代替Neurobasic培养基以降低荧光背景，并将培养物放置在含有5%CO的37°C湿化室中₂在蔡司LSM510共焦显微镜上。Z轴-使用LSM 520软件获取堆栈图像。

神经元采集和免疫印迹分析。

在六孔塑料皿（BD Biosciences）中生长的神经元（DIV 5）在室温下，在pH 7.4的PBS中清洗（三次），然后刮取200μl/孔的冰溶缓冲液[M-PER缓冲液中含有Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1:100）和50μl/口米乙二胺四乙酸；皮尔斯]。使用Bradford分析法（Pierce）测定蛋白质浓度，并使用70%三氯乙酸将样品标准化为1μg/μl，以沉淀在等体积的裂解缓冲液中再次悬浮的细胞裂解液。样品装载缓冲液（2×）（62.5米米Tris-HCl，pH 6.8，25%甘油，2%十二烷基硫酸钠，0.01%溴酚蓝，710μ米将β-巯基乙醇）与裂解缓冲液以1:1的比例添加到细胞裂解液中，然后在90°C下加热样品5 min。三甘氨酸凝胶（Invitrogen）装载25μg/孔蛋白，并使用10%的磷酸化p70 S6激酶凝胶（Thr 389）和总p70 S6-激酶凝胶（均来自细胞信号）和16%的凝胶分离微管相关蛋白1A/B（LC3-I）和LC3-II的轻链3。将分离的蛋白质转移到0.2μm硝化纤维素膜（Protran；Whatman）上，在250 mA（p70S6激酶）下持续2 h，或在100 mA（LC3）下持续8 h。膜在含有0.1%吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中冲洗，然后在室温下在5%脱脂牛奶/TBS-T溶液中封闭1小时。在1%的BSA/TBS-T溶液中，以1:250的比例稀释一级抗体（p-p70和总p70），以1:1000的比例稀释LC3（根据GST标记的重组蛋白制备抗大鼠LC3的一级抗体）(Yu等人，2005年). 在RT下，将膜与一级抗体孵育2 h，在TBS-T中洗涤三次，然后在RT下在含有碱性磷酸酶结合二级抗体（Promega）的二级抗体溶液（3%脱脂牛奶/TBS-T）中孵育1 h，以检测p-p70S6激酶和总p70S6-激酶印迹，以及用于LC3印迹的辣根过氧化物酶结合抗体（GE Healthcare）。在应用化学发光底物（CDP-Star；Applied Biosystems；ECL；GE Healthcare）之前，将膜在PBS-Tween中清洗三次10分钟，然后将膜暴露在x射线胶片上。使用美国国立卫生研究院的Image-J（NIH Image，1.63版）软件对代表蛋白质表达的条带进行密度测定。对于每个免疫印迹，每个通道的带强度相对于对照通道进行了标准化。随后，根据标准化值计算处理之间的百分比变化。

免疫细胞化学。

通过去除培养基，在PBS中清洗（三次），并在RT中添加4%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）15分钟，将神经元固定用于免疫细胞化学分析。在0.02%Triton X-100/PBS中使神经元渗透15分钟，然后在RT中用2%胎牛血清/0.02%Triton X-100/PBS封闭溶液封闭1小时。在封闭溶液中制备一级抗体，并与神经元特异性III类β-微管蛋白（1:1000；TUJ-1；R&D Systems）孵育2 h，在4°C下过夜，以检测LC3（1:250；纳米工具）和组织蛋白酶D（1:5000；室内）。细胞在PBS中清洗（三次）10分钟，然后用TRITC（四甲基罗丹明异硫氰酸盐）和FITC（荧光素异硫氰酸酯）标记的二级抗体（1:1000/封闭溶液；Invitrogen）在RT培养1小时在PBS中放置10分钟，然后使用防褪色Gelmount（Biomeda）将盖玻片安装到显微镜载玻片上，并使用蔡司共焦显微镜进行可视化。

免疫电子显微镜。

用4%多聚甲醛、0.15%戊二醛和4%蔗糖固定神经元米在37°C的Neurobasic培养基中放置二甲氨基甲酸钠缓冲液30分钟，然后在4°C的无Neurobased的固定液中孵育24小时。使用相同的一级抗体，平行进行预包埋和后包埋免疫-EM。对于预埋，细胞在PBS中与0.1%硼氢化钠孵育15分钟，并在PBS内洗涤（四次）10分钟。细胞在PBS中用0.05%Triton X-100渗透30分钟，在PBS里洗涤（四遍）10分钟，然后在4°C下用5%BSA和5%正常山羊血清在PBS上封闭1小时。细胞在4°C下用一抗多克隆组织蛋白酶D（封闭缓冲液中1:2000）孵育过夜，然后在RT下用超小型金结合山羊抗兔二抗（封闭缓冲溶液中1:100）洗涤和孵育2小时。根据制造商的指南，使用定制超小型工具（电子显微镜科学）对超小型黄金进行镀银处理。银增强后，用四氧化锇将细胞固定，并进行EM处理，如前所述(Yu等人，2005年). 对于后包埋免疫电镜，细胞用新制的3%多聚甲醛固定，其中含有0.1%戊二醛和4%蔗糖米二甲氨基甲酸钠缓冲液。固定后，将细胞清洗、脱水并嵌入Lowicryl K4M（Polysciences）中，并在−35°C的紫外线（360 nm）下聚合。超薄切片被切割并安装在Formvar和碳涂层镍格栅上。在4°C下与一级抗体孵育过夜后，金缀合的二级抗体[18nm胶体金亲和纯山羊抗兔IgG（H+L）；Jackson免疫研究实验室；15nm蛋白质A金；荷兰乌得勒支大学医学中心细胞显微镜中心]应用标准方法，用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行染色。如前所述，对人脑进行了植入后免疫金电子显微镜检查(尼克松等人，2005年).