自然杀伤细胞抑制人肝细胞HCV全周期感染

总结

简介

作为丙型肝炎病毒（HCV）复制的主要场所的正常肝脏含有高百分比的CD3^-CD56型⁺自然杀伤细胞[1]. NK细胞是先天免疫系统的核心组成部分，通过其快速细胞毒活性和产生抗病毒细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ) [2]. NK细胞通过直接溶解（穿孔素/颗粒酶）或间接（分泌抗病毒细胞因子）机制清除病毒感染的肝细胞。此外，NK细胞在招募病毒特异性T细胞和在肝脏中发挥抗病毒免疫的重要作用[三]. 然而，丙型肝炎病毒已经制定了多种策略来逃避宿主的NK细胞反应，这一点可以从慢性丙型肝炎感染患者肝脏中NK细胞数量减少的观察结果中得到证明[4-6]与未感染的对照组相比，外周血NK细胞活性降低[7,8]. IFN后清除HCV感染的患者-α与无应答者相比，治疗（应答者）外周血中的NK细胞数量和活性显著增加[7,9,10]. 许多研究利用有趣的数据检验了NK细胞在接触HCV成分时的功能。曾和克伦普[11]和克罗塔等。[12]报道HCV包膜蛋白E2损害NK细胞功能在体外然而，关于体外慢性丙型肝炎患者的NK细胞功能导致混合结果[5,7,8,13-15]. 最近的一项研究报告称，慢性HCV感染时，NK细胞的细胞溶解功能似乎没有受损[16]. 因此，需要进行更深入的研究来检查HCV-NK细胞之间的相互作用。

丙型肝炎病毒与先天免疫系统的相互作用在丙型肝炎的免疫发病机制中起着关键作用。虽然大多数研究工作都集中于适应性免疫和病毒因子之间的相互作用在丙型肝炎免疫发病机制中的作用，但关于NK细胞介导的先天免疫在控制肝细胞丙型肝炎感染中的作用的信息有限。在细胞和分子水平上缺乏直接证据表明NK细胞有能力抑制HCV在人类肝细胞中的全周期复制。我们先前证明NK细胞抑制人类肝细胞中HCV复制子的表达[17]. 然而，HCV复制子不允许分析HCV的整个生命周期。因此，我们对NK细胞与HCV之间直接相互作用的了解仍然有限。幸运的是，最近建立了一种全长基因型2a HCV基因组（JFH1），它可以在人类肝细胞中复制并产生感染性病毒[18-21]为研究宿主免疫细胞与HCV感染之间的相互作用提供了一个临床相关模型。因此，在本研究中，我们检测了支持病毒全周期复制的新细胞系统中NK细胞的抗HCV活性。此外，我们利用该模型研究了NK细胞介导的人类肝细胞抗-HCV作用的分子机制。

材料和方法

结果

NK细胞抑制HCV复制

我们假设NK细胞释放抗-HCV可溶性因子，抑制人类肝细胞感染HCV。为了验证这一假设，我们采用了两种方法。在第一组实验中，使用跨阱共培养系统来确定NK细胞是否释放抑制人类肝细胞HCV感染的可溶性因子。顶部隔室（插入物）中的NK细胞与底部隔室中镀有JFH1感染的Huh7.5.1细胞共同培养。在与NK细胞共同培养的肝细胞中，HCV RNA的表达被显著抑制（抑制率高达80-90%(图1a). 抑制程度与加入共培养系统的NK细胞数量呈正相关(图1a). 在第二组实验中，我们检测了从NK（PNK或NK92）细胞培养物中收集的NK SN是否具有抗HCV活性。NK SN以浓度依赖的方式抑制HCV RNA的表达(图1b). Western blot分析也证实了NK SN在HCV JFH1感染的肝细胞中的抗HCV活性，表明NK SN抑制HCV NS5A蛋白的表达(图1c). NK SN一旦加入HCV JFH1感染的肝细胞中，可抑制细胞间病毒复制至少96小时(图2a)，这一点通过观察证实，NK SN处理的肝细胞释放的HCV RNA水平明显低于未处理的对照细胞(图2b).

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图1

NK细胞释放可溶性因子抑制HCV RNA和NS5A蛋白在人肝细胞中的表达。（a） NK细胞与HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞共培养。在感染后第4天，将24孔transwell共培养系统的低区室中的Huh7.5.1细胞与添加到共培养系统的顶区室中的原代NK（PNK）或NK92细胞共培养。（b） NK SN对HCV JFH1 RNA表达的影响。将JFH1感染的Huh7.5.1细胞（感染后第4天）在含有或不含NK SN（PNK或NK92）的条件培养基中培养48小时。从肝细胞中提取的总细胞RNA进行实时RT-PCR，以进行HCV和GAPDH RNA定量。数据表示为相对于对照组的HCV RNA水平（%的对照组，顶部没有NK细胞，或未经NK SN治疗，定义为100%）。所示结果为三份培养物的平均值±SD，代表三个单独实验（*，P（P）<0.05，NK细胞或NK SN与控制）。（c） NK SN对NS5A蛋白表达的影响。感染后第4天，将NK SN（PNK或NK92）添加到HCV JFH1感染的肝细胞培养物中。处理48小时后从细胞中提取总蛋白，并使用NS5A和肌动蛋白特异性抗体进行Western blot分析。显示了三个实验中的一个代表。

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图2

NK SN抑制HCV RNA表达的时间过程。在感染后第4天，将原代NK（PNK）SN或NK-92 SN添加到HCV JFH1感染的肝细胞培养物中。在指定的时间点从肝细胞或培养上清液（SN）中提取细胞内（a）或细胞外（b）RNA，并进行实时RT-PCR以进行HCV和GAPDH RNA定量。细胞内（a）和细胞外（b）HCV RNA表达为HCV RNA 10⁷份/μg细胞RNA或10⁷拷贝数/mL序号。显示的结果是三份培养物的平均值±SD，代表了三个实验（*，P（P）<0.05，NK SN处理与未经处理）。

了解到NK细胞具有释放抗-HCV可溶性因子的能力，我们进一步检测了NK细胞在三种不同条件下的抗HCV活性：Huh7.5.1细胞在HCV JFH1感染前24小时，或与HCV JFF1同时孵育，或在HCV KFH1接种后8小时。用25%（v/v）NK SN预处理24小时后再感染的细胞，其HCV RNA水平显著低于未处理和感染的细胞(图3a). 同样，与对照细胞相比，NK SN处理并同时感染的细胞HCV RNA表达降低(图3a). NK SN在HCV JFH1感染后8小时加入细胞培养物中，也抑制了感染细胞中HCV RNA的表达(图3a). 在三种不同条件下，所有经NK SN处理的肝细胞释放的HCV RNA水平显著低于未经处理的对照细胞(图3b). 此外，尽管PNK SN和NK92 SN均显示抑制HCV RNA的表达，但NK92 SN的抗HCV作用比PNK SN大（图​（图22&三).

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图3

NK SN在不同条件下抑制HCV RNA表达。Huh7.5.1细胞在HCV感染前24小时，或同时或感染后8小时，在含有或不含原发性NK（PNK）SN或NK92 SN的条件培养基中培养。然后用HCV JFH1孵育6小时后，将细胞清洗五次以去除输入的HCV，然后在有或无NK SN的条件下培养8天。感染后第8天从肝细胞或培养上清液（SN）中提取的细胞内（a）和细胞外（b）RNA接受实时RT-PCR，以进行HCV和GAPDH RNA定量。细胞内（a）和细胞外（b）HCV RNA表达是指HCV RNA水平相对于对照组（未经处理的细胞培养物，定义为100%）的相对水平（%）。显示的结果是三份培养物的平均值±SD，代表了三个实验（*，P（P）<0.05，NK SN治疗与未经处理）。

γ-干扰素是NK细胞介导的抗-HCV活性的主要参与者

由于NK细胞在先天性抗病毒防御中发挥着重要作用，部分是通过其分泌IFN等细胞因子的能力-γ[25]，我们检查了IFN-γ负责NK细胞介导的抗HCV活性。从健康供体分离的NK92细胞和PNK细胞产生干扰素-γ(图4a). NK92细胞产生较高水平的干扰素-γ比PNK细胞(图4a). 因此，我们进一步确定IFN是否-γ具有抑制人类肝细胞中HCV全周期表达的能力。我们发现当重组干扰素-γ添加到HCV JFH1感染的肝细胞培养物中，HCV RNA表达受到抑制(图4b、c). 然后我们研究了抗体对干扰素的作用-γ能够消除NK细胞介导的抗HCV活性。结果表明，NK SN与抗干扰素的预培养-γ抗体在很大程度上中和了NK SN的抗HCV活性(图4b、c).

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图4

干扰素-γ参与NK SN介导的抗HCV活性。（a） 干扰素-γ由原代NK（PNK）细胞和NK92细胞产生。干扰素-γ用ELISA法测定PNK细胞（五个供体）和NK-92细胞培养液中的水平。（b） HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞在存在或不存在NK SN和/或IFN抗体（Ab）的情况下培养-γ对于同时使用NK SN和Ab和IFN的培养物-γ，NK SN与抗体-干扰素预孵育-γ在感染后第4天添加到JFH1感染的肝细胞培养物中之前保持30分钟。干扰素-γ将（1000 U/mL）单独添加到细胞培养物中作为阳性对照，以确定抗体对干扰素的中和能力-γ.小鼠IgG_2安培用于确定抗体对干扰素的特异性-γ从肝细胞中提取的总细胞RNA在暴露于NK SN后48小时进行实时RT-PCR以检测HCV和GAPDH RNA定量。数据表示为HCV RNA相对水平（对照组的%，未经Abs处理，未添加NK SN，定义为100%）。显示的结果是三份培养物的平均值±SD，代表了三个实验（*，P（P）<0.05，干扰素-γAb+NK序列号与仅NK SN）。+，在场；-，在缺席的情况下。

NK SN诱导细胞内IFN-α/β和IRFs的表达

由于细胞内IFN-α肝细胞产生的病毒在抑制丙型肝炎病毒复制中起着核心作用[26]，我们检测了NK SN是否具有诱导细胞内IFN的能力-α在肝细胞中表达。与我们之前的研究一致[17]，我们发现NK SN处理的Huh7.5.1表达了较高水平的内源性IFN-α在mRNA和蛋白质水平上都比未经处理的对照细胞(图5a、b). 此外，NK SN处理的Huh7.5.1细胞表达较高水平的内源性IFN-βmRNA比未经处理的对照细胞(图5c). 当HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞与抗体-干扰素预孵育时-α/βR1和NK SN处理后，HCV RNA水平与未经抗IFN预孵育的NK SN-处理细胞相比显著升高-α/βR1级(图5d). 研究细胞内干扰素的诱导-α/βNK SN是JAK/STAT通路中I型干扰素的主要调节剂IRF-3和IRF-7激活的结果，我们分析了IRF-3、IRF-7在HCV JFH1感染的肝细胞中的表达。NK SN处理的细胞在两个mRNA上都显示IRF-3和IRF-7的表达增加(图6a)和蛋白质(图6b)级别。

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图5

NK SN对干扰素表达的影响-α/β在人类肝细胞中。（a和c）干扰素-α/βRNA表达。感染后第4天，将原代NK（PNK）SN或NK-92 SN添加到HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞中（25%，v/v）。在NK SN处理后12 h从细胞培养物中提取总细胞RNA，然后进行IFN的实时RT-PCR-α/β和GAPDH RNA定量。数据表示为干扰素-α/βRNA水平相对于对照（折叠）（无NK SN，定义为1）。所示结果为三份培养物的平均值±标准差，代表三个单独的实验。（b） 干扰素-α蛋白质表达。HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞（感染后第4天）在有或无NK（PNK和NK-92）SN（25%，v/v）的情况下培养48小时。然后从细胞培养物中获取SN用于IFN-α蛋白ELISA检测。所显示的结果是一式三份培养物的平均值±SD（*，P（P）<0.05，NK SN处理与未经处理）。（d） 干扰素抗体-α/βR1阻断NK SN介导的抗HCV活性。HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞与羊抗IFN孵育或不孵育-α/βR1（10μ（g/mL）添加NK SN.IFN前1小时-γ（200 U/mL）或干扰素-α（20 U/mL）处理人肝细胞作为对照。在暴露于NK SN 48小时后测定Huh7.5.1细胞中的HCV RNA水平。对从Huh7.5-1细胞中提取的总细胞RNA进行实时RT-PCR，以进行HCV和GAPDH RNA定量。数据表示为HCV RNA水平相对于对照（%）（无抗体治疗，未添加NKT SN，定义为100%）。所示结果为三份培养物的平均值±SD，代表三个单独实验（*，P（P）<0.05，抗干扰素-α/βR1加NK序列号与仅NK SN）.+，在场；-，在缺席的情况下。

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图6

NK SN诱导人肝细胞IRF-3和IRF-7的表达。（a） IRF-3和IRF-7 mRNA表达。Huh7.5.1细胞（感染后第4天）在25%原代NK（PNK）SN或NK-92 SN存在或不存在的情况下培养12小时。从细胞培养物中提取的总细胞RNA接受实时RT-PCR，以进行IRF-3、IRF-7和GAPDH RNA定量。数据表示为相对于对照组（不含NK SN，定义为1）的IRF RNA水平（折叠）。显示的结果是三份培养物的平均值±SD，代表了三个实验（*，P（P）<0.05，NK SN处理与未经处理）。（b） IRF-3和IRF-7蛋白表达。Huh7.5.1细胞（感染后第4天）在25%NK SN（PNK和NK-92）存在或不存在的情况下培养48小时，从细胞中提取的总蛋白进行Western blot。显示了三个实验中的一个代表。

NK SN增强STAT1和STAT2的表达

虽然STAT1在I型干扰素表达的信号传递中起着关键作用，但STAT2也作为通过I型干干扰素受体进行信号传递的基本介质发挥着公认的作用[27,28]. 我们假设含有干扰素的NK SN-γ激活肝细胞中STAT1和STAT2的表达。正如预期的那样，NK SN处理的肝细胞比未处理的对照细胞具有更高的STAT1和STAT2蛋白水平(图7). 干扰素的作用-γ在NK SN介导的STAT1和STAT2的诱导中，观察到添加重组IFN-γ与NK SN的作用相似(图7).

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图7

NK SN对STAT1和STAT2蛋白表达的影响。（a） 感染后第4天，将HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞在含有25%原代NK（PNK）SN或NK-92 SN的条件培养基中培养48小时。使用STAT1、STAT2和肌动蛋白特异性抗体（Abs）对从HCV JVH1感染的Huh 7.5.1细胞中提取的总蛋白进行Western blot分析。干扰素-γ（1000 U/mL）作为阳性对照。给出了一个具有代表性的实验。（b） 图7a中的数据通过相对密度进行分析，相对密度归一化为肌动蛋白（未经处理的HCV JFH1感染细胞，定义为1）。

讨论

在本研究中，我们进一步检测了新开发的感染性HCV（JFH1）系统中NK细胞的非细胞裂解性抗HCV活性。我们已经证明，NK细胞释放可溶性因子，可以有效抑制HCV在人类肝细胞中的复制。这种NK细胞介导的抗-HCV活性是有效的，观察结果表明，与NK细胞共同培养或暴露于NK SN的肝细胞中高达90%的HCV RNA表达被抑制。这种NK淋巴细胞介导的抗-HCV活动也是先天性的，因为实验中使用的PNK细胞是从HCV血清阴性受试者中分离出来的。我们随后确定了干扰素-γ是NK细胞介导的抗HCV活动的主要参与者。干扰素的关键作用-γ在NK SN介导的抗-HCV作用中，实验表明，NK SN-与抗体对IFN的预孵育-γ大幅度阻断NK SN介导的肝细胞抗-HCV活性(图4b、c). 干扰素的抗HCV作用-γNK92细胞的SN产生较高水平的IFN，进一步证实了NK细胞产生的IFN-γ比PNK细胞(图4a)，这与NK92 SN的抗HCV活性优于PNK SN的结果相对应（图​（图11-​-3).三). 干扰素-γ是由免疫系统细胞对病原体作出反应而产生的。NK细胞是产生干扰素的主要免疫细胞之一-γ这在控制病毒感染方面具有重要作用。已经证明IFN-γ是HCV复制的强大抑制剂[25,29]. 我们之前通过干扰素证明了NK细胞-γ-依赖机制，抑制肝细胞中HCV复制子的表达[17]. 然而，HCV复制子细胞不会产生感染性HCV体内这一先前发现的含义尚待确定。因此，目前的研究使用新建立的HCV感染细胞系统[18-21]这不仅是一项验证性调查，还提供了可能具有临床相关性的新的重要信息。例如，与我们只能检测NK细胞对细胞内HCV复制子表达的影响的HCV复制子系统不同，感染性HCV细胞模型使我们能够确定NK细胞是否有能力抑制幼稚肝细胞的HCV感染。我们证明，与未经处理的细胞相比，经NK SN预处理的肝细胞对HCV JFH1感染的敏感性较低(图3a). 此外，我们能够证明NK SN处理的肝细胞释放的HCV水平显著低于未处理的对照细胞(图3b).

虽然已广泛证明IFN具有抗病毒特性，但IFN介导的抗病毒活性的机制仍不清楚。我们假设干扰素-γ在NK SN中激活肝细胞的细胞内固有免疫。IFN是抗HCV感染的肝内固有免疫的关键成分之一-α[26]. 临床上，干扰素-α已被用作慢性HCV感染的主要治疗方法。此外，干扰素-β在宿主抵抗病毒感染的先天免疫中起着关键作用。鉴于细胞内干扰素的重要作用-α/β在确定丙型肝炎病毒是否能建立持续感染时，重要的是确定干扰素-γ或NK SN诱导内源性IFN的表达-α/β在HCV感染的肝细胞中，抑制HCV复制。NK SN诱导细胞内IFN的研究-α/β人肝细胞中的表达(图5)为NK SN介导的抗-HCV活性提供了良好的机制。同样，重组干扰素-γ当添加到HCV JFH1感染的肝细胞培养物中时，诱导内源性IFN-α/β表达，表明干扰素可能-γ在NK中，SN主要负责NK-SN介导的内源性干扰素的诱导-α/β在人类肝细胞中。。干扰素的贡献-γNK SN增强STAT1和STAT2的表达也支持NK细胞介导的非细胞溶解性抗HCV活性，STAT1与STAT2是激活I型干扰素介导的抗病毒途径所必需的核因子。众所周知，干扰素-γ信号同时激活STAT1和STAT2[27,28]以及功能性STAT1和STAT2对宿主对病毒感染的先天反应至关重要。干扰素-γ和干扰素-α/β信号通路在多个层面上相互作用。高冈等。证明IFN-γ小鼠胚胎成纤维细胞的信号传递需要构成性的阈下干扰素-α/β信号，而干扰素水平低-α/β信号是维持其受体磷酸化状态所必需的，从而为干扰素的有效组装提供功能帮助-γ-活化STAT1同型二聚体[30].

我们目前的研究表明，NK SN或IFN-γ诱导人肝细胞IRF-3和IRF-7的表达。IRF-3和IRF-7在I型干扰素介导的抗病毒反应中起着不同的重要作用[31,32]，作为通过IRF-3和IRF-7刺激IFN的信号传导-α/β生产[33]. IRF-3和IRF-7之间存在一种特性良好的协作，用于增强抗病毒反应。特别是，在病毒感染期间，IRF-3在诱导IFN转录方面发挥早期作用-α和干扰素-β可以诱导IRF-7表达。新合成的IRF-7随后促进不同IFN亚单位的转录，从而创建正反馈回路[34]. 与IRF-3一样，病毒感染似乎在其C末端诱导IRF-7磷酸化，该区域与IRF-3C末端高度同源。IRF-7与IRF-3形成同二聚体或异二聚体，两者都具有反式激活潜能。IRF-7不仅诱导干扰素-α但也激活了许多具有抗病毒活性的IFN刺激基因。此外，IRF-7可能直接抑制HCV复制。已经证明HCV的几种蛋白能够抑制IRF-3和IRF-7的表达，从而抑制内源性IFN的产生-α在人类肝细胞中。Foy公司等。表明HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶阻断IRF-3的磷酸化和效应作用[35]. 我们之前已经证明HCV NS5A蛋白抑制IRF-7的表达[26]. 因此，NK SN诱导IRF-3和IRF-7表达的结果为NK SN-介导的肝细胞内源性I型IFN表达增强提供了合理的机制。

总之，使用产生感染性HCV的临床相关细胞模型进行的本研究不仅提供了确凿的信息，而且提供了新的信息，表明NK细胞在宿主抵抗HCV感染和肝细胞复制的天然防御中具有重要作用。更重要的是，我们展示了干扰素-γNK细胞通过激活细胞内I型干扰素系统而产生，抑制HCV在肝细胞中的复制。鉴于NK细胞在肝脏中大量存在，并且也是宿主天然免疫防御机制的关键组成部分，这一发现尤其重要。虽然我们的在体外利用PNK细胞和NK细胞系进行的研究为人类肝细胞中NK细胞的非细胞溶性抗HCV能力提供了深入的见解，需要进一步研究以验证我们的发现的临床意义。

致谢

缩写

脚注

参考文献