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美国国家科学院院刊。1999年3月2日；96(5): 2110–2115.
数字对象标识：10.1073/pnas.96.5.2110
预防性维修识别码：PMC26745型
PMID：10051603

G的规定1由PTEN公司抑癌蛋白与磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的抑制有关

希瓦普里亚·拉马斯瓦米,* 中村信孝,* 弗朗西斯卡·巴斯克斯,* 大卫·B·巴特,† 索尼·佩雷拉,* 托马斯·罗伯茨,†和威廉·塞勒斯*‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

PTEN公司/MMAC1型是一个位于染色体10q23上的肿瘤抑制基因。继承PTEN公司/MMAC1型这些突变与被称为考登病的癌症易感综合征有关。PTEN的体细胞突变在许多恶性肿瘤中被发现，包括胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和子宫内膜癌。蛋白产物（PTEN）编码一种双特异性蛋白磷酸酶，此外还可以使某些脂质底物去磷酸化。在此，我们发现PTEN蛋白诱导G1在中重建时阻塞PTEN公司-空单元格。A类PTEN公司与考登氏病（PTEN；G129E）相关的突变体具有蛋白磷酸酶活性，但在去磷酸化肌醇1,3,4,5-四磷酸方面存在缺陷在体外无法阻止G区的细胞1这些数据表明PTEN诱导细胞周期阻滞与其去磷酸化能力之间存在联系，在体内，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸。与这一概念一致，PTEN可以抑制磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸依赖性Akt激酶（磷脂酰肌糖3激酶的下游靶点），并且组成活性，但不是野生型，Akt覆盖PTEN G1逮捕。最后，缺乏PTEN的肿瘤细胞含有高水平的活化Akt，这表明PTEN对磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的适当调节是必要的。

染色体区域10q23异常在许多恶性肿瘤中常见，包括前列腺癌和胶质母细胞瘤(1,2). 最近，一个候选肿瘤抑制基因PTEN公司/MMAC1型/TEP1公司（为简单起见，以下简称PTEN公司)已克隆并映射到此区域(三–5). 体细胞突变PTEN公司发现于多种恶性肿瘤中，包括胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌和头颈部癌(三,4,6–14). 种系突变PTEN公司该基因与Cowden病（CD）和Bannayan-Zonana综合征（BZS）的发生有关(15–18). CD的特点是皮肤、胃肠道、乳腺、甲状腺和中枢神经系统出现多发错构瘤，乳腺癌和甲状腺癌的发病率增加(18). BZS是一种相关综合征，其中肠错构瘤伴有神经异常，包括轻度精神发育迟滞、运动发育迟缓、血管畸形和阴茎斑点(18).

预测的蛋白质产品PTEN公司该基因（以下简称PTEN）与张力蛋白有同源性，张力蛋白是一种定位于黏附复合体的肌动蛋白结合蛋白(19); 辅助蛋白，一种参与脱包被克拉瑟林的囊泡的蛋白质(20); 和双特异性磷酸酶(4,21). 重组PTEN能够去磷酸化酪氨酸和苏氨酸磷酸化底物，此外还可以去磷酸化磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PtdIns-3,4,5-P三) (22,23). 过度生产PTEN可以抑制某些细胞中的集落形成、软琼脂中的生长和裸鼠体内的肿瘤形成(24,25). 最近的数据表明，PTEN可能通过调节黏着斑激酶以及随后抑制黏着和迁移而发挥作用，至少部分是这样(26). PTEN对于超过7.5天的小鼠胚胎发育是必不可少的。在鼠标中丢失PTEN公司等位基因导致皮肤、胃肠道和前列腺的增生和异型增生，以及肿瘤的形成(27).

在这项研究中，我们发现将PTEN cDNA重新引入缺乏野生型PTEN蛋白的细胞会导致G细胞周期阻滞1该功能与PTEN的磷酸酶活性紧密相关，并被肿瘤衍生突变所灭活。此外，一个与CD相关的PTEN突变，在G细胞中的阻遏细胞中保留蛋白磷酸酶活性是有缺陷的1在去磷酸化肌醇1,3,4,5-四磷酸（IP4).

这些数据表明，PTEN可能通过阻断磷脂酰肌醇3-激酶下游靶点（如原癌基因Akt）的激活来调节细胞周期进程。与这个概念一致，PTEN能够抑制细胞中的野生型Akt激酶活性。此外，组成型活性形式的Akt，而不是野生型Akt，可以压倒PTEN诱导的细胞周期阻断。

材料和方法

细胞培养、转染和代谢标记。

ACHN、786-O、SAOS-2和U2-OS细胞（来自Kaelin实验室的礼物）保存在含有10%胎儿克隆（HyClone）、青霉素和链霉素的DMEM中，保存温度为37°C。如前所述，用Fugene 6（Boehringer-Mannheim）转染786-O细胞或用磷酸钙程序转染U2-OS、ACHN和SAOS-2细胞(28,29). 将转染的786-O细胞在5 ml无蛋氨酸培养基中代谢标记3 h，该培养基补充有10%的透析胎牛血清和[35S] 蛋氨酸（100μCi/ml；1 Ci=37 GBq）。

质粒。

从293 cDNA文库中扩增出编码PTEN氨基酸残基1–403的cDNA片段(30)并连接到载体pSG5L-HA(28)给予pSG5L-HA-PTEN；通过逆转录偶联PCR从HeLa细胞总RNA中扩增出Akt-1 cDNA，并用含有Kozak序列和编码血凝素（HA）表位序列的5′引物进行扩增，克隆到pLNCX中，得到pLNCX-HA-Akt。将编码src肉豆蔻酰化序列的双链寡核苷酸插入HA标签的5′，以生成pLNCX-Myr-HA-Akt。pSG5L-HA-PTEN；C124S，pSG5L-HA-PTEN；G129R，pSG5L-HA-PTEN；G129E，pSG5L-HA-PTEN；1–274，pSG5L HA PTEN；1–336和pSG5L-HA-PTEN；Δ274–342，pLNCX-HA-Akt；K179M，pLNCX-myr-HA-Akt；K179M是通过定点突变或PCR突变产生的。将pSG5L-HA-PTEN质粒的插入物克隆到pGEX2T中，得到相应的pGEX2T-PTEN质粒。从胎脑文库中扩增AKT-1的cDNA，并将其连接到pCDNA3-T7-VHL的载体上，得到pCDNA3-47-AKT。所有通过PCR获得或通过定点突变改变的质粒插入物均通过测序进行验证。pCD19之前已经描述过(31).

抗体。

PTEN抗血清（C54）的生产将在其他地方介绍(32). 分别从Babco（加利福尼亚州里士满）、Novagen、Caltag（加利福尼亚州南旧金山）和New England Biolabs获得HA.11、荧光素异硫氰酸盐结合抗CD19、抗T7和抗磷酸化Akt（Ser-473）抗体。

免疫沉淀和免疫印迹。

全细胞提取物的制备、免疫沉淀和免疫印迹条件如下所述(28). 对于免疫印迹，C54抗血清在TBS/4%牛奶中稀释1:500。次级抗体，碱性磷酸酶结合的山羊抗鼠或山羊抗兔（南方生物技术协会）稀释为1:5000。对于化学发光检测，使用1:2000稀释度的辣根过氧化物酶结合抗鼠抗体（Santa Cruz Biotechnology），并使用SuperSignal试剂盒（Pierce）进行检测。

荧光激活细胞分类。

用4μg pCD19和11μg（Fugene 6转染）或21μg（磷酸钙转染）骨干pSG5L质粒或编码PTEN或指示PTEN突变体的pSG5L质粒转染p100平板上生长的细胞。CD19+细胞的细胞周期测定如所述进行(28).

蛋白质和肌醇磷酸酶测定。

聚乙烯（Glu4-提尔1)共聚物（Sigma）被磷酸化在体外基本上如所述(22). 简单地说，poly（Glu4-提尔1)在最终浓度为3.3 mg/ml的50 mM Tris●HCl（pH 7.4）和2 mM MnCl中再次悬浮2，10 mM氯化镁2和0.1 mM ATP在含有10μCi[γ]的反应混合物中-33P] ATP和100单位的β-胰岛素受体激酶（Stratagene），并在30°C下孵育4 h。用100%三氯乙酸（TCA）沉淀标记的共聚物，用20%的TCA和丙酮洗涤，冻干并重新悬浮，然后用50 mM咪唑（pH 7.2）透析。蛋白质磷酸酶测定如所述进行(22). 脱磷[三H] 如所述，通过使用1μg相关谷胱甘肽来执行肌醇1,3,4,5-四磷酸（NEN）S公司-转移酶（GST）融合蛋白(23).

Akt激酶分析。

用编码T7-Akt-1和pSG5L、pSG5L-HA-PTEN或突变衍生物的质粒转染U2-OS细胞。转染后36小时，从细胞裂解液中制备T7免疫沉淀，收集在蛋白A-Sepharose上，并在含有30 mM Hepes（pH 7.5）、10 mM MgCl的反应混合物中培养2，5 mM氯化锰2，1 mM DTT，20μM ATP，10μCi的[γ-32P] ATP和5μg含有Akt肽底物的GST融合蛋白，在25°C下保持30分钟。将放射性标记底物与未结合的[γ-32P] ATP通过凝胶电泳和放射自显影检测。

结果

PTEN在G中引发阻塞1细胞周期的阶段。

在PTEN缺失的786-O肾癌和A172胶质母细胞瘤细胞系中稳定表达PTEN的尝试未能产生产生可检测HA-PTEN的克隆系（数据未显示）。接下来，使用瞬时分析来确定PTEN是否能够改变细胞周期进展。786-O肾癌细胞缺乏PTEN蛋白（图。​（图11D类)用空载体或编码HA标记PTEN（PTEN；WT）或肿瘤衍生PTEN催化域突变体（PTEN，G129R）的质粒瞬时转染(4)以及编码细胞表面标记CD19（pCD19）的质粒。40小时后，通过用异硫氰酸荧光素结合的抗CD19抗体和碘化丙啶对细胞进行染色，然后进行荧光激活细胞分选，来测定成功转染细胞的DNA含量。野生型PTEN可重复地诱导G细胞百分比的增加1单独与矢量或PTEN进行比较时；G129R（图。​（图11A类). 相反，重新引入编码肿瘤抑制蛋白pRB或VHL的质粒[在786-O细胞中有缺陷(30)]或双特异性磷酸酶cdc25C未能诱导G1在这些细胞中的阻滞（图。​（图11A类和数据未显示）。在保留内源性PTEN蛋白的两个细胞系（SAOS-2和ACHN）中产生HA-PTEN并没有改变这些细胞的细胞周期分布（图。​（图11 B–D） 但是，作为pRB缺失的SAOS-2细胞中的阳性对照，重新引入编码pRB的质粒确实影响了G1制动（图。​（图11B类). 在相同的实验条件下，786-O细胞PTEN蛋白的产生并没有导致携带亚2N个DNA含量，表明PTEN没有诱导这些细胞凋亡（表​（表1）。1). 因此，PTEN特异性地诱导了G1786-O细胞中缺乏PTEN。

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PTEN诱导G1块。(A类)PTEN（而非pVHL或cdc25C）诱导G1阻断786-O细胞。将786-O细胞与编码CD19（pCD19）的质粒以及编码所示蛋白的质粒瞬时共转染。转染后40小时，固定细胞，通过荧光激活细胞分选分析确定成功转染细胞的细胞周期分布。给出了两个实验的平均值和扫描电镜。(B类)PTEN不会改变SAOS-2（RB−/−）细胞的细胞周期轮廓。将pCD19和编码所示蛋白的质粒瞬时转染SAOS-2细胞，并按图所示进行分析。​图22A类给出了两个实验的平均值和SEM。(C类)PTEN不会改变ACHN细胞的细胞周期分布。用pCD19或编码所示蛋白的质粒瞬时转染ACHN细胞，并按A类给出了两个实验的平均值和SEM。(D类)免疫印迹检测786-O、SAOS-2和ACHN细胞中PTEN蛋白。使用C54抗PTEN抗血清通过免疫印迹分析所示细胞系的蛋白提取物来检测PTEN。

表1

含有亚2的CD19+786-O细胞百分比N个DNA含量

支出。矢量PTEN；重量PTEN；G129R号
14.65.15.8
22.41.51.4
三11.31

用pCD19和指示的pSGL-HA表达质粒瞬时转染786-O细胞。36小时后，收集细胞并进行处理，如图所示。​图11答：。 

肿瘤衍生突变体灭活PTEN磷酸酶活性和细胞周期控制。

据报道，许多肿瘤衍生PTEN突变位于预测的磷酸酶和张力蛋白-辅助蛋白同源域之外。三种肿瘤衍生突变体，PTEN；1–274，私人；1–336和PTEN；对Δ274–342进行了测试，发现其在细胞周期分析中存在缺陷（图。​（图22A类). PTEN除外；1–274，这些突变蛋白的产生水平与786-O细胞中野生型PTEN的水平相似（图。​（图22B类). PTEN具有两种生化特性。PTEN可以使某些含有磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸的蛋白质底物去磷酸化(33). 此外，PTEN可以使PtdIns-3,4,5-P脱磷酸三(23). 接下来，我们询问这三个肿瘤衍生突变体是否在这两种功能中都有缺陷。当作为GST融合蛋白产生时，所有三种突变蛋白都有缺陷，无法催化任何一种33P标记的聚（Glu4-提尔1)基质或[三H] 1,3,4,5-四磷酸肌醇([三H] IP（IP）4)（图。​（图22 C类和D类).

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PTEN的底物捕获变体诱导G1但肿瘤衍生突变体没有。(A类)细胞周期分析中PTEN野生型、底物标记和C末端突变形式的比较。将786-O细胞与pCD19和编码所示蛋白的质粒共转染，并按图所示进行分析。​图11A类. (B类)PTEN蛋白在786-O细胞中的表达。用编码所示蛋白的质粒转染786-O细胞。转染后40小时，用凝胶电泳分离代谢标记细胞制备的蛋白提取物的抗HA免疫沉淀，并进行荧光成像。(C类)GST-PTEN和突变衍生物的肌醇磷酸酶活性。所示GST-PTEN融合蛋白用于去磷酸化[三H] IP（IP）4. (D类)GST-PTEN和突变衍生物的蛋白酪氨酸磷酸酶活性。所示GST-PTEN融合蛋白用于去磷酸化33P标记的聚（Glu4-提尔1)共聚物。(A类,C类、和D类)给出了两个实验的平均值和扫描电镜。

创建了两种催化惰性PTEN变体（PTEN；C124S和PTEN；D92A）。其他磷酸酶中相应残基的突变会导致酶活性的丧失，但可以保留底物结合，被称为“底物捕获”(34). 如预测和先前公布的那样(22,23)，PTEN底物捕获突变体缺乏催化活性（图。​（图22 C类和D类和数据未显示）。尽管如此，PTEN和；C124S和PTEN；D92A保留了部分诱导细胞在G中积聚的能力1（图。​（图22A类和数据未显示）。这些数据表明磷酸化底物的隔离可能足以抑制PTEN的细胞周期。PTEN；C124S可诱导PtdIns-3,4,5-P的积累三在细胞中，这表明可能与该底物有稳定的结合(23). 另一方面，C124S突变体在调节细胞运动方面有缺陷(26). 因此，这些数据增加了PTEN诱导G1阻滞与细胞运动控制不同，提示PTEN与PtdIns底物相互作用的能力与细胞在G1.

蛋白磷酸酶活性不足以诱导G1通过PTEN阻止。

接下来，我们将G129R突变体与第二个受相同密码子影响的突变体（G129E）进行了比较。G129E由PTEN公司在生殖系中发现的等位基因PTEN公司两个CD患者家族的基因(35). 其他人发现PTEN的蛋白磷酸酶活性；G129E相当于野生型蛋白质(22)以及PTEN；G129E在抑制细胞扩散的能力方面与野生型PTEN相当(26). 事实上，在我们的分析中，我们同样可以看到蛋白磷酸酶活性的保留（图。​（图3三D类). 在五种GST-PTEN制剂中；G129E，活性在野生型活性的30%至70%之间变化（图。​（图3三D类和数据未显示）。然而，当在786-O细胞中产生时，这种PTEN突变并没有诱导G1块（图。​（图3三A类). 因此，G129E和G129R都未能诱导G1尽管前者保留了蛋白磷酸酶活性（图。​（图3三D类). 接下来，我们询问G129E突变体在去磷酸化过程中是否有缺陷[三H] IP（IP）4，作为脂磷酸酶活性的测量。的确，尽管PTEN；WT催化了[三H] IP（IP）4，G129R和G129E在该测定中都没有可测量的活性（图。​（图3三C类). 因此，PTEN诱导细胞周期阻滞的能力与其去磷酸化脂类底物的能力以及蛋白磷酸酶活性的保存（如所测）密切相关在体外，不足以诱导G1块。

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CD突变株G129E保留蛋白磷酸酶活性，但缺乏肌醇磷酸酶活性并且不能诱导G1块。(A类)细胞周期分析中野生型PTEN与突变体G129R和G129E的比较。将786-O细胞与pCD19和编码所示蛋白的质粒共转染，并按图所示进行分析。​图11A类. (B类)野生型PTEN和突变体G129R和G129E在786-O细胞中的表达比较。用编码所示蛋白的质粒转染786-O细胞。由代谢标记细胞制备的蛋白提取物的抗-HA免疫沉淀物通过凝胶电泳分离并进行荧光成像。(C类)GST-PTEN和突变衍生物的肌醇磷酸酶活性。所示GST-PTEN融合蛋白的分析如图所示。​图22C类. (D类)GST-PTEN和突变衍生物的蛋白酪氨酸磷酸酶活性。所示GST-PTEN融合蛋白的分析如图所示。​图22D类. (A类,C类、和D类)给出了两个实验的平均值和扫描电镜。

Akt位于PTEN下游。

因此，我们的数据表明，PTEN调节细胞周期进展的能力取决于其去磷酸化PtdIns-3,4,5-P的能力三并提出磷脂酰肌醇3-激酶下游靶点的调控可能对PTEN介导的细胞周期控制至关重要。其中一个效应器是原癌基因的蛋白质产物AKT公司我们接下来试图确定PTEN是否可能下调Akt激酶活性。用空载体质粒或编码标记Akt的T7表位的质粒以及编码HA-PTEN或PTEN的骨干载体质粒瞬时转染U2-OS细胞；G129E。通过抗T7免疫沉淀法回收Akt，并在存在[γ]的情况下用于磷酸化多肽底物-32P] ATP。PTEN有效下调Akt激酶活性，而PTEN；G129E没有（图。​（图44 A类和B类). 在缺乏PTEN蛋白的786-O细胞中进行此实验时获得了相同的结果（数据未显示）。因此，PTEN可以负性调节Akt激酶活性。

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PTEN抑制Akt激酶活性，Akt活化形式可以覆盖PTEN诱导的G1块。(A类)野生型PTEN对Akt激酶的抑制作用。用编码所示蛋白的质粒转染U2-OS细胞。转染后，制备抗T7免疫沉淀并用于磷酸化GST肽底物在体外.放射自显影术(上部)和抗T7免疫印迹(下部)所示为相同膜的。黑色箭头表示基板的位置。结果代表了两个实验。(B类)定量32P并入A类使用磷化氢成像仪。(C类)Myr-Akt覆盖PTEN诱导的G1块。将786-O细胞与pCD19和编码PTEN的质粒与空载体（pLNCX）或编码所示Akt蛋白的质粒瞬时共转染。转染后，如图所示对细胞进行分析。​图11A类给出了两个实验的平均值和SEM。

接下来，我们询问Akt或肉豆蔻酰化形式的Akt是否可以覆盖PTEN诱导的G1块。用pCD19和编码空载体或野生型PTEN的质粒以及编码Akt或指示衍生物的空pLNCX载体或pLNCX质粒瞬时转染786-O细胞。虽然野生型Akt对PTEN诱导的G1block，Akt的一种肉豆蔻酰化形式，独立于PtdIns-3,4,5-P靶向膜三克服了PTEN阻塞。相反，激酶激活型Akt和Myr-Akt都无法覆盖PTEN（图。​（图44C类). PTEN水平因Akt或所示衍生物的过量产生而保持不变（数据未显示）。这些数据表明，PTEN介导的细胞周期抑制依赖于磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路的负调控。

如果Akt是PTEN抑癌功能的关键下游靶点，那么缺乏PTEN蛋白的肿瘤或细胞株可能会具有较高水平的Akt激酶活性。作为内源性Akt活性的测量，我们用Akt上磷酸化-Ser-473特异性抗体对细胞提取物进行免疫印迹。Akt激酶活性需要该残基与Thr-308的磷酸化(36). 在血清剥夺后或在血清刺激90分钟后制备来自PTEN+或PTEN-−细胞组的复制板的蛋白质提取物，并用磷酸特异性抗体进行免疫印迹。通过免疫印迹、ACHN、DU145和U2-OS（图。​（图11D类和未显示的数据）被发现几乎没有磷酸化Akt（图。​（图55 上部). 相反，缺乏PTEN蛋白、786-O、LNCaP和PC-3的细胞（图。​（图11D类和未显示的数据），增加了磷酸化Akt的水平，但不受血清撤药的下调（图。​（图55 上部). 这些细胞中Akt-1总蛋白的水平具有可比性（图。​（图55 下部). 因此，在这些肿瘤细胞系中PTEN的丢失与Akt磷酸化形式的放松调控特别相关。

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缺乏PTEN蛋白的细胞含有高水平的Akt，在Ser-473上磷酸化。所示细胞系被重复剥夺血清24小时。每组取一个p100板，用含有10%胎牛血清的新鲜培养基重复培养90分钟，然后制备蛋白质提取物，并用针对Akt磷酸化-Ser-473的抗体进行免疫印迹分析(上部)或独立于磷酸化状态识别Akt的抗体(下部).

讨论

PTEN再导入786-O细胞导致G细胞中细胞比例增加1。这是否表示G中的块1或G的延长1等待进一步研究。迄今为止，我们检测到的每个人类PTEN突变在这个细胞周期分析中都有缺陷。因此，很明显G1阻滞反映了PTEN的一种关键功能，该功能与其作为肿瘤抑制蛋白的功能密切相关。

PTEN可能通过哪些潜在机制通过G来控制进展1? 首先，这种功能似乎与PTEN介导的抑制细胞扩散和细胞运动的作用截然不同。在含有内源性PTEN的细胞中观察到PTEN对细胞运动和粘附的抑制，仅在生长在纤维连接蛋白基质上的细胞中才观察到，在PTEN中未观察到；C124S突变体。相反，PTEN过度表达诱导了G1在多聚物涂层上的细胞中，可以诱导缺乏PTEN蛋白但不产生PTEN蛋白的细胞发生阻滞-(我-赖氨酸）涂层板，并部分由C124S突变体诱导。最后，PTEN；G129E清楚地分离了这两种功能，因为与野生型蛋白相比，这种突变体抑制细胞传播(26)但无法阻止G中的786-O细胞1（图。​（图3）。三). 因此，这些数据表明细胞周期轮廓的改变不是细胞粘附抑制的间接结果。此外，PTEN；G129E保留蛋白磷酸酶活性，并能负性调节细胞扩散，但与CD的发展有关，这表明这些功能不足以抑制CD表型。另一方面，PTEN；G129E在细胞周期分析中有缺陷。因此，这种生物检测可能表明PTEN与关键生理底物的相互作用，对其进行调控可能对预防CD的发病至关重要。事实上，这种突变在催化细胞脱磷酸化方面存在缺陷[三H] IP（IP）4,暗示着体内PtdIns-3,4,5-P的去磷酸化三是PTEN介导的CD抑制的关键要求。最近两组报道了类似的结果(37,38). 因此，我们认为CD的发生与PTEN脂质磷酸酶活性的丧失以及随后细胞周期的放松调控有关。

为了支持这个观点，只有一只完整的老鼠PTEN公司等位基因发展成一种与CD相似的综合征，其表型特征是皮肤、胃肠道和前列腺增生和异型增生(27). 值得注意的是，在前列腺PTEN公司+/−小鼠Ki-67染色和有丝分裂指数均表明，与野生型小鼠相比，正在增殖的细胞比例显著增加。这些数据表明，PTEN缺失改变了小鼠前列腺上皮细胞的细胞周期分布(27). 此外，与野生型胚胎相比，在第7.5-8.5天PTEN突变胚胎中发现溴脱氧尿苷掺入广泛增加(39). 最后，PTEN介导的生长抑制最近与G1胶质母细胞瘤细胞系中细胞凋亡的抑制而非诱导(37).

因此，我们的数据和描述PTEN增殖异常的数据+/−小鼠表明PTEN在细胞周期控制中发挥作用。这一功能反过来似乎需要脂类磷酸酶活性。这些数据让我们怀疑Akt是否是PtdIns-3,4,5-P激活的磷脂酰肌醇3-激酶的已知下游靶点三，可能作用于PTEN下游。首先，我们发现PTEN的野生型而不是G129E突变体可以抑制Akt激酶活性，这再次表明PTEN蛋白磷酸酶活性不足以抑制Akt。接下来我们问Akt是否可以覆盖PTEN介导的细胞周期阻滞。符合PTEN在限制PtdIns-3,4,5-P可用性方面的作用三，野生型Akt在本试验中无效，而肉豆蔻酰化型Akt的表达导致PTEN细胞周期阻滞被覆盖。这些数据支持Akt是PTEN监管的重要下游目标的观点。通过研究PTEN丢失对小鼠成纤维细胞的影响，也得出了类似的结论(39).

磷脂酰肌醇3-激酶的诱导表达可以在无血清的情况下诱导DNA合成，因此足以启动这一过程(40). Akt和磷脂酰肌醇3-激酶可以激活一些下游靶点，这些靶点可能参与调节细胞增殖(41). 核糖体蛋白p7060万调节被认为对细胞周期进展和p70失活很重要的信使核糖核酸亚群的翻译增加60万功能导致G细胞停滞1(42,43). 同样，Akt可以诱导4E-BP1磷酸化，这一事件导致4E-BPl从真核生物起始因子eIF4E中分离，并随后“去抑制”翻译(44). eIF4E在过度生产时转化NIH 3T3细胞，因此，与Akt一样，是一个有吸引力的肿瘤抑制靶点(45). 磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径中的哪些成分是s期进入的速率限制因素尚不清楚。

Akt也是细胞生存信号通路的重要组成部分，在这种能力下可以磷酸化和灭活Bcl-2家族成员BAD，使其无法阻断Bcl-2或Bcl-XL（左）活动(41,46,47). 最近的数据表明，PTEN−/−细胞对凋亡刺激具有抵抗力，并且在PTEN缺乏的成纤维细胞中Akt的调节异常(39). 到目前为止，我们还没有发现PTEN重新引入786-O细胞后凋亡增加（表​（表1）。1). 在许多可能性中，这些数据可能表明该细胞系中存在额外的失活突变，使其无法对多种凋亡信号作出反应。最后，磷脂酰肌醇3-激酶活性的增加并不能统一地防止细胞凋亡。在某些情况下，磷脂酰肌醇3-激酶活性可以诱导细胞周期进展，事实上，可以促进细胞凋亡(40)（R.Narsimhan和T.M.R.，未公布数据）。PTEN可以调节细胞周期和细胞生存功能的概念与p53的抑癌功能惊人地相似。因此，PTEN和p53一样，可能起到协调这些活动的作用，尽管可能对不同的信号集作出反应(48).

如果Akt是PTEN的关键下游靶点，那么缺乏PTEN的肿瘤细胞可能会藏匿过多的Akt活性。PTEN−或PTEN+细胞蛋白提取物的免疫印迹（图。​（图11D类发现Ser-473磷酸化的Akt数量显著增加（图。​（图5）。5). PTEN和激活的Akt之间的这种负相关再次证明了PTEN在肿瘤Akt调节中的作用。在这方面，Akt显性阴性形式对Akt活性的抑制阻断了小鼠髓系细胞的BCR-ABL转化，反义Akt2的稳定表达降低了已知已扩增Akt的胰腺癌细胞系的致瘤性(49,50). 因此，在这些环境中对Akt家族成员的抑制确实证明了抗肿瘤活性。活化的Akt对PTEN阴性肿瘤的转化表型是否必要是一个关键问题。尽管如此，我们的数据增加了PTEN阴性肿瘤作为癌症治疗策略可能易受Akt抑制的可能性。

致谢

我们感谢威廉·凯林、彼得·亚当斯、马克·埃文、迈尔斯·布朗、科内莉亚·波利亚克和大卫·利文斯顿进行了数小时的深入讨论，并批判性地阅读了这份手稿。这项工作得到了美国陆军传染病医学研究所前列腺癌研究项目PC970221和Claudia–Adams Barr项目（W.R.S）的支持。

缩写

IP（IP）4,肌醇13,4,5-四磷酸
铂族锡磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸
光盘考登氏病
哈血凝素
消费税谷胱甘肽S公司-转移酶

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