小鼠肝脏发育过程中肝星状细胞、内皮下细胞和血管周间充质细胞的间充质起源

X-gal染色和荧光免疫组织化学

用4%多聚甲醛固定整个胚胎，并用1%X-gal溶液在37°C下染色4小时。¹³为了检测切片中的lacZ活性，将冰冻切片（7µm）在上述X-gal溶液中培养，并用曙红Y（西格玛，密苏里州圣路易斯）进行反染色。

为了进行免疫染色，用含有0.1%Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（PBS）渗透冰冻切片。用PBS冲洗后，用0.2%牛血清白蛋白和5%与二级抗体来源相同的血清封闭切片30分钟。阻断后，将切片与稀释的一级抗体孵育1小时。免疫染色中使用的主要抗体列于表1为了进行双重免疫染色，用PBS清洗切片，并用一级抗体孵育1小时。用PBS清洗后，用与AlexaFluor 488、555或568（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）结合的二级抗体培养切片30分钟。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen）固定切片，并在显微镜下观察荧光图像（尼康Eclipse 90i；尼康，日本东京）。为了评估增殖活性，我们从三个不同的胚胎中制备了冷冻切片，并用Ki-67和活化的白细胞粘附分子（ALCAM）进行了双重免疫染色。染色后，共拍摄了55张照片，Ki-67⁺细胞计数。

LacZ的FACS分析⁺肝细胞

E12.5肝脏在37°C下在含有0.2 U/mL Dispase I（罗氏应用科学）的Dulbecco改良Eagle培养基中消化20分钟。¹⁶为了检测肝细胞中的lacZ活性，我们通过低渗休克将荧光素二-β-D-半乳糖苷（FDG，Invitrogen）加载到肝细胞中，如前所述。¹⁷使用5µM碘化丙啶检测死细胞。对于FACS分析，使用FACS Vantage SE（加利福尼亚州圣何塞Becton Dickinson）分析细胞，并使用CellQuest Pro软件（Becton Dickinson，CA）处理数据。

使用抗体和磁珠进行细胞耗竭

lacZ⁺如前所述，FACS分选的细胞与抗体包裹的磁珠孵育。¹⁶简言之，5×10⁵用大鼠抗小鼠E-钙粘蛋白（ECCD-1；Takara Bio，Shiga，Japan）、F4/80、Flk1、CD45、TER-119（eBioscience，San Diego，CA）和CD31（BD Biosciences）抗体中的每一种包被珠粒（Dynabeads绵羊抗rat免疫球蛋白G；Invitrogen）。清洗后，将每个磁珠组合并与lacZ孵育⁺细胞在冰上放置30分钟。抗体⁺用磁粉浓缩器（Invitrogen）将细胞耗尽。

定量聚合酶链反应

使用RNAqueous Micro（德克萨斯州奥斯汀Ambion）提取总RNA。使用SuperScript III和Oligo（dT）从30 ng总RNA合成互补DNA₂₀引物（Invitrogen）。如前所述，在M×3000P qPCR系统（Stratagene，La Jolla，CA）中使用SYBR Green PCR主混合液（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行定量聚合酶链反应（qPCR）。⁵引物列于表2.

微阵列分析技术

从E12.5肝细胞和lacZ制备的每个60 ng总RNA中⁺抗体⁻我们使用Ovation RNA扩增系统V2（加利福尼亚州圣卡洛斯NuGen）获得了26µg和18µg cDNA。然后，使用FL-Ovation cDNA生物素模块V2（NuGen）对每个cDNA中的3.75µg进行片段化，并用生物素标记。标记探针与GeneChip Mouse Genome 430 2.0阵列（Affymetrix，Santa Clara，CA）杂交，并在USC/CHLA基因组核心实验室分析信号。

LacZ在肝间充质细胞中的表达

我们确定了lacZ是否⁺通过E12.5胚胎的免疫染色，肝间充质细胞表达结蛋白或α-SMA。Desmin在胎儿HSC、血管周围间质细胞和间皮下的间质细胞中表达(图2A). 几乎所有desmin⁺表达lacZ的细胞(图2A-D). lacZ⁺覆盖中叶的扁平细胞层弱表达结蛋白(图2D). 许多血管周围间充质细胞表达α-SMA(图2E、G)和共表达结蛋白和lacZ(图2F、H). 血管附近有罕见的结蛋白⁺α-SMA⁺HSC，占结蛋白的3.7%⁺高速列车(图2E、F，箭头）。lacZ⁺间皮下的间充质细胞α-SMA阴性(图2I，J). Flk1和CD31、SECs标记物、F4/80、Kupffer细胞标记物、E-cadherin和白蛋白、成肝细胞标记物的表达没有与lacZ共定位⁺E12.5中的染色(图2K–O)和E13.5肝脏（数据未显示）。这些数据表明desmin⁺包括胎儿HSC、血管周围间充质细胞和间皮下的间充质干细胞在内的细胞表达Msx2信使RNA，而lacZ的表达是该模型中这三个胎肝间充质红细胞群体的合适标记。

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图2

发育中肝脏间充质细胞中LacZ的表达。在从E12.5 Msx2 lacZ胚胎制备的冷冻切片上进行双重免疫染色。（A，B）检测肝脏表面的结蛋白（绿色）和lacZ（红色）。HSC（箭头）、血管周围间充质细胞（双箭头）和间皮下的间充质电池（箭头）共同表达结蛋白和lacZ。（C） （A）和（B）的合并图像。（D） 肝脏颅骨区结蛋白（绿色）和lacZ（红色）双重染色。结蛋白和lacZ在HSC（箭头）和扁平细胞层（箭头）中共存。PC，心包腔。（E–J）α-SMA（绿色）和结蛋白或lacZ（红色）的双重染色。（E，F）许多α-SMA⁺血管周围间充质细胞与结蛋白（箭头）共存。双箭头表示α-SMA⁻结蛋白中的细胞⁺血管周围间充质细胞。血管附近有罕见的结蛋白⁺α-SMA⁺HSC（箭头）。484结蛋白⁺3.7%的HSC与α-SMA共存。（G，H）α-SMA⁺血管周围间充质细胞与lacZ（箭头）共存。双箭头表示α-SMA⁻lacZ中的单元格⁺血管周围间充质细胞。（I，J）Alpha-SMA⁻lacZ公司⁺间皮下的间充质细胞（箭头）。（K–O）lacZ（红色）和Flk1（K，绿色）、CD31（L，绿色）、F4/80（M，绿色）、E-钙粘蛋白（N，绿色）或白蛋白（O，绿色）的双重染色。lacZ（箭头）与这些标记（箭头）没有共存。（P） 同种型免疫球蛋白G.Nuclei的阴性对照染色用DAPI（蓝色）复染。棒材，25µm。

LacZ的分离⁺细胞

为了鉴定肝间充质细胞（包括胎儿HSC）的标记物，我们尝试分离lacZ⁺使用FDG通过FACS从Msx2-lacZ胎儿肝脏中提取细胞。图3A说明了胎肝间充质细胞的分离过程。当用E12.5 lacZ制备肝细胞时⁺用FDG孵育肝脏，2%至3%的细胞显示高FL1，这是由β-半乳糖苷酶将FDG水解为荧光素引起的（右图，图3B). 然而，从LacZ制备的细胞⁻肝脏也显示大约1%的FL1细胞，这似乎是由内源性β-半乳糖苷酶样活性引起的（左图，图3B). LacZ公司⁺从E12.5 lacZ分类的单元格⁺肝脏表达结蛋白信使RNA，尽管其他细胞标记物，包括白蛋白、CD31和CD68，也被检测到，因为不可避免的污染（数据未显示）。使用识别成肝细胞（E-钙粘蛋白）、SECs（CD31，Flk1）、库普弗细胞（F4/80）和血细胞（CD45，TER-119）的细胞表面标记物的抗体加上磁珠，我们耗尽这些细胞以进一步纯化lacZ⁺单元格(图3A). 从1.6×10⁷FDG处理的E12.5肝细胞，8.9×10⁴（0.6%）lacZ⁺和6.9×10⁶（43.1%）lacZ⁻细胞通过FACS获得。然后，LacZ⁺用珠子下拉的细胞（LacZ⁺抗体⁺)和其他剩余细胞（LacZ⁺抗体⁻)对细胞类型标记进行qPCR分析。这些数据与未经FACS和磁珠分离的分离肝细胞的数据进行了比较。如所示图3C、LacZ⁺抗体⁻表达结蛋白、Foxf1和Lhx2（HSC标记物）的细胞富集了部分，而LacZ⁺抗体⁺细胞表达其他肝细胞标志物。LacZ⁺抗体⁻细胞表达的lacZ和Msx2分别高出5倍和32倍，验证了富集效率，并证实了该群体对Msx2的内源性表达。

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图3

lacZ的分离⁺E12.5 Msx2-lacZ肝细胞和cDNA微阵列分析。（A） lacZ程序⁺肝间充质细胞分离。在消化E12.5肝脏后，用FDG和lacZ培养细胞⁻和lacZ⁺通过FACS对细胞进行分选。lacZ⁺将细胞与抗E-钙粘蛋白、CD31、Flk1、F4/80、CD45和TER-119的抗体进一步孵育。然后，人群呈阳性（lacZ⁺抗体⁺)和负值（lacZ⁺抗体⁻)获得了这些抗体。lacZ⁺抗体⁻对群体和肝细胞进行cDNA微阵列分析。（B） 用lacZ制备的FDG孵育E12.5肝细胞的FACS分析⁻（左）和lacZ⁺胚胎肝脏（右）。用碘化丙啶（PI，FL2）检测死细胞。在lacZ⁺肝细胞中，2.8%的细胞显示高FL1，这是由FDG水解为荧光素引起的（右）。（C） 肝细胞的定量PCR，lacZ⁻，lacZ⁺抗体⁺和lacZ⁺抗体⁻从E12.5肝脏分离的种群。结果表示为与肝细胞相比的相对表达（任意设置为1；红线）。采用3-磷酸甘油醛脱氢酶（Gapdh）和β-肌动蛋白作为内部对照。（D） cDNA微阵列和qPCR检测lacZ基因表达水平的比较⁺抗体⁻和肝细胞。qPCR的每个值是三次测量的平均值±标准偏差。

微阵列分析技术

隔离了lacZ⁺抗体⁻我们使用cDNA微阵列与总分离肝细胞进行比较，以检测其差异表达基因。在分析的45037个基因中，4793个在lacZ中的表达为5倍或更高⁺抗体⁻细胞比总肝细胞多。表3是一份上调基因的部分列表，其中包括先前报道的由HSC表达的基因。对其中一些基因进行了qPCR分析，以确认微阵列结果(图3D).

肝表面下上皮细胞的鉴定

qPCR证实的上调基因(图3D)我们选择CD抗原，包括活化的白细胞粘附分子（ALCAM/CD166）、p75NTR/CD271和血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα/CD140a），以及发育标记物，包括IV型胶原、足蛋白和WT1，用于E12.5肝脏的免疫组化分析。肝表面发现ALCAM染色(图4A). IV型胶原蛋白是基底层的标记物，沉积在肝脏表面的间皮细胞下方(图4B). 沿着肝背表面，间充质细胞被IV型胶原从间皮细胞中分离出来(图4B). 在间皮下的间充质细胞中发现ALCAM免疫染色(图4B，箭头）。ALCAM的表达与IV型胶原重叠，间皮细胞基底外侧也检测到ALCAM表达(图4B). ALCAM与结蛋白在中央叶表面的扁平细胞层中共同表达(图4C，箭头）。ALCAM公司⁺间皮细胞下的间充质细胞共同表达结蛋白(图4F，箭头），但不是α-SMA(图4D). 相反，胎儿HSC(图4C，F，箭头）和血管周围间充质细胞(图4E)ALCAM呈阴性。根据这些染色模式，我们定义了结蛋白⁺阿尔卡姆⁺与基底层IV型胶原相关的细胞称为“近中性层细胞”。靠近肝表面的结蛋白⁺阿尔卡姆⁺在距亚胚层细胞较近的薄壁组织（3-5层成肝细胞）中也发现了与基底层无关的细胞(图4F、G，双箭头），提示移行细胞从近地层细胞向内迁移。

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图4

发育中肝脏中下胚层细胞的鉴定。对E12.5 Msx2-lacZ肝脏进行免疫染色。（A） ALCAM免疫染色（红色）。ALCAM沿肝脏表面表达（箭头）。（B） 背部区域的ALCAM（红色）和IV型胶原（ColIV，绿色）染色。箭头表示ALCAM⁺上皮下细胞。箭头表示间皮细胞。（C） 颅骨区域的ALCAM（红色）和结蛋白（绿色）染色。箭头表示desmin⁺阿尔卡姆⁺扁平单元格。箭头表示desmin⁺阿尔卡姆⁻HSC。右心室。背部区域（D）和血管周围（E）的（D，E）ALCAM（红色）和α-SMA（绿色）染色。上皮下细胞表达ALCAM（箭头），但不表达α-SMA。血管周围间充质细胞表达α-SMA（箭头所示），但不表达ALCAM。（F，G）背部ALCAM（红色）和结蛋白（绿色）染色。箭头和箭头表示desmin⁺阿尔卡姆⁻HSC和结蛋白⁺阿尔卡姆⁺分别为近赤道细胞。双箭头表示desmin⁺阿尔卡姆⁺移行细胞远离肝脏表面。细胞核用DAPI（蓝色）复染。棒材，20µm。

足蛋白是肝间皮细胞的标记物

足蛋白仅在泛细胞角蛋白或WT1阳性的间皮细胞中表达，而在表达WT1的亚上皮细胞中没有表达(图5A、B). 平足蛋白⁺间皮细胞位于基底层正上方，表达IV型胶原(图5C)低于哪个结蛋白⁺存在亚低温细胞(图5D). 两种足蛋白的基底膜侧均可见ALCAM免疫染色⁺间皮细胞和足平面蛋白⁻亚等温细胞(图5E).

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图5

发育中肝脏间皮细胞的鉴定。对E12.5 Msx2-lacZ肝脏进行双重免疫染色。（A–D）检测背部区域的足蛋白（绿色）和泛细胞角蛋白（CK，红色）、WT1（红色）、IV型胶原（ColIV，红色）或结蛋白（红色）。箭头表示足蛋白⁺间皮细胞。箭头表示近地层细胞。（E） 背部的足蛋白（绿色）和ALCAM（红色）染色。箭头和箭头表示足虫蓝⁺间皮细胞与ALCAM⁺分别为近赤道细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。棒材，10µm。

发育中的小鼠肝脏中HSC、间皮下细胞、间皮细胞和血管周围间充质细胞的定义

p75NTR在结蛋白中表达⁺HSC、ALCAM⁺亚胚层细胞和α-SMA⁺血管周围间充质细胞(图6A–C). 在ALCAM中检测到PDGFRα表达⁺亚等温细胞(图6D). 根据这些表达模式和位置，我们将发育中的肝脏中的间充质细胞分为三类：肝实质中的HSC（结蛋白⁺第75页NTR⁺α形状记忆合金^+/−)，间皮下的近中性层细胞（结蛋白⁺第75页NTR⁺阿尔卡姆⁺PDGFRα⁺)血管周围的间充质细胞（结蛋白⁺第75页NTR⁺α-SMA⁺) (图6E). 间皮细胞可通过足蛋白识别。免疫组织化学分析表明，显示结蛋白的细胞⁺阿尔卡姆⁺亚上皮细胞表型是亚上皮细胞和HSC之间的过渡细胞，但与靠近肝表面的基底层无关。

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图6

亚等温细胞的特征。对E12.5 Msx2-lacZ肝脏进行双重免疫染色。（A–C）检测p75NTR和结蛋白、ALCAM或α-SMA。箭头表示desmin中的p75NTR表达⁺HSC（A）、ALCAM⁺亚胚层细胞（B）和α-SMA⁺血管周围间充质细胞（C）。间皮细胞对p75NTR（箭头）呈阴性。（D） PDGFRα（绿色）和ALCAM（红色）在背侧区域的表达。箭头表示PDGFRα⁺阿尔卡姆⁺近赤道细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（E） E12.5肝脏免疫染色总结。（F–I）E12.5肝脏中下胚层细胞、间皮细胞和过渡细胞的增殖活性。（F） Ki-67（红色）和ALCAM（绿色）染色的代表性合并图像。（G） （F）的单个DAPI图像。肝表面可见间皮细胞（白色圆圈）。在534个间皮细胞中，30.0%为Ki-67⁺（一） ●●●●。（H） （F）的ALCAM和DAPI图像。1506 ALCAM的⁺上皮下细胞（红圈），41.8%为Ki-67⁺（一） ●●●●。过渡细胞由ALCAM表达和不规则细胞核（白色方块）识别。在767个亚低温细胞中，22.8%为Ki-67⁺（一） ●●●●。棒材，10微米（A–D），20微米（F）。

上皮下细胞的增殖活性

我们通过Ki-67和ALCAM的双重免疫染色测定了亚上皮细胞、间皮细胞和过渡细胞的增殖活性(图6F). 在肝脏表面可以识别间皮细胞(图6G，I，白色圆圈），30.0%为Ki-67⁺相反，ALCAM的41.8%⁺近中性层细胞为Ki-67⁺(图6H，I，红色圆圈）。通过ALCAM表达和远离肝表面的不规则细胞核来鉴定过渡细胞(图6H，I，白色方块），22.8%为Ki-67⁺这些染色数据表明，与间皮细胞和移行细胞相比，胎肝中的亚上皮细胞正在积极分裂。

ALCAM的分化潜力⁺体外细胞

为了测试亚上皮细胞和间皮细胞的分化潜能，我们分离了ALCAM⁺细胞经FACS培养。血统耗尽后⁺血细胞、血统⁻用抗ALCAM抗体孵育群体。FACS分析显示了三个不同的群体：ALCAM^高的，阿尔卡姆^低的和ALCAM⁻在E12.5肝细胞中(图7A). 定量PCR显示ALCAM^低的人群高表达白蛋白(图7B)这意味着肝母细胞在免疫组织化学检测不到的水平上弱表达ALCAM(图4A)但可以通过qPCR检测到。相反，ALCAM^高的人群表达了与亚上皮细胞和间皮细胞相关的基因，但不表达白蛋白，表明这两种细胞类型成功富集(图7B). ALCAM公司^高的细胞高表达肝细胞生长因子（Hgf）和多肽，但不表达Gfap。

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图7

ALCAM的分离和培养⁺亚上皮细胞和间皮细胞。（A） 消化E12.5肝脏后，血细胞谱系⁺人口（林⁺)已耗尽。血统⁻人口（林⁻)与藻红蛋白标记的抗ALCAM（右）或同型对照（左）孵育，并通过FACS分析。ALCAM公司^高的、ALCAM^低的和ALCAM⁻对种群进行了分类。（B） E12.5肝脏各群体的定量PCR。结果表示为与肝细胞相比的相对表达（任意设置为1；红线）。（C） ALCAM的连接效率^高的、ALCAM^低的和ALCAM⁻人口。在FACS后，这三个群体被放置在24孔板上（1×10⁴细胞/孔）。培养后一天，从每个群体的四个独立的孔中随机拍摄20张照片，并估计附加的细胞数。（D） ALCAM的文化^高的第1天和第8天的种群在塑料盘上。细胞用α-SMA（绿色）或结蛋白（红色）和足蛋白（绿色）染色。箭头表示结蛋白和足蛋白共存的细胞。箭头和双箭头表示结蛋白⁺和足蛋白⁺细胞。（E） 培养ALCAM的定量PCR^高的人口。结果表示为与ALCAM相比的相对表达式^高的培养前人口（任意设置为1；红线）。在第1天和第8天，β-actin的表达增加，但Gapdh没有增加。在第1天和第8天培养的细胞中均未检测到Gfap表达。qPCR的每个值是三次测量的平均值±标准偏差。（F） 第5天ALCAM油红O染色^高的胶原蛋白凝胶或塑料盘上的细胞。棒材，50µm。

电镀后一天，ALCAM的13.9%^高的连接到塑料孔的电池(图7C)显示成纤维细胞形态，表达α-SMA、结蛋白或结蛋白和足平蛋白(图7D). 与培养前相比，培养1天后α-Sma信使RNA增加了393倍(图7E). 培养8天后，所有细胞均显示出表达α-SMA的肌纤维母细胞形态(图7D). 许多细胞被结蛋白染色（86%），其中49%的细胞表达足蛋白(图7D). 10%的细胞是足蛋白⁺结蛋白⁻定量PCR显示，在8天的培养中，α-Sma、结蛋白、足蛋白和β-actin保持高表达水平(图7E). 相反，p75ntr、Pdgfrα、Hgf、多肽、Lhx2和Hlx在8天的细胞中表达下调(图7E). 培养细胞中未发现Gfap表达。这些结果表明，ALCAM^高的在体外，近中性层细胞和间皮细胞迅速获得肌纤维母细胞表型。相反，只有1.3%的ALCAM^低的塑料井附着人口(图7C)第8天，这些附着细胞显示成纤维细胞形态，表达α-SMA（数据未显示）。ALCAM公司⁻人口没有附着在井上(图7C).

接下来，我们测试了ALCAM是否^高的人群有储存脂质的能力在体外与HSC一样。ALCAM^高的细胞在塑料孔或胶原凝胶中培养4天，然后与视黄醇和棕榈酸孵育24小时。油红O染色显示45%的细胞在胶原凝胶中有脂质沉积(图7F)，但在塑料培养皿上培养的细胞中未发现染色，尽管进行了相同的处理(图7F). 这些结果表明，ALCAM^高的在三维胶原培养中，群体可能获得HSC的表型特征。

由国家酒精滥用和酒精中毒研究所和退伍军人事务部医学研究服务提供的R24-AA12885（非实质性肝细胞核心）和P50-AA1199（南加州ALPD和肝硬化研究中心）资助。

我们感谢王娇红、杨梅丽莎和渡边优助提出的有益建议。