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生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。作者手稿；PMC 2010年2月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2009年2月；482（1-2）：104–111。
2008年11月11日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.abb.2008.11.004
预防性维修识别码：PMC2672568型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院100265
PMID：19022218

PKCε在急性乙醇诱导脂肪变性中起因果作用

J.菲利普·凯泽,一 朱利安·贝尔,一 Jun Zhang（张军）,b条 J.大卫·霍克,c（c） 克劳迪娅·冯·蒙福特,一 郭路平（Luping Guo）,一 郑玉亭,c（c） 布雷特·莫尼亚,d日 阿鲁尼·巴特纳加,a、，c（c）和加文·E·阿特尔a、，e（电子）
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

脂肪变性是酒精性肝病（ALD）病理学的关键阶段，预防脂肪变性可以预防ALD的晚期。在实验性非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中，PKCε与肝脂肪变性有关；然而，PKCε在乙醇诱导脂肪变性中的作用尚未确定。因此，本研究的目的是验证PKCε参与乙醇诱导脂肪变性的假设。因此，在PKCε基因敲除小鼠和接受反义寡核苷酸（ASO）敲除PKCε的野生型小鼠中，测定了急性乙醇对肝脏脂肪变性指数和胰岛素信号转导的影响。急性乙醇（6 g/kg i.g.）导致肝脏非酯化游离脂肪酸（NEFA）显著增加，在乙醇暴露1小时后达到峰值。NEFA增加后，二酰甘油（DAG）升高，PKCε随之活化。急性乙醇还改变了胰岛素反应基因的表达（即G6Pase增加，GK下调），这表明胰岛素信号受损。急性乙醇暴露随后导致肝甘油三酯急剧增加。乙醇引起的甘油三酯积累在ASO处理或PKCε中被钝化−/−老鼠。总之，这些数据表明，肝脏乙醇代谢引起的NEFA增加通过三酰甘油途径导致DAG产生增加。DAG随后激活PKCε，从而通过诱导胰岛素抵抗加剧肝脏脂质积聚。这些数据还表明，PKCε至少在乙醇诱导的肝损伤的早期阶段起着因果作用。

简介

酒精性肝病是世界上主要的死亡原因之一[1]每年影响数百万人。据估计，从1985年到1992年，仅在美国，就有1480多亿美元用于治疗ALD患者[2]。然而，由于对ALD的潜在机制了解不足，目前仍没有FDA批准的治疗方法来预防或逆转这种毁灭性疾病的进展。必须阐明导致ALD的分子机制，以确定有效的治疗方法来阻止或逆转与ALD相关的病理变化。

与ALD相关的第一个组织学改变是肝脂肪变性。虽然脂肪变性曾被认为是ALD的一种惰性病理，但最近的证据表明，钝化或阻断脂肪变性有助于防止ALD的进展[三–5]。长期以来，酒精代谢直接导致该药物引起的肝脂肪变性[6]。具体而言，酒精代谢增加了NADH:NAD+的比率，随后抑制肝细胞对脂肪酸的β-氧化。酒精代谢也会增加脂肪酸的酯化速率[7]。这些由乙醇代谢引起的脂肪酸流量变化随后导致肝甘油三酯积聚。然而，以前的研究表明，其他因素可能会导致乙醇引起的脂肪变性。具体地说，许多药物和基因改变（例如敲除小鼠）已被证明可以在暴露于酒精的啮齿动物模型中阻止肝脏脂肪变性；例如，缺乏促氧化酶（如NADPH氧化酶和iNOS）的小鼠[8,9]或LPS结合/信号分子（如CD14、TLR4和LBP），与野生型相比，它们对酒精的反应较少[10–12]。然而，在先前的研究中，这些防止脂肪变性的药理学/基因改变对酒精代谢没有明显影响。因此，酒精代谢可能不是乙醇诱导脂肪变性的唯一原因。

乙醇可能导致脂肪变性的另一种机制是通过诱导肝脏胰岛素抵抗。据报道，在动物模型中，慢性和急性乙醇暴露均会导致肝脏胰岛素抵抗[13]。胰岛素信号受损对肝脏脂质积聚的影响已有大量文献报道，尤其是在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD；参见[14]供审查）。虽然特征不太明确，但在酒精诱导的肝病中，胰岛素抵抗可能会对脂质代谢产生类似的影响。此外，胰岛素抵抗是人类ALD发展的已知危险因素[15]。该小组最近的研究表明，胰岛素敏感药物二甲双胍可以阻断乙醇暴露引起的脂肪肝，支持胰岛素抵抗与酒精暴露后肝脂肪变性之间的联系[16].

乙醇引起肝胰岛素抵抗和随后脂肪变性的一种可能机制是通过激活蛋白激酶Cε（PKCε）[14]。据推测，PKCε抑制胰岛素受体底物-2（IRS-2）的酪氨酸磷酸化，从而损害肝脏胰岛素信号[14]。最近研究表明，PKCε的激活在实验性NAFLD的肝脏胰岛素抵抗中起着因果作用[17]这表明该激酶的激活有助于人类疾病中的脂肪变性。在这里，使用急性小鼠模型，验证了乙醇暴露激活PKCε的假设，以及PKC-ε也有助于酒精引起的肝脂肪变性。

材料和方法

动物和治疗

小鼠被安置在实验室动物护理评估和认证协会认可的无病原体屏障设施中，程序得到路易斯维尔大学动物护理和使用委员会的批准。六周龄C57BL/6J小鼠取自杰克森实验室（马里兰州巴尔港）。PKCε基因敲除小鼠是Aruni Bhatnagar博士（路易斯维尔大学）实验室慷慨赠送的礼物。本研究中使用的所有敲除小鼠都是通过129SvJaexC57BL/6杂交PKCε+/−如前所述的小鼠[18]。在实验之前，食物和自来水是随意的。

将一团乙醇（6 g/kg）作为20%的盐水溶液灌胃给小鼠[16]。以等热量/等体积麦芽糖糊精作为对照。使用该剂量，血液中的乙醇水平达到约250–300 mg/dL；虽然动物有共济失调，但它们没有失去意识，也没有因饮酒过量而死亡。一些小鼠接受PKCε反义寡核苷酸（ASO）。PKCεASO（序列：5′-CTCGCAGATTTGATCTTAA-3′）是由Brett Monia博士（Isis Pharmaceuticals Inc）赠送的一份礼物。ASO的注射方法与Samuel等人[19]但对老鼠的使用进行了轻微修改。具体地说，小鼠每周两次接受25 mg/kg（i.p.）剂量的PKCεASO或载体盐水，持续四周。乙醇灌胃后0-12小时处死小鼠。用氯胺酮/甲苯噻嗪（100/15 mg/kg，i.m.）麻醉动物，并在献祭前从腔静脉采集血液。柠檬酸化血浆在−80°C下保存，直至进一步分析。使用从ALPCO Diagnostics（新罕布什尔州塞勒姆）购买的ELISA试剂盒定量血浆胰岛素。血浆葡萄糖水平由BioAssay Systems（加利福尼亚州海沃德）的葡萄糖检测试剂盒测定。部分肝组织立即在液氮中冷冻，而其他肝组织则冷冻在OCT安装介质（tissue Tek，Hatfield，PA）中，以便随后进行切片并安装在显微镜载玻片上。

免疫印迹

PKCε的Western印迹如前所述[20]。具体而言，使用含有蛋白酶抑制剂的分离缓冲液[50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM EGTA和50 mMβ-巯基乙醇]从snap冷冻肝脏样品中分离出总肝蛋白（罗氏，彭茨堡，德国）。匀浆在100×G下离心以去除未破碎的细胞。然后将上清液在10万×G的温度下在4°C下离心1h。产生的上清液代表细胞溶质部分。为了溶解颗粒，将颗粒重新悬浮在含有0.1%NP-40的隔离缓冲液中，并在冰上培养30分钟，然后进行短暂的超声波处理。用于蛋白质提取的所有缓冲液均含有蛋白酶、酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂鸡尾酒（西格玛，密苏里州圣路易斯）。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离相应的裂解产物（100μg蛋白质/孔）。然后，使用半干式电子吸墨仪将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上（新泽西州皮斯卡塔韦市阿默沙姆）。用PKCε抗体（加利福尼亚州圣何塞BD转导实验室）和ECL plus试剂盒（新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Biosciences）显示的条带对所得印迹进行检测。为确保负载均匀，所有印迹均用蓬松红染色。

脂质测定

对于肝脏脂质染色，用油红O（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）对肝脏冰冻切片（10μm）染色10 min，清洗，并用苏木精反染色45 s。为了测定肝甘油三酯和NEFA，将小鼠肝脏在2×磷酸盐缓冲盐水中均质。用甲醇：氯仿（1:2）提取组织脂质，在蒸发离心机中干燥，并在5%无脂牛血清白蛋白中重新悬浮。按照Bergheim等人[16]。使用标准试剂盒（德国彭茨堡罗氏）对非酯化脂肪酸（NEFA）进行比色评估。根据Bradford分析（加利福尼亚州Hercules Bio-Rad实验室）测定的结果，提取前将数值归一化为匀浆中的蛋白质。为了测定肝脏DAG水平，用氯仿和甲醇的水溶液提取肝脏脂质，如Bligh和Dyer所述[21]。按照Callender等人[22]。具体而言，DAG通过硅胶柱色谱和65:35:0.7 CHCl从磷脂中分离三：瑞士三哦：嗯2O作为洗脱缓冲液。在使用之前，用玻璃棉塞住每个柱，并用6厘米硅胶填充，并用10毫升洗脱液平衡。为了回收DAG，收集前2 ml洗脱液并在真空中干燥，然后重悬于120μl 9:1 CH中三OH：氯甲烷三含5μl 100 mM CH三首席运营官。为了评估分离过程中DAG的回收率，所有肝脏提取物均加入100摩尔已知DAG标准（DAG 28:0）。然后，在配备哈佛仪器注射泵的微质量ZMD上，以10μl/min的输液速度，在m/z 20至2000范围内的正电离模式下，对样品进行电喷雾电离质谱分析。钠+加合物用于检测单个DAG物种。通过与先前确定的标准进行比较，对选择的峰进行量化，然后通过ESI/MS/MS进行碎片鉴定。

RNA分离和实时RT-PCR

实时逆转录酶PCR检测选择基因的信息水平，这在该组是常规的[9,16,23]。通过基于硫氰酸胍的方法（德克萨斯州奥斯汀Tel-Test）从肝组织样品中提取总RNA。分光光度法测定RNA浓度，并使用AMV逆转录酶试剂盒（Promega，Madison，WI）和随机引物逆转录1μg总RNA。使用Primer 3（马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所）设计引物；看见表I或作为试剂盒从Applied Biosystems购买（加利福尼亚州福斯特市；PKCε）。采用比较CT法测定样品之间的折叠差异，并通过凝胶电泳验证PCR产物的纯度。

表1

用于实时RT-PCR检测表达的引物和探针

正向（3′-5′）反向（3′-5′）探头（3′-5′）
G6酶GGAGTCTGTCAGGCATTGCT公司TGTAGATGCGCCCGGATGTGGGCTGAAAACTTTCA公司
GK公司中国民航总公司TGTCAGCCTCGCGCACACT公司AGGAGCGGTTCAC公司
β-肌动蛋白GGCTCCCCAGCATGAA公司AGCCACGATCCACAGA公司AAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTA公司

G6Pase活性

如Kaidanovich-Beilin等人[24]稍作修改。使用手持式均质器，在500μl 250 mM蔗糖-HEPES缓冲液（pH 7.4）中均质肝脏（~100 mg）。在3000×G（4°C）下将匀浆离心10 min。向100μl上清液中添加25μl牛磺胆酸，并在冰上培养30分钟。培养后，将175μl均质缓冲液与该溶液混合。然后将60μl等分试样与140μl反应缓冲液（90mM Tris-HCl，pH 6.5，14mg/ml牛血清白蛋白，28mM葡萄糖-6-磷酸）混合。然后在37°C下培养该溶液，并在0和20分钟后添加140μl停止溶液（15%冰镇三氯乙酸）。然后在3000×G下在4°C下离心样品10分钟。向140μl上清液中添加磷酸盐试剂【4 N HCl中的5%钼酸铵四水合物和1%七水硫酸铁】。将该溶液在37°C下孵育10分钟。在650nm下读取每个样品的时间点之间的吸光度差异，并将结果标准化为蛋白质含量。

GK活动

如Rossetti等人所述，葡萄糖激酶的活性是通过监测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶形成的NADH的吸光度来测量的[25]。简单地说，在含有100 mM KCl、1 mM EDTA、5 mM MgCl的1 ml HEPES缓冲液（50 mM，pH 7.4）中均质肝脏（~100 mg）2和2.5 mM二硫赤藓糖醇。然后将匀浆在10万×G下在4°C下离心45分钟。然后将50μl上清液与ATP试剂缓冲液（100 mM KCl，7.5 mM MgCl）混合2,5 mM ATP、2.5 mM二硫赤藓糖醇、10 mg/ml牛血清白蛋白、100 mM葡萄糖、0.5 mM NAD+、4单位/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（50 mM HEPES缓冲液，pH 7.4）。NADH的吸光度在340 nm下37°C下读取20 min，结果归一化为蛋白质。

统计分析

结果报告为平均值±SEM（n=4-6）。分别使用Bonferroni事后检验或Mann-Whitney秩和检验的方差分析来确定各治疗组的参数和非参数数据的统计显著性。A类第页选择小于0.05的值作为研究前的显著性水平。

结果

乙醇增加肝脏脂质

图1显示了急性乙醇对野生型小鼠肝脏甘油三酯和非酯化脂肪酸（NEFA）的影响。等热量麦芽糖糊精小鼠的肝脏甘油三酯含量与幼稚动物相似。正如之前所观察到的（例如[16])在研究过程中，乙醇导致甘油三酯逐渐增加；在12小时的时间点，该值比麦芽糖糊精对照组高约20倍(图1，开放方块）。急性乙醇也增加肝脏NEFA含量，但时间模式与肝脏甘油三酯的反应不同。具体而言，暴露后1小时，乙醇使肝脏NEFA显著增加约5倍，然后在12小时时逐渐恢复到基础水平(图1，闭合圆）。

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急性乙醇对肝甘油三酯和NEFA的影响

动物和治疗方法见材料和方法。通过比色分析测定甘油三酯（开平方）和NEFA（闭圆）的定量。数据表示平均值±SEM（n=4-6），并归一化为mg蛋白质。*，与无乙醇（t=0h）相比，p<0.05。

乙醇对肝脏DAG水平和PKCε活化的影响

如前所述，DAG是PKCε激活的主要介质[14]。由于从头合成DAG需要NEFA，因此推测酒精引起的NEFA增加也可能增加肝脏中的DAG水平。因此，确定了急性乙醇对肝脏DAG的影响(图2和​和3）。三).图2显示了对照组和乙醇处理组小鼠的代表性色谱图，而图3显示了摘要数据。而长链DAG在乙醇暴露后2小时通常增加(图2和​和3，三，上部面板，并非所有物种的反应都相同。乙醇对四种特定DAG物种的影响在图3由于急性乙醇，DAG 32:1（m/z 589）、DAG 34:2（m/z 615）和DAG 38:6（m/z 663）均显著增加（约1.5倍）。在Sn1位置带有醚键的DAG 32:0（m/z 577）显示了乙醇的更强大的作用，其值比对照高约3倍(图3). 有趣的是，只有长链DAG受到影响，而短链和中链DAG没有被乙醇增加。

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急性乙醇对肝脏DAG水平的影响

在硅胶柱上进行色谱分离以去除极性磷脂后，显示肝脏提取物的正电子喷雾电离质谱。每个柱装载1.48μg磷酸盐样品。自Na以来+加合物用于检测DAG种类，m/z值表示相应DAG的分子量加上钠分子的重量（m+Na+). 对照组和乙醇暴露小鼠肝脏的代表性色谱图显示，通过碎片鉴定的峰为已知的DAG:DAG 32:1，带有醚键（M+Na+=575），DAG 32:0，带醚键（M+Na+=577），DAG 32:1（M+Na+=589），DAG 34:2（M+Na+=615），DAG 34:1（M+Na+=617），DAG 36:4（M+Na+=639）和DAG 38:6（M+Na+=663). 序列号表示DAG分子上酰基链中碳的总数。m/z 535处的峰值对应于内部标准（DAG 28:0）。

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急性乙醇对特定DAG物种的影响

DAG的量化按照材料和方法。上面板显示了对照组（红色）和乙醇暴露组（绿色）小鼠的平均结果汇总数据（另请参阅图2). 下部面板比较并汇总上部面板中确定的选定DAG的相对数量。数据表示平均值±SEM（n=4-6），并归一化为μg磷酸盐。*与无乙醇相比，p<0.05。

图4显示了乙醇对膜与细胞溶质PKCε之比的影响。该比率的增加是该酶活性增加的指标。与幼年小鼠相比，麦芽糖糊精给药对PKCε向细胞膜的转运没有显著影响。乙醇暴露后1 h，PKCε膜定位显著增加（约50%）。这种影响最初降低到基础水平，但在接触乙醇后8小时恢复，并逐渐增加，其值比对照组高出约3倍(图4).

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急性乙醇对小鼠肝脏PKCε活化的影响

PKCε的蛋白质印迹如材料和方法。所示的典型印迹描绘了PKCε的膜和细胞溶质部分。数据表示平均值±SEM（n=4-6）。*，与无乙醇（t=0h）相比，p<0.05。

乙醇对血浆胰岛素、血糖及胰岛素应答基因表达的影响

正如引言中所提到的，众所周知，急性和慢性乙醇会导致啮齿类动物的肝脏胰岛素抵抗。例如，Onishi等人[13]结果显示，根据高胰岛素-血糖钳夹以及IR和IRS-1和-2的磷酸化状态，乙醇丸在给药后2 h内引起胰岛素抵抗。为了在当前条件下证实这些先前的发现，我们测定了乙醇对胰岛素抵抗和信号转导替代标记物的影响。因此，测定了乙醇对血浆胰岛素和葡萄糖的影响(图5，上部面板）。酒精暴露后2小时，血浆胰岛素水平显著升高（约3倍）(图5上面板，闭合圆圈），然后在乙醇暴露后约12h逐渐降至基础水平。尽管血浆胰岛素增加，但血糖浓度没有显著降低。事实上，乙醇暴露4小时后，血糖浓度显著升高（约50%）(图5，上部面板，开口方块）。

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急性乙醇对小鼠血浆胰岛素和葡萄糖浓度及肝脏胰岛素应答基因表达/活性的影响

通过ELISA测定胰岛素（上图，闭合圆圈）和葡萄糖（上图，开放正方形）的血浆浓度。对G6Pase（上面板，闭合圆圈）和GK（下面板，闭合圆）进行实时rtPCR，如材料和方法，并将结果归一化为β-actin。G6Pase（上面板，开方块）和GK（下面板，开方框）蛋白质活性通过分光光度法测定，如材料和方法。数据为平均值±SEM（n=4-6），实时rtPCR数据报告为对照值的倍数。*，与无乙醇（t=0h）相比，p<0.05。

除了测定胰岛素和葡萄糖的血浆浓度外，还测定了乙醇对胰岛素反应基因表达和活性的影响。具体而言，测定了乙醇对胰岛素调节的2个关键基因的mRNA和蛋白质活性的影响(图5). 被胰岛素下调的G6Pase信使RNA水平被乙醇显著上调(图5，中间面板，闭合圈），最大值（~8倍）暴露后2h。在2小时的时间点后，表达逐渐恢复到基础水平，暴露12小时后的值与对照组无显著差异。乙醇丸还导致肝脏G6Pase蛋白活性显著增加(图5但乙醇对酶活性的影响不如mRNA表达所观察到的那样强烈。胰岛素上调的基因GK的信使RNA水平被乙醇显著降低约5倍(图5（下面板，闭合圆圈），并且在整个研究过程中保持这种效果。乙醇也显著降低了GK酶活性(图5但这种对蛋白质活性的影响再次不如mRNA表达的影响强烈，并且在乙醇暴露后约4h恢复。

PKCε敲除或敲除钝化乙醇诱导的脂肪变性

如引言所述，PKCε在NAFLD模型中导致脂肪变性[17]。由于PKCε在当前研究中被乙醇激活(图4)通过油红O染色和肝甘油三酯定量测定，确定用ASO“敲除”PKCε或PKCε的基因消融（“敲除“）对乙醇诱导的脂肪变性的影响(图6). ASO暴露小鼠的PKCεmRNA稳态水平显著降低至乙醇暴露小鼠的23.3±4.7%。接受麦芽糖糊精的小鼠的脂质染色很少，与天真的食物喂养的动物相似(图6，左上面板）。与此模型中的先前研究类似[16]，乙醇增加了肝脏中的油红O染色(图6，右上方面板），在12小时时可观察到宏观和微观脂肪变性。乙醇对PKCεASO处理小鼠肝脏脂质积聚的影响被减弱；ASO小鼠的这种保护作用似乎比微泡液滴对大泡脂肪变性（大脂滴）的影响更大(图6，左下面板）。ASO的使用也将乙醇引起的甘油三酯增加减缓了约50%；PKCε基因敲除小鼠也观察到类似的保护作用(图6，右下方）。

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PKCεASO对乙醇诱导脂肪变性的影响

油红O染色按材料和方法。图中显示了接受麦芽糖糊精（右上图）和乙醇（左上图）的盐处理野生型小鼠的代表性显微照片（200倍放大），以及接受PKCεASO处理的分钟乙醇（左下图）。通过比色分析对甘油三酯（右下面板）进行定量，如材料和方法数据表示平均值±SEM（n=4-6），并标准化为mg蛋白质。*与无乙醇相比，p<0.05；#与暴露于乙醇的野生型或盐处理小鼠相比，p<0.05。

PKCεASO对乙醇诱导的胰岛素应答基因变化的影响

正如引言中所提到的，PKCε激活与胰岛素抵抗在实验性NAFLD中有关联[17]。敲低PKCε对乙醇诱导的胰岛素反应基因改变的影响（参见图5)因此，在这些条件下测定了酒精引起的(图7). PKCεASO预处理显著（约2倍）减弱了乙醇引起的G6Pase上调(图7，上部面板）；然而，在PKCεASO处理的小鼠中，乙醇引起的GK下调没有显著影响(图7，下部面板）。

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PKCεASO对乙醇暴露1h后小鼠肝脏胰岛素反应基因表达变化的影响

按照中所述对G6Pase（上面板）和GK（下面板）进行实时rtPCR材料和方法，并将结果归一化为β-actin。数据为平均值±SEM（n=4-6），并作为对照值的倍数报告。*与测定的不含乙醇相比，p<0.05；#与乙醇处理的盐相比，p<0.05。

讨论

脂肪变性是ALD病理学的关键阶段，因为已经证明脂肪变性的程度可以预测人类该疾病的未来阶段[4]。此外，脂肪变性的预防实际上可以预防更严重的ALD阶段，如纤维化和肝硬化[三]。因此，研究这种急性模型中脂质积聚的原因不仅有助于筛选酒精诱导脂肪变性的新机制，还可能确定治疗ALD的疗法。以前的研究表明，PKCε在实验性NAFLD的肝脂肪变性中起着因果作用[17]。然而，PKCε在乙醇诱导的脂肪变性中的作用尚未确定，随后成为本研究的重点。这里，使用急性乙醇暴露模型[16]结果支持PKCε活化和乙醇诱导脂肪变性之间的因果关系。首先，研究表明，乙醇会增加PKCε的激活，并伴有胰岛素抵抗指数。接下来，我们确定，PKCε的抑制可防止急性乙醇引起的胰岛素抵抗和脂肪变性。

PKCε如何引起脂肪肝？

PKCε引起脂肪肝的一种可能机制是通过损害肝脏胰岛素信号[14]。在以前的研究中，已经表明急性和慢性接触乙醇都会导致啮齿类动物的肝脏胰岛素抵抗（例如[13]). 为了验证乙醇在这些条件下的作用，研究了胰岛素和葡萄糖的血浆水平以及胰岛素反应基因（GK和G6Pase）的表达。胰岛素抵抗的一个指标是由于身体不再对正常水平的胰岛素作出反应而导致的高胰岛素血症。急性乙醇显著增加（约3倍）血浆胰岛素浓度(图5上面板，闭合圆圈），但对血糖无影响；在这些条件下，胰岛素明显不能降低血糖，这与以前使用正葡萄糖钳夹的研究一致[13]。乙醇也改变了胰岛素反应基因的表达谱，这表明存在胰岛素抵抗(图5，中/下面板）。

特别是在胰岛素信号未受损期间，胰岛素上调GK表达，而下调G6Pase表达。胰岛素的这种作用有助于细胞代谢从葡萄糖产生向葡萄糖利用的转变。然而，图5说明急性乙醇增加G6Pase表达，同时降低GK，这与胰岛素引起的模式相反。综上所述，这些数据支持了乙醇在当前条件下导致体内肝胰岛素抵抗的假设。

在接受PKCεASO的小鼠中，还测定了乙醇对胰岛素应答基因的影响(图7). 有趣的是，虽然乙醇引起的G6Pase的上调几乎完全被ASO减弱，但GK的下调却不受ASO的影响。这些数据表明，PKCε介导胰岛素抵抗的某些方面，但不介导其他方面。这可能并不奇怪，因为这两个基因是由胰岛素通过不同的下游信号级联调节的[26,27]。因此，PKCε可以抑制导致胰岛素下调G6Pase的级联反应，但不参与导致胰岛素上调GK的级联反应。这些结果表明，PKCε可能是急性乙醇暴露模型导致肝胰岛素信号受损的部分原因。

乙醇激活PKCε的潜在机制

乙醇代谢的一个众所周知的代谢效应是NADH:NAD+比率增加；如引言所述，吡啶核苷酸氧化还原比率的增加抑制了游离脂肪酸的β-氧化，从而导致NEFA积累[6]。此处观察到肝脏NEFA快速而强劲的增加(图1)可能归因于这种机制。DAG可以通过许多不同的机制产生，包括通过三酰甘油途径的从头合成。除了增加NEFA对DAG合成的供应外，乙醇代谢的代谢效应可能会增加DAG合成所需的其他代谢物。（例如，磷酸二羟丙酮、α-甘油磷酸等）[28]。例如，NADH:NAD+比率的增加抑制了甘油醛磷酸脱氢酶，激活了甘油-3-磷酸脱氢酶[29]; 这种效应预计会导致磷酸二羟丙酮和α-甘油磷酸积累，这将进一步有利于从NEFA中形成DAG。

阻断PKCε的表达只能对急性乙醇暴露导致的脂肪肝提供部分保护。这一结果表明，其他独立于PKCε的机制也在乙醇引起的脂肪变性中发挥作用。例如，除了ε外，还有许多PKC亚型被证明会引起胰岛素抵抗[30]。因此，这些PKC亚型中的一种或多种可能与PKCε协同作用，导致乙醇诱导的脂肪变性。另外，通过与PKC家族无关的机制引起胰岛素抵抗的药物也可能因乙醇而导致脂肪肝。最后，很可能是由于酒精代谢引起的对游离脂肪酸β-氧化的氧化还原抑制导致了剩余的脂肪变性，而PKCεASO并不能消除这种脂肪变性。显然，所有这些可能的机制都可能与PKCε协同作用，导致乙醇诱导的脂肪肝。

总结和结论

这项工作的主要目的是确定和表征PKCε在早期酒精诱导的肝病中的作用。这里所描述的实验表明，PKCε被激活的潜在机制以及PKC-ε参与乙醇诱导脂肪变性的方式。具体来说，乙醇会导致NEFA的积累，从而增加DAG的合成。DAG变构激活PKCε，从而损害胰岛素信号并导致肝脂肪变性。总之，本研究结果支持PKCε在乙醇诱导的脂肪变性中起因果作用的假设。因此，PKCε可能是一个可以预防和/或阻止ALD进展的治疗靶点。

致谢

这项工作得到了国家酒精滥用和酗酒研究所（NIAAA）的部分资助。J.Phillip Kaiser得到了美国国家酒精滥用和酒精中毒研究所（NIAAA）的产前（F31）奖学金的支持。

缩写

乙醇
乙醇
ALD公司
酒精性肝病
GK公司
葡萄糖激酶
G6酶
葡萄糖-6-磷酸酶
尼日利亚石油公司
非酯化脂肪酸
PKCε
蛋白激酶c-ε
DAG公司
甘油二酯
ASO公司
反义寡核苷酸
NAFLD公司
非酒精性脂肪肝

脚注

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