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自然。作者手稿；PMC 2009年4月22日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然。2008年10月16日；455(7215): 930–935.
在线发布2008年8月24日。 doi（操作界面）：10.1038/自然17261
预防性维修识别码：PMC2672043型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院102647
PMID：18724359

的标识ALK公司作为主要家族性神经母细胞瘤易感基因

耶尔·普·莫斯,1 马西·劳登斯拉格,1 卢卡·隆戈,2 克里斯蒂娜·科尔,1 安德鲁·伍德,1 爱德华·F·阿提耶,1 迈克尔·J·拉奎利亚,1 雷切尔·塞内特,1 吉尔·E·林奇,1 帕特里齐亚·佩里,三 杰纳维耶夫·劳雷斯,4 弗兰克·斯佩尔曼,4 哈科·哈科纳森,5 阿里·托卡马尼,6 尼古拉斯·肖克,6 加勒特·M·布罗德,1 吉安·保罗·托尼尼,2 埃里克·拉帕波特,1 马塞拉·德沃托,7,8和约翰·马里斯1,9
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

尽管化疗强度急剧增加，但儿童癌症神经母细胞瘤的生存率并没有实质性提高。像大多数人类癌症一样，这种胚胎性恶性肿瘤可以遗传，但家族性和偶发性神经母细胞瘤的遗传病因尚不清楚。这里我们显示间变性淋巴瘤激酶基因的种系突变(ALK公司)解释大多数遗传性神经母细胞瘤，激活突变也可能是通过身体获得的。我们首先通过神经母细胞瘤家系的全基因组扫描，在第2染色体的短臂处发现了一个显著的连锁信号（rs1344063处的最大非参数LOD=4.23）。通过对区域候选基因的重新测序，确定了该基因酪氨酸激酶结构域中三个单独的错义突变ALK公司（G1128A、R1192P和R1275Q），与疾病分离在八个不同的家族中。对491例偶发性人类神经母细胞瘤样本的检查表明ALK公司基因座扩增率为22.8%，高扩增率为3.3%，这些畸变与疾病死亡高度相关(P（P）=0.0003). 对194例高危神经母细胞瘤样本进行的重新排序显示，12.4%的样本在酪氨酸激酶结构域内发生了体获得性突变。十个突变中有九个映射到激酶结构域的关键区域，并被预测为高概率致癌驱动因素。突变导致与激活一致的构成性磷酸化，并靶向敲除ALK公司mRNA对4株突变或扩增的细胞株中的4株产生了深度生长抑制ALK公司，以及6种野生型中的2种ALK公司.我们的结果表明ALK公司是家族性神经母细胞瘤的主要病因，这种细胞表面激酶的种系或获得性激活是这种致命的儿童恶性肿瘤的一个易治疗靶点。

神经母细胞瘤是一种发生于儿童早期自主神经系统发育过程中的癌症。这是出生后第一年诊断出的最常见的恶性肿瘤，表现出广泛的临床表型，其中一些患者的肿瘤会自发退化，而大多数患者患有侵袭性转移性疾病1尽管进行了密集的放化疗，但这些神经母细胞瘤患者的生存率仍低于40%，并且该疾病仍占儿童癌症死亡率的15%1,2。侵袭性表型患者的肿瘤通常表现为MYCN公司致癌基因三和/或染色体臂1p和11q缺失4然而，因为MYCN公司是如此异常的失调，1p和11q的假定抑癌基因在超过一小部分的病例中没有被证明含有失活突变，目前还没有可控制的分子靶向治疗这种疾病的方法。

像大多数人类癌症一样，一小部分神经母细胞瘤病例是以常染色体显性方式遗传的5-7在约1-2%的新诊断病例中发现了该疾病的家族史，指数病例的兄弟姐妹的标准发病率为9.78神经母细胞瘤谱系显示，出现的肿瘤类型具有显著的异质性，良性和恶性都发生在同一家族中9家族性神经母细胞瘤患者与散发性疾病患者的不同之处在于，他们在早期被诊断和/或患有多原发性肿瘤，这些临床特征是癌症易感综合征的特征。由于这种疾病在生育年龄之前具有致命性，以前的基因连锁扫描能力不足，结果难以复制10-12值得注意的是，神经母细胞瘤可伴有一系列与神经嵴衍生组织异常发育相关的疾病，包括中枢性先天性低通气综合征和先天性巨结肠症。错误或无意义的突变电话2B是一种同源异型盒基因，是正常自主神经系统发育的主要调节因子，最近研究表明，它容易导致这种罕见的交感神经谱系组织的场缺陷13-15然而，电话2B突变只解释了遗传性神经母细胞瘤的一小部分，几乎只适用于神经嵴源性组织相关疾病的病例，而不是肿瘤中的躯体获得性突变16,17，使得大多数家族性神经母细胞瘤病例的遗传病因尚不清楚。

生殖系鉴定ALK公司突变

为了确定遗传性神经母细胞瘤易感基因的位置，我们在20个神经母细胞癌家族中进行了约6000个单核苷酸多态性（SNP）的全基因组连锁扫描。由于这种情况的罕见性，全基因组扫描包括对实际遗传力具有不同置信度的家系。八个家庭有三个或三个以上关系密切（高度自信）的受累个体，而六个家庭只有两个一级关系的个体（中度自信），六个家庭也只有两个受影响个体，但关系较远（低自信）。我们在18个家系的2p染色体上发现了一个显著的连锁信号，在rs1344063处的最大非参数LOD得分为4.23（其中两个家系因DNA不足而被排除在外）。这改进了先前报道的一个在这里研究的家系的区域10通过绘制信息重组事件图，我们在染色体带2p23-p24处定义了一个易感性位点，该易感性位点由SNPs rs1862110和rs2008535界定，包含104个基因，其中包括已知的神经母细胞瘤癌基因，MYCN公司三,18、和ALK公司癌基因位于13.2Mb着丝粒。尽管之前的研究表明MYCN公司对小鼠神经嵴引起神经母细胞瘤18，重新排序MYCN公司来自每个连锁家族的先证者的编码区和周围基因组DNA的18Kb没有显示出与疾病相关的序列变异。

接下来我们关注间变性淋巴瘤激酶基因(ALK公司)因为我们小组和其他人之前已经确定ALK公司作为神经母细胞瘤中一个潜在的致癌基因通过基因组位点的体获得扩增19,20此外，致癌融合蛋白导致ALK公司激酶结构域存在于许多人类癌症中，包括间变性大细胞淋巴瘤21、炎性肌纤维母细胞瘤22、鳞状细胞癌23和非小细胞肺癌24,25.29的重新排序ALK公司编码外显子识别出三个单独的单碱基替换ALK公司筛选出的8个先证者的酪氨酸激酶结构域(图1,表1). 在单核苷酸多态性（dbSNP；www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)或体细胞突变（COSMIC；www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/化学/)数据库，并且在对ALK公司218个正常对照等位基因的酪氨酸激酶结构域。随后发现，每一种替代物都与每个家族中的疾病隔离(图1). FNB12（R1275Q）中的序列变异似乎已经获得从头开始在受影响的父亲中，通过对该家系内基因型的遗传分析排除了非父系性。确定了几个无症状的专性携带者（FNB2、FNB13、FNB32、FNB52、FNB56），表明该病的外显率不完全可能是由于缺乏第二次命中，或者至少在一部分病例中发生恶性转化后的自发性回归。值得注意的是，非常大的多重家族（FNB52）在双胞胎和多个未受影响的携带者中存在不一致性，分离出独特的种系突变（G1128A）。

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八个神经母细胞瘤家系ALK公司突变

所有具有可用于基因分型的DNA的家庭成员，无论是野生型（wt）还是ALK公司，或者在ALK公司酪氨酸激酶结构域（R1192P、R1275Q、G1128A）。受神经母细胞瘤影响的个体用填充符号表示。

表1

ALK公司神经母细胞瘤的突变

突变cDNA
变更		类型/频率地区1概率
正在激活
突变2
G1128A型c.3383G>摄氏度生殖系（1/8）P回路0.95
1192P兰特c.3575G>摄氏度生殖系（2/8）β4钢绞线0.96
1275Q兰特c.3824G>A生殖系（5/8）激活循环0.91
躯体（8/24）
D1091N号c.3271G>安躯体（1/24）N端子0.29
M1166R型c.3497T>克躯体（1/24）C-螺旋0.79
1711亿欧元约3512T>A躯体（2/24）C-螺旋0.85
1174I财年c.3520T>A躯体（1/24）C螺旋的末端0.92
F1174升c.3522C>A躯体（8/24）C螺旋的末端0.96
1245C层c.3734T>G躯体（1/24）催化回路0.94
1245伏特c.3733T>克躯体（1/24）催化回路0.91
1250吨c.3749吨>摄氏度躯体（1/24）催化回路0.87
1指出了密码子发生改变的区域。注意，D1091N紧邻酪氨酸激酶结构域。
2根据Torkamani和Schork的方法，氨基酸改变导致致癌激活的可能性。26

ALK公司序列变异仅发生在对携带易感等位基因具有高或中等置信度的家族中。有三名或三名以上受影响者的八个家庭中，有六个ALK公司错义更改。那两个没有ALK公司我们发现每个序列的改变都含有交感神经谱系特异性突变电话2B神经发育基因14,16六个家庭中有两个只有两名受影响的人，但有一级亲属ALK公司序列变化。这些家族中的每一个都携带R1275Q突变，在FNB12中，我们发现突变在受影响的父亲中从头开始，而在FNB56中，这种突变是从未受影响的母亲那里遗传来的(图1). 6个有两个远亲的神经母细胞瘤患者家庭均未显示ALK公司改变，表明在大家庭成员中再发生一例这种相对罕见的疾病很可能是偶然发生的。由于有几个家族共享相同的突变，我们观察了这些家族是否在ALK公司基因，表明具有相同突变的受影响个体不共享单倍型，这与创始人效应相矛盾。

因为ALK公司我们预测，在神经母细胞瘤家系中发现的序列变异将导致构成性激活。因此，我们使用基于支持向量机的统计分类器来映射假定的突变，并确定它们作为致癌过程驱动因素的概率26,27。每个种系的改变都发生在ALK公司激酶结构域被证明是其他致癌激酶中致癌因子突变的主要靶点(表1,图2). 五个家系受感染个体的生殖系DNA中存在R1275Q突变(图1)，并且落在与许多不同蛋白激酶的激活突变强烈相关的区域中的激酶激活环内，例如BRAF公司28这种氨基酸替换导致一个电正性残基被一个电负性更强的残基取代，可能模拟了激活磷酸化的事件。R1192P突变发生在激酶结构域的β4链的起始处，尽管它被预测为具有高置信度的驱动突变(表1)激活机制尚不清楚27G1128A仅见于单代受影响个体的大谱系。变异发生在甘氨酸环的第三个甘氨酸处，并且该甘氨酸与丙氨酸在BRAF公司已经证明可以增加激酶活性29.

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生殖系和体细胞ALK公司突变

a。蛋白质结构示意图ALK公司，家族性病例（生殖系）和散发病例（体细胞）的原发肿瘤的构成DNA中发现突变。除了一个序列改变外，其他所有序列都映射到酪氨酸激酶结构域（D1091N只是N末端，此处未指出）。在发现的三个种系突变中，只有R1275Q在肿瘤DNA样本中被发现。相反，在肿瘤组中发现的I1250T突变也存在于该患者的匹配种系DNA中，而这里研究的所有其他突变都是通过身体获得的。b。野生型同调模型ALK公司指出了每个主要子域26,27.c。ALK公司将突变映射到同源模型上（方向不同以显示所有突变），用颜色表示突变所在的子域（例如R1275Q突变位于激活片段内，用绿色表示）。

体细胞ALK突变的鉴定

已经证明ALK公司酪氨酸激酶结构域与神经母细胞瘤的高度渗透性倾向有关，我们接下来试图确定ALK公司激活也可能是通过身体获得的。我们在基于550K SNP的微阵列上检测了一组491例儿童零星发生的原发性神经母细胞瘤样本，以评估全基因组拷贝数的变化。共有112例（22.8%）患者在2p时表现出大基因组区域的不平衡增益，包括ALK公司基因座（部分三体），另外16例（3.3%）显示高水平的ALK公司(图3). 每个高电平放大都与MYCN公司2p时的放大和/或其他区域，除了一例ALK公司仅限放大器。异常的存在ALK公司拷贝数状态（增加或扩增）与侵袭性临床表型（如诊断时的转移）高度相关(P（P）<0.0001）和疾病死亡(P（P）=0.0003).

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代表ALK公司三种神经母细胞瘤原发肿瘤的拷贝数改变

图中显示了反映偶发疾病患者三种原发肿瘤中沿着2p染色体的所有SNP拷贝数的杂交强度，用对数表示。MYCN公司扩增存在于所有肿瘤中。a。染色体2p的区域增益（三体），包括ALK公司轨迹。b。焦点增益ALK公司轨迹。c。焦点放大ALK公司轨迹。d和e。2p位点的复杂重排，显示各种焦点放大，包括MYCN公司和ALK公司.

因为ALK公司我们接下来检测了167个高危患者肿瘤样本和27个人类神经母细胞瘤衍生细胞系（均来自高危患者）中的一个子集，以确定其序列改变ALK公司酪氨酸激酶结构域。167个肿瘤中的14个（8.4%）和27个细胞系中的10个（35.7%）样本显示了与激活突变一致的单碱基替换(图2). 共鉴定出八个单独的单碱基替换，R1275Q突变是所研究家族的生殖系DNA中唯一的突变。同样，这里发现的序列变异都没有出现在SNP数据库中，也没有在我们的重新测序中发现ALK公司109名对照受试者的酪氨酸激酶结构域（218个等位基因）。突变在有和无突变的病例中分布均匀MYCN公司放大。只有一个病例同时出现ALK公司突变（F1174L）和基因组扩增ALK公司在这种情况下，突变的等位基因被扩增（数据未显示）。有9/14名患者的生殖系DNA可用ALK公司突变，在其中一种情况下，序列改变（I1250T）也存在于生殖系中，这表明遗传倾向可能是，也可能不是从头开始在这种情况下。

使用用于种系突变的相同统计分类器，我们接下来表明，在肿瘤组织中发现的所有序列变异中，只有一个序列变异被预测为激活突变(表1)显示低概率（D1091N）的基因位于核心激酶结构域之外。绝大多数体细胞获得性突变属于催化环或C螺旋激酶域，这两个域都是致癌激活突变的常见位点(图2). 催化环突变体，尤其是I1250T，可能通过改变底物结合或更有可能改变HRD和DFG基序的堆积，从而促进肿瘤发生30。在ALK公司C-螺旋结构域出现在先前在其他肿瘤中观察到突变的激酶结构域内的位置。I1171N在遇见（m1149吨）31，并且M1166R、F1174I和F1174L突变体落在错误B2（D769、V777）和表皮生长因子受体（D761、V769）32-34.

的功能后果ALK公司突变

我们之前已经表明ALK公司在人类原发性神经母细胞瘤中有差异表达，在侵袭性最强的肿瘤中有较高表达35。我们确认ALK公司使用定量RT-PCR在20个人类神经母细胞瘤衍生细胞系中除一个外的所有细胞中高度表达。ALK公司与发育中的胎脑相比，神经母细胞瘤细胞的表达更高，并且细胞系中含有ALK公司突变（N=6）表达的mRNA拷贝数明显高于ALK公司野生型细胞系（N=14，图4a). 对一组神经母细胞瘤细胞系的蛋白裂解物的分析表明，在每一个含有突变的细胞系中，密码子1604处的酪氨酸残基构成性磷酸化，两个野生型细胞系中的磷酸化较弱(图4b).

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ALK公司在含有激活突变的神经母细胞瘤细胞系中高表达且激酶磷酸化

a。相对ALK公司神经母细胞瘤细胞系和胎脑的表达用2-ΔΔCt法测定49通过非配对T检验确定统计显著性。b。免疫印迹显示，酪氨酸1604密码子磷酸化的神经母细胞瘤细胞系中ALK的差异表达仅限于突变细胞系（野生型细胞系NBEC1和NB1771显示微弱的磷酸化染色）。

确定是否ALK公司在高危神经母细胞瘤模型中，通过突变和/或扩增的激活在功能上是相关的，因此可能提供一个易于控制的治疗靶点，我们研究了干扰的后果ALK公司通过敲低信使RNA进行信号传导。我们瞬时转染针对ALK公司（Dharmacon，Lafayette，CO）转化为10个神经母细胞瘤细胞系，并筛选抑制基质粘附生长。我们证明了所有研究品系中mRNA和蛋白质的敲除，但对细胞增殖有不同的影响(图5a-l). 每个细胞都有ALK公司突变或扩增对ALK公司击倒。此外，2/6的ALK公司野生型细胞系显示出明显的生长抑制ALK公司敲除并且每个都显示了酪氨酸160处磷酸化的微弱证据(图4b)，表明另一种机制可能导致ALK公司这两种细胞系中的激酶激活。

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生长抑制ALK公司突变或扩增的神经母细胞瘤细胞系

在10个未经治疗、转染了抗ALK、GAPDH（阴性对照）、非靶向对照（NTC，阴性对照）或polo-like激酶基因的siRNAs的神经母细胞瘤细胞系中，每隔30分钟监测并记录基质粘附细胞生长，持续至少120小时(PLK1; 阳性对照）。x轴是转染后的时间（以小时为单位），并且根据每个细胞系的生长动力学而不同。y轴是相对于siRNA标准化的生长百分比GAPDH公司显示了siRNAs相对于GAPDH公司（红色）和ALK公司（蓝色）。在每个实验中，siRNA NTC与siRNA对GAPDH公司在每种情况下，siRNAPLK1显示出严重的生长抑制作用，但只有针对GAPDH公司和ALK公司为便于可视化，此处显示。每个实验一式三份，每个实验至少重复一次，结果一致（数据未显示）。每个siRNA曲线的重复显示出几乎没有变化，所有线的标准偏差<5%（除了siRNA对GAPDH公司SKNDZ和NB1643（<10%）。细胞系、突变状态和百分比ALK公司48小时时mRNA的敲除如下：a。KELLY（F1174L）78%mRNA敲除（kd）；b。SKNSH（F1174L），21%mRNA kd；c。NB1643（R1275Q），48%mRNA kd；d.IMR5（扩增），60%mRNA kd；e、。NBEBC1（WT），74%mRNA kd；f、。NB1771（WT），68%mRNA kd；g、。SKNAS（WT），ALK公司未以可检测水平表达；小时。SKNDZ（WT），41%mRNA kd；i、。SKNBE2C（WT），62%mRNA kd；j。NGP（WT），86%mRNA kd。k、。生长抑制百分比总结ALK公司siRNA敲除ALK公司突变和等位基因状态；l、。免疫印迹显示，在代表性神经母细胞瘤细胞系KELLY（F1174L突变并显示生长抑制）和SKNDZ（野生型）中，siRNA转染后24、48和72小时ALK蛋白敲除ALK公司序列和无生长抑制）。

讨论

Knudson和Strong预测神经母细胞瘤，就像类似的胚胎癌视网膜母细胞瘤一样，将遵循一个解释遗传性和散发性病例的双重模型5该模型已被证明对大多数儿童和成人遗传性癌症是正确的，易感基因通常是肿瘤抑制基因，其中两个命中是两个等位基因的顺序失活。发现致癌基因的可遗传突变是多发性内分泌肿瘤1的病因(房地产税)，乳头状肾癌(遇见)和胃肠道间质瘤(配套元件)挑战了这一范式，但现在很明显，突变等位基因的体获得性复制或扩增提供了第二个打击36。我们现在已经表明ALK公司是大多数遗传性神经母细胞瘤病例的病因，这是第一例因癌基因突变而引起的儿童癌症。结合我们最近的报告，染色体带6p22的常见变异易导致散发性神经母细胞瘤的发生，37这种疾病的遗传病因目前正在确定。高渗透性遗传基因的发现ALK公司突变是遗传性神经母细胞瘤的病因，与有家族史的患者直接相关，因为对于患有神经母细胞癌的未受影响的儿童，应采用超声检查和尿儿茶酚胺代谢物测定等非侵入性技术进行筛查ALK公司突变。此外，正在进行的描述整个基因突变全谱的工作ALK公司编码序列以及确定所有神经母细胞瘤疾病亚群的突变频率，将被要求为有或无家族史的新诊断神经母细胞癌患者制定基因筛查建议。

ALK公司是一种孤儿酪氨酸激酶跨膜受体，与神经营养因子受体和遇见致癌基因。表达仅限于发育中的神经系统，在参与调节神经元分化中具有假定的作用38现在很明显，许多人类癌症激活ALK公司通过创造独特的致癌融合信号ALK公司通过染色体易位事件与各种伴侣39先前的研究表明，相当比例的人源性神经母细胞瘤细胞系表达ALK公司转录物和ALK蛋白40，但该致癌基因的确切作用尚未被证实19,41-43McDermott及其同事最近发现ALK公司作为神经母细胞瘤的分子靶点，通过药物拮抗剂筛选人类肿瘤细胞系ALK公司激酶结构域。44我们目前的报告提供了第一个证据证明ALK公司通过激酶结构域的突变，这些数据为观察对ALK公司激酶抑制。此外，我们在神经母细胞瘤中的发现可能会导致未来在其他恶性肿瘤中进行重新测序，特别是那些最近发现致癌融合蛋白的肿瘤。这里提供的数据清楚地表明ALK公司作为关键的神经母细胞瘤致癌基因，应加大力度识别该受体的配体，并了解如果ALK公司-介导的信号可以通过直接突变和/或扩增以外的机制激活ALK公司等位基因。最后，受体酪氨酸激酶为药物抑制提供了易于控制的靶点，这项工作应该为开发旨在抑制ALK公司-介导信号传导。

方法总结

20名患有神经母细胞瘤的先证者和该疾病的家族史被确定用于研究。根据每个家族中存在高度渗透性癌症易感性等位基因的可能性，将这些家系分为三类：八个家系中有3个或更多的受累个体（平均值4.5；范围3-7）；六个家系仅包含两名受累个体，但具有一级亲属关系（其中一个家系由一对受神经母细胞瘤影响的兄弟姐妹组成，与该疾病也有远亲关系）；六个家系仅由两个受累个体组成，但具有二级（N=1）、三级（N=2）或≥四级（N=3）的关系。由于这种情况罕见，所有家系的可用个体都使用Illumina Linkage IVb SNP面板进行了全基因组的基因分型。在我们收集的系谱中，我们使用仿真来评估在该平台上进行连锁分析的能力。鉴于观察到的系谱结构和疾病表型，我们在疾病的遗传同质性和常染色体显性遗传模型下模拟了标记数据，并使用仅受影响的方法分析数据，该方法不对未知疾病外显率进行假设，因此与我们在实际连锁分析中使用的无模型方法相当。我们估计，根据地图信息内容，在与疾病基因座完美连接的基因座上可达到的预期最大lod评分范围为1.7至5.6，根据我们的经验数据，假设在0.5至0.9的范围内。在染色体2p位点观察到的最大lod-core为4.23，在这个范围内，与该基因组区域标记的高信息含量相一致。共有176名个体（49名受神经母细胞瘤影响的个体）进行了基因分型，其中两个家庭因DNA不足以进行全基因组基因分型而被排除在外。使用PedStats检查基因型数据的孟德尔不一致性45，并使用Merlin分析链接46和指示灯47.

使用桑格方法对所有编码外显子重新测序，包括周围内含子DNA的至少50个碱基对，以及紧邻末端编码外显体的1000个碱基配对。使用基于支持向量机的统计分类器对DNA序列改变编码突变蛋白的概率进行预测26,27共使用来自散发性疾病患者的491份原发性神经母细胞瘤肿瘤样本和27份人类神经母细胞癌衍生细胞系进行全基因组SNP阵列分析（550K），以确定拷贝数变化。mRNA敲除ALK公司和控制目标（GAPDH-阴性对照和PLK1-阳性对照）是通过针对每个靶点的四个单独的siRNA池来实现的，并且每个实验的敲除百分比被量化。使用RT-CES™微电子细胞传感器系统（加利福尼亚州圣地亚哥ACEA）量化siRNA敲除对底物粘附生长的影响48在转染后24、48和72小时，从神经母细胞瘤细胞系KELLY、NB1643、SKNSH、NBEBC1、NB1771、SKNAS、SKNDZ、SKNBE2C和NGP（IMR5裂解物不可用）以及10 nM siALK和siNTC（非靶向对照siRNA）处理的KELLY和SKNDZ细胞中收集全细胞裂解物。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶分离，并根据标准的Western印迹程序，使用1:1000的ALK（Cell Signaling，#3333）和Phospho-ALK（Cell-Signaling，#1341）初级抗体和1:5000的Actin（Santa Cruz，sc-2352）免疫印迹。

方法

研究对象和样本

至少有一个其他亲属有神经母细胞瘤病史的家庭有资格参加。只研究了神经母细胞瘤家系的种系DNA，因为没有来自受影响成员的肿瘤组织。从儿童肿瘤组织神经母细胞瘤肿瘤库获得了来自外周血单个核细胞的具有匹配结构DNA的零星神经母细胞肿瘤样本。费城儿童医院机构审查委员会批准了这项研究。

联动分析

使用Illumina linkage IVb SNP面板进行全基因组连锁扫描。使用PedStats检查基因型数据的孟德尔不一致性45，并使用Merlin分析链接46和指示灯47利用最大似然等位基因频率估计和无模型分析进行全基因组连锁筛查。由于继承模式很复杂，我们使用了无模型方法，以避免假定任何特定的继承模式。我们使用标准阈值来声明连锁分析中的显著性，即lod-score>3，对应于p值<0.0001。与我们最显著的不良贷款4.23相关的p值为0.00001。基因组的所有其他区域的NPL≤2.05，或p值>0.001。对显性遗传模式下关键区域中包含的所有SNP进行基于模型的分析，假设四种不同的基因频率（0.0001、0.001、0.01和0.1）和在广泛范围内具有不同外显率的显性传播，从0.0001到0.68。还使用LAMP中实施的方法进行了基于模型的连锁分析，假设疾病流行率为0.000143（1/7000），并在所有可能的疾病模型中最大化lod-score（MOD评分分析）。LAMP计划不需要指定“先验”遗传模型，只需要估计特征流行率。在每次分析中，临界区间被定义为相关lod-score大于最大lod-core减3的区域。由于已知标记之间的连锁不平衡（LD）会在缺失创始人的情况下，通过连锁分析使lod核膨胀，因此在染色体2p临界区间评估其对lod核的影响。为了建立LD模型，我们利用Merlin将标记组织成簇，Merlin使用来自HapMap项目的群体单倍型频率(网址：http://www.hapmap.org/). 或者，Merlin可以搜索r2大于0.1，并定义包括每个识别对和中间标记的簇。

DNA测序

根据长PCR产生的模板对围绕该基因的18千碱基区域进行枪式测序MYCN公司在神经母细胞瘤家系中三个编码外显子的双向测序显示无疾病因果序列变异后，使用454生命科学仪器（Branford，CT）进行该位点的检测。双向测序ALK公司编码序列（根据要求可获得的引物序列）在以下不同的样本组中进行：1）来自先证者和来自20个神经母细胞瘤谱系的未受影响的一级亲属的组成DNA，对含有任何DNA序列变异的扩增子进行重复测序，并对含有已确认的其余家族成员变异的扩增物进行测序；2） 费城儿童医院保存的27株人神经母细胞瘤衍生细胞系DNA（可根据要求提供）；3） 儿童肿瘤组织肿瘤库167例散发性神经母细胞瘤的肿瘤DNA；和4）109个正常组织DNA，来自从新泽西州卡姆登市科里尔医学研究所购买的SNP500癌症资源小组。为了验证神经母细胞瘤细胞系的完整性，对所有细胞系进行常规基因分型（AmpFLSTR Identifiler试剂盒；加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司），并检测支原体。

突变预测

按照Torkamani和Schork的描述进行癌症突变预测和分析27简单地说，支持向量机是根据常见SNP（假定中性）和先天性致病SNP训练的，这些SNP具有多种序列、结构和系统发育参数。利用激酶催化核心内外发生的体细胞突变进行训练和预测。然后将基于支持向量机的方法应用于ALK公司突变体，并且通过支持向量机计算每个突变体是驱动程序的概率。催化域突变的SNP驱动因子阈值为0.49，所有其他突变的阈值为0.5326。为了与之前观察到的癌症突变进行比较，ALK公司突变体被映射到具有特征位点基序的催化核心排列的位置，之前观察到的癌症突变体映射到相同的位置27.

肿瘤拷贝数分析

费城儿童医院应用基因组学中心使用Illumina Infinium™II HumanHap550 BeadChip技术（Illuminia，San Diego，CA）对肿瘤样本进行了分析。在每个病例中，总共使用750毫微克的基因组DNA作为输入，按照制造商的建议和前面所述进行检测和数据分析。37

定量mRNA表达

总RNA是使用RNeasy（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）分离的。使用SuperScript First strand cDNA合成试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）从2μg合成第一链cDNA。将所得cDNA稀释为1:4，每次实时PCR反应使用2μL。在标准条件下，使用Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）预先验证的TaqMan基因表达分析在20μL反应中对每个样品进行三次检测，并使用Appliel Biosystes 7900-HT序列检测系统收集数据。使用SDS 2.3分析软件（Applied Biosystems）评估基线、阈值和重复值，并手动将异常值排除在进一步分析之外。相对ALK公司使用2-ΔΔCt方法测定表达，49使用GAPDH公司作为内源性对照，并使用第二个dCT作为最低表达细胞系。

神经母细胞瘤细胞株中ALK siRNA的敲除

总计1-5×104在96孔RT-CES™微电子细胞传感器系统（加利福尼亚州圣地亚哥ACEA）中，将神经母细胞瘤细胞在无抗生素的完整培养基中培养三次过夜48然后将含有50 nM混合siRNA的200μL瞬时转染细胞（每个靶向转录物四个单独的siRNA）ALK公司（目录号M-003103-02），GAPDH公司（目录号D-001140-01-20）阴性对照、非靶向阴性对照，或PLK1（目录号M-003290-01）阳性对照（siGENOME SMARTpool siRNA，Dharmacon，Lafayette，CO），根据制造商的协议，使用0.1%v/v Dharmatefect I（Dharmacon，Lafayette，CO.）。简而言之，将35μL的1μM siRNA和35μL无血清培养基与0.7μL的Dharmafect I结合在70μL的无血清培养液中，并在室温下培养20分钟，然后添加560μL的不含抗生素的完整培养基。轻轻地将培养基从平板细胞中取出，并用含有siRNA的200μL新鲜培养基、模拟培养基或完整培养基代替。连续监测细胞生长，每30分钟记录一次细胞指数（CI），持续至少96小时。“细胞指数”（CI）来源于活细胞与微孔板中生物相容性微电极表面相互作用时电阻抗的变化，有效测量细胞数量、形状和粘附性。siRNA转染48小时后，使用Qiagen（Valencia，CA）迷你提取试剂盒，用DNAase处理，从平行96孔板中接种的细胞中提取总RNA。200 ng总RNA被寡核苷酸T引物，并使用Superscript II逆转录酶进行逆转录（Invitrogen，Carlsbad，CA）。ALK、HPRT、GAPDH和PPIB公司使用Taqman®基因表达分析（ABI，Foster City，CA）通过定量RT-PCR测量表达水平，在相应的标准曲线上量化，并归一化为三个看家基因的几何平均值。两个独立实验一式三份。通过比较siRNA和ALK公司增长曲线对GAPDH公司最大细胞指数（CI）时最大值):

%生长抑制=（1−Cl赛尔克 ∕ 氯siGAPDH公司) × 100.

ALK公司和GAPDH公司击倒是通过比较相对ALK公司表达式：

%击倒=（1−ALK赛尔克 ∕ ALK公司siCONTROL公司) × 100.

的平均击倒百分比ALK公司在所有细胞系中为60%（范围21%-86%）。的平均击倒百分比GAPDH公司为75%（范围61%-95%）。

ALK蛋白和磷酸蛋白检测

神经母细胞瘤细胞系KELLY、NB1643、SKNSH、NBEBC1、NB1771、SKNAS、SKNDZ、SKNBE2C和NGP在标准细胞培养条件下在T75烧瓶中生长（IMR5裂解物不可用）。对于从siRNA敲除实验中收集的KELLY和SKNDZ裂解物，将细胞置于T25s中，转染10 nM siRNA（如上所述），并在转染后24、48和72小时收集。在60-80%的汇合度（或适当的时间点）下，收集细胞，造粒并用冰凉PBS洗涤两次。用含有蛋白酶抑制剂（Sigma，P-2714）和PMSF的100uL细胞提取缓冲液（Invitrogen FNN011）提取整个细胞裂解液，短暂超声并在4C下旋转1小时。在4C下离心30分钟后，去除上清液，并使用Bradford方法进行蛋白质定量。在4-12%Bis-Tris梯度凝胶上分离裂解物（siRNA实验为50μg，天然细胞系为100μg），并转移到PVDF膜上。然后，根据细胞信号蛋白方案，用1:1000 ALK（细胞信号，#3333）、磷酸化ALK（细胞信号，#3341）和1:5000肌动蛋白（Santa Cruz，sc-2352）孵育和洗涤膜。

致谢

作者感谢参与本研究的家庭和儿童，以及儿童肿瘤小组提供的标本。作者感谢Wendy London博士提供了与儿童肿瘤组肿瘤集相关的统计分析，Halfdan Rydbeck博士提供了链接分析的帮助，Mariusz Wasik博士提供了技术帮助，Judy Felgenhauer博士、Nadine Van Roy博士和Carmel McConville博士提供了神经母细胞瘤谱系。这项工作得到了NIH Grants K08-111733（YPM）、R01-CA78454（JMM）、R01-CA87847（JMM，意大利神经母细胞瘤基金会（LL）、约瑟夫·斯托克斯研究所应用基因组学中心（HH）、斯克里普斯基因组医学（at，NJS）、斯克利普斯·迪金森奖学金（at）和艾布拉姆森家族癌症研究所（JMM）。

参考文献

1Maris JM、Hogarty MD、Bagatell R、Cohn SL、神经母细胞瘤。柳叶刀。2007;369:2106–20.[公共医学][谷歌学者]
2Matthay KK等。儿童癌症组采用强化化疗、放疗、自体骨髓移植和13-顺式维甲酸治疗高危神经母细胞瘤。《新英格兰医学杂志》。1999;341:1165–73.[公共医学][谷歌学者]
三。Schwab M等人。c-myc相关基因在正常人类细胞和神经母细胞瘤中的染色体定位。自然。1984;308:288–91.[公共医学][谷歌学者]
4Attiyeh EF等。神经母细胞瘤中染色体1p和11q缺失与结果。N英格兰医学杂志。2005;353:2243–53.[公共医学][谷歌学者]
5Knudson AGJ，Strong LC。突变与癌症：神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤。美国人类遗传学杂志。1972;24:514–522. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Kushner BH、Gilbert F、Helson L.家族性神经母细胞瘤。病例报告、文献综述和病因学考虑。癌症。1986;57:1887–1893.[公共医学][谷歌学者]
7Maris JM等。家族性神经母细胞瘤的分子遗传学分析。《欧洲癌症杂志》。1997;33:1923–1928.[公共医学][谷歌学者]
8Friedman DL等人，《长期儿童癌症幸存者兄弟姐妹患癌症风险增加：儿童癌症幸存者研究报告》。癌症流行生物标志物预防。2005;14:1922–7.[公共医学][谷歌学者]
9Brodeur总经理Maris JM：神经母细胞瘤。Cheung N-KV，Cohn SL，编辑。施普林格；柏林，海德堡，纽约：2005年。第21-26页。[谷歌学者]
10Longo L等。家族性神经母细胞瘤的遗传易感性：在2p和12p两个新的基因组区域的鉴定。哼，这里。2007;63:205–11.[公共医学][谷歌学者]
11Maris JM等。染色体16p12-13遗传性神经母细胞瘤易感位点的证据。癌症研究。2002;62:6651–6658.[公共医学][谷歌学者]
12Perri P等。4p16与人类神经母细胞瘤易感性的弱联系。癌基因。2002;21:8356–60.[公共医学][谷歌学者]
13Amiel J等。先天性中央通气不足综合征中成对同源异型盒基因PHOX2B的多胺扩张和移码突变。自然遗传学。2003;33:459–61.[公共医学][谷歌学者]
14Mosse YP等。遗传性神经母细胞瘤中的生殖系PHOX2B突变。美国人类遗传学杂志。2004;75:727–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Trochet D等。神经母细胞瘤中成对同源框2B（PHOX2B）基因的种系突变。Am J Hum基因。2004;74:761–4. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Raabe EH等。神经母细胞瘤中PHOX2B突变的患病率和功能后果。致癌物。2008;27:469–76.[公共医学][谷歌学者]
17van Limpt V等人。Phox2B同源盒基因在散发性神经母细胞瘤中发生突变。致癌物。2004;23:9280–8.[公共医学][谷歌学者]
18Weiss WA、Aldape K、Mohapatra G、Feuerstein BG、Bishop JM。MYCN的靶向表达会在转基因小鼠中引起神经母细胞瘤。EMBO杂志。1997;16:2985–2995. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19.Osajima-Hakomori Y等。间变性淋巴瘤激酶在神经母细胞瘤中的生物学作用。《美国病理学杂志》。2005;167:213–22. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20.George RE等人。使用高密度单核苷酸多态性阵列对神经母细胞瘤进行全基因组分析。《公共科学图书馆·综合》。2007;2：e255。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Morris SW等。非霍奇金淋巴瘤中激酶基因ALK与核仁蛋白基因NPM的融合。科学。1994;263:1281–4.[公共医学][谷歌学者]
22Griffin CA等。炎症性肌纤维母细胞瘤中2p23的复发性受累。癌症研究。1999;59:2776–80.[公共医学][谷歌学者]
23Jazii FR等。通过蛋白质组学和食管癌中β-原肌球蛋白表达缺失鉴定鳞状细胞癌相关蛋白。世界胃肠病杂志。2006;12:7104–12. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Soda M等。非小细胞肺癌中转化EML4-ALK融合基因的鉴定。自然。2007;448:561–6.[公共医学][谷歌学者]
25Rikova K等人。磷酸酪氨酸信号的全球调查确定肺癌中的致癌激酶。单元格。2007;131:1190–203.[公共医学][谷歌学者]
26Torkamani A，新泽西州朔克。有害蛋白激酶多态性的准确预测。生物信息学。2007;23:2918–25.[公共医学][谷歌学者]
27Torkamani A，新泽西州斯科克。蛋白激酶中癌症驱动因子突变的预测。癌症研究。2008;68:1675–82.[公共医学][谷歌学者]
28Ikenoue T等。人类结肠直肠肿瘤中B-Raf激酶激活片段突变的功能分析。癌症研究。2003;63:8132–7.[公共医学][谷歌学者]
29Ikenoue T等。大肠肿瘤中富含B-Raf甘氨酸环内的点突变对有丝分裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶激酶/细胞外信息调节激酶和核因子-κB途径及细胞转化的不同影响。癌症研究。2004;64:3428–35.[公共医学][谷歌学者]
30.Kannan N，Neuwald AF.蛋白激酶调节机制是通过简单结构成分的精细化进化而来的吗？分子生物学杂志。2005;351:956–72.[公共医学][谷歌学者]
31Jeffers M等。人类癌症中met酪氨酸激酶受体的激活突变。美国国家科学院院刊。1997;94:11445–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Balak MN等。获得性激酶抑制剂耐药性的表皮生长因子受体突变型肺腺癌中新的D761Y和常见的继发性T790M突变。临床癌症研究。2006;12:6494–501.[公共医学][谷歌学者]
33Lee JW等。肺鳞癌中ERBB2激酶域突变。癌症快报。2006;237:89–94.[公共医学][谷歌学者]
34Lee JW等。胃癌、结直肠癌和乳腺癌中ERBB2激酶结构域的体细胞突变。临床癌症研究。2006;12:57–61.[公共医学][谷歌学者]
35Wang Q等。综合基因组学确定了神经母细胞瘤的不同分子类别，并显示DNA拷贝数的区域性改变以多个基因为靶点。癌症研究。2006;66:6050–62.[公共医学][谷歌学者]
36Vogelstein B，Kinzler KW.癌症基因及其控制的途径。自然医学。2004;10:789–99.[公共医学][谷歌学者]
37Maris JM等，与临床侵袭性神经母细胞瘤相关的染色体6p22位点。N英格兰医学杂志。2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Iwahara T等。ALK的分子特征，一种在神经系统中特异表达的受体酪氨酸激酶。致癌物。1997;14:439–49.[公共医学][谷歌学者]
39Chiarle R、Voena C、Ambrogio C、Piva R、Inghirami G。间变性淋巴瘤激酶在癌症发病中的作用。Nat Rev癌症。2008;8:11–23.[公共医学][谷歌学者]
40Lamant L等。ALK酪氨酸激酶基因在神经母细胞瘤中的表达。《美国病理学杂志》。2000;156:1711–21. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Motegi A、Fujimoto J、Kotani M、Sakuraba H、Yamamoto T。ALK受体酪氨酸激酶促进细胞生长和神经突起生长。细胞科学杂志。2004;117:3319–29.[公共医学][谷歌学者]
42Miyake I等人。间变性淋巴瘤激酶的激活是神经母细胞瘤细胞系中ShcC过度磷酸化的原因。致癌物。2002;21:5823–34.[公共医学][谷歌学者]
43Dirks WG等。间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因在肿瘤细胞系中的表达和功能分析。国际癌症杂志。2002;100:49–56.[公共医学][谷歌学者]
44McDermott U等。间变性淋巴瘤激酶的基因组改变可能使肿瘤对间变性淋巴瘤酶抑制剂敏感。癌症研究。2008;68:3389–95.[公共医学][谷歌学者]
45Wigginton JE，Abecasis GR.PEDSTATS：基因图谱数据的描述性统计、图形和质量评估。生物信息学。2005;21:3445–7.[公共医学][谷歌学者]
46Abecasis GR、Cherny SS、Cookson WO、Cardon LR、Merlin——使用稀疏基因流树快速分析密集遗传图。自然遗传学。2002;30:97–101.[公共医学][谷歌学者]
47Li M，Boehnke M，Abecasis GR.连锁和关联的联合建模：识别负责连锁信号的SNP。美国人类遗传学杂志。2005;76:934–49. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Yu N，等。利用电子细胞传感器阵列实时监测活细胞的形态变化：研究G蛋白偶联受体的方法。分析化学。2006;78:35–43.[公共医学][谷歌学者]
49.Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25:402–8.[公共医学][谷歌学者]