核因子(NF)-κB转录因子复合物由具有类似DNA结合特异性的相关蛋白二聚体组成。1典型的NF-κB通路由二聚体组成,包括RelA、c-Rel和NF-κ的B1(p50)。二聚体保存在与IκB(NF-κB抑制剂)家族蛋白的非活性细胞质复合体中。IκB激酶(IKK)磷酸化与NF-κB结合的IκB,引导IκB-泛素依赖性降解2并释放NF-κB二聚体进入细胞核。NF-κB的转录靶点包括细胞周期基因和细胞生存蛋白。替代途径利用RelB/NF-κB2(p52)二聚体,该二聚体主要由IKKα调节,并调节目标基因的主要不同亚群。三
对NF-κB信号转导的药物抑制剂的分析提供了关于NFκB在癌症中作用的不一致信息。已知抑制IKK依赖性NF-κB活性的抗炎药降低了溃疡性结肠炎患者结肠炎相关癌症的累积发病率,表明NF-κ的B在结肠肿瘤的发生和/或进展中发挥作用。4相反,NF-κB的抑制体内促进鳞状细胞肿瘤,5,6,7表明NF-κB在肿瘤发生中发挥细胞类型特异性作用的可能性。肠上皮细胞中IκKβ的失活可减少结肠肿瘤的形成,以应对化学致癌物,8这意味着IκKβ在促进肠细胞肿瘤发生中起着关键作用。NF-κB/Rel信号在许多原发性乳腺癌和淋巴恶性肿瘤中被激活。9,10,11乳腺癌细胞系和人类肿瘤中的核易位增加和p50、p52、c-Rel和Bcl-3的过度表达。10抑制肿瘤细胞系中NF-κB信号转导可增强化疗和放疗的敏感性,提示NF-κ的B在肿瘤维持中发挥作用。12总之,这些研究为NF-κB在乳腺肿瘤发病或进展中的作用提供了证据。11,13
受体酪氨酸激酶ErbB2(HER2/Neu)在30%以上的人类乳腺癌中过度表达。ErbB2在与ErbB1(表皮生长因子受体)、ErbB3和ErbB4的异聚复合物中发挥作用。ErbB2信号由包括异基因蛋白(HRG)的配体和结合异体受体的配体激活,如生长因子。14在对标准化疗耐药的转移性乳腺癌患者中使用针对ErbB2细胞外结构域的人源化单克隆抗体,在10%至15%的病例中产生缓解。15,16确定控制肿瘤进展的其他分子靶点是定制患者治疗的基础。先前对乳腺癌细胞生长中NF-κB的研究包括对IκB激酶的研究。NF-κB必需调节剂(NEMO)结合域(NBD)肽是IκB激酶(IKK)的抑制剂,可降低培养中HRG介导的SKBr3细胞增殖。17一种显性负性激酶抑制剂阻断了MDA-MB-231细胞的生长。18也抑制IκB降解的通用蛋白质组抑制剂PS-341和IKK抑制剂PS1145均抑制SKBr3细胞增殖。18
在理解NF-κB在乳腺癌中的作用方面,还有几个尚未解决的问题。首先,免疫反应在乳腺肿瘤发生中很重要。19将免疫细胞渗透到肿瘤微环境中,既可以促进肿瘤的发展和肿瘤细胞的存活,也可以发挥抗肿瘤作用。20免疫细胞分泌的干扰素具有抗肿瘤作用。21相反,已知肿瘤坏死因子(TNF)-α可刺激基因毒性分子(NO和活性氧物种)的产生。22因此,先前在免疫缺陷小鼠中使用异种移植物进行的研究中对乳腺癌NF-κB作用的解释可能被动物异常免疫状态所混淆。因此,利用免疫力低下的小鼠来辨别乳腺上皮细胞NF-κB在乳腺肿瘤生长中的作用仍然很重要。为此,我们检测了NF-κB在ErbB2诱导的肿瘤(来源于FVB小鼠,重新植入FVB宿主)中的作用。
其次,尽管IKK激酶抑制已被用于间接评估NF-κB在乳腺癌生长中的作用,但IKK复合物具有几个额外的功能,磷酸化其他底物,包括Akt和β-连环蛋白。23此外,IKKα的激酶依赖性功能已被很好地表征。24,25,26因此,以前的研究使用显性负激酶抑制剂或普通蛋白体抑制剂抑制IκB激酶活性并不一定仅反映NF-κB抑制。因此,我们在本文中检测了用NF-κB的主要抑制剂(IκβαSR)选择性抑制NF-κ子B的效果。第三,NF-κB的单个p65和p50组分在乳腺癌细胞增殖中的作用尚未明确确定;因此,本文使用选择性siRNA。最后,NF-κB调控肿瘤生长的机制体内并没有得到很好的理解。NF-κB调节乳腺肿瘤发生的机制尚不清楚。使用免疫竞争小鼠,我们证明NF-κB抑制可减少ErbB2诱导的乳腺肿瘤血管生成。在此,我们证明了NF-κB调节的分泌因子在新生血管测定中的作用。
材料和方法
细胞培养、逆转录病毒感染、试剂和报告分析
293T,MCF-7(ERα+),MCF10A(ERα+),SKBr3(ERα−)和来自MMTV-ErbB2转基因小鼠乳腺肿瘤的NAFA小鼠乳腺细胞系27按照描述进行培养。27,28IκBαSR逆转录病毒表达载体亚克隆为生态RI片段进入MSCV IRES-GFP载体29如前所述制备病毒上清液。29NF-κB反应性报告子3xRel-luc和编码活化Neu的表达载体先前已有描述。30根据制造商的协议,使用Superfect转染试剂(Qiagen,Valencia,CA)或GeneJuice转染试剂进行转染。萤火虫萤光素酶的相对活性通过根据雷尼利亚荧光素酶活性。使用学生的t吨-测试。试剂TNF-α(西格玛,密苏里州圣路易斯)、HRG(明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems)和Bay11-7082(西格马)的使用如文所述。
MTT、流式细胞仪分析、DNA合成分析和细胞凋亡分析
细胞生长通过3-[4,5-二甲基噻唑-2yl]-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)分析测定。细胞以1×10的比例进行培养496 well微量滴定板中每孔的细胞数。孵育指定时间后,向每个孔中添加MTT(5 mg/ml),并孵育4小时。在570 nm波长的微孔板阅读器上记录吸光度。DNA合成分析[三H] 胸腺嘧啶核苷(TdR)掺入如前所述。31,32流式细胞术分析S期。根据制造商的方案使用Annexin V-PE凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,Franklin,NJ),然后使用流式细胞术。
软琼脂中的菌落形成、3D细胞培养和Western印迹
单元格(n个=4000)接种到0.3%软琼脂(Sigma)悬浮培养皿中(Nalge Nunc International,Rochester,NY)。菌落用0.04%结晶紫醋酸盐染色,培养2周后在垂直显微镜下计数。对于3D培养,将感染IκBαSR或GFP控制载体的MCF10A/NeuT(ErbB2*)和NAFA细胞重新悬浮在Dulbecco改良的Eagle’s培养基中至1×104将等体积的细胞溶液和生长抑制的Matrigel(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)混合,然后将此混合物中的2000个细胞应用于预冷四孔室。凝胶凝固后,加入培养基,让细胞在5%的CO中生长237°C的加湿培养箱。培养基每3-4天更换一次。如前所述,对菌落大小和形态进行监测并进行光记录。33
使用以下抗体进行蛋白质印迹分析:p65(Rockland Immunochemicals Inc.,Gilbertsville,PA)、p50(Upstate,Lake Placid,NY)、磷酸化p65(93H1;Cell Signaling,Danvers,MA)、Akt1(2H10,Cell Signoaling)、磷酸化Akt1,Erk1(C-16,Santa Cruz Biotechnology)、Erk2(C-14,Santa Cruz Bintechnologies)、FLAG(C-21,Santa Cruz BietechnologY)、IκBα(C19,Santa Crouz Bietchnological)和负载控制鸟嘌呤解离抑制剂(GDI)或β-肌动蛋白(Upstate)。
核提取物和NF-κB转录因子检测
根据制造商的说明(Sigma),使用CelLytic Nuclear提取试剂盒分离核提取物。为了评估NF-κB的p50和p65亚单位的DNA结合,我们使用了一种转录因子检测试剂盒,该试剂盒结合了电泳迁移率变化检测和酶联免疫吸附检测的原理,符合制造商的说明(Chemicon International,Temecula,CA)。
小干扰RNA转染
针对NF-κB p105(J-003520-09-0010,NM-003998)、NF-κ)B p65(J-003533-08-0010,NM-021975)和非靶向siRNA(D-001810-03)的小干扰RNA(siRNAs)从Dharmacon RNA Technology(Lafayette,CO)获得。根据制造商的方案,用寡病毒转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)和siRNA(100 nmol/L)培养SKBr3细胞(60%融合液)。使用Nucleofector Kit V和程序T-024(Amaxa Biosystems,Gaithersburg,MD)通过Nucleofector技术转染MCF10A/ErbB2*细胞。通过来自Qiagen的非沉默荧光标记siRNA监测转染效率。
免疫组织化学
根据制造商手册,使用EnVision Kit(DAKO,Carpindia,CA)进行免疫组织化学染色。使用的主要抗体为CD31(CM303A,1/50;加州康科德市Biocare Medical)、vWF(A0082,1/500;DAKO)、血管内皮生长因子(VEGF)(SC-507,1/250;圣克鲁斯生物技术)、VCAM-1(SC-8304,1/250,圣克鲁斯生技技术)。使用的二级抗体是抗小鼠或兔辣根过氧化物酶标记聚合物。使用菁3(Cy-3)标记的酪胺扩增系统(马萨诸塞州波士顿Perkin Elmer生命科学公司)对信号进行可视化。切片安装在含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚作为核复染物的水性介质中(Vector Laboratories,Burlingame,CA)。用非免疫兔IgG代替一级抗体,进行阴性对照,以确保荧光免疫染色的特异性。
如前所述,测定肿瘤的微血管密度。31这些图像是使用奥林巴斯(日本东京)BX61共焦显微镜拍摄的。使用线性编码机动化John Ojelfo博士(华盛顿乔治敦大学)提供的XY阶段(新泽西州普赖尔),在×200处量化血管。在五个不同的肿瘤切片中至少量化了20个区域。CD31阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇被视为单个血管。每平方毫米肿瘤组织中毛细血管的数量使用配备10×1mm×10mm分划的×10目镜进行量化,并以网格面积的百分比表示。对于对照组,分析五个不同肿瘤样本中的30个区域。每个实验组至少统计100个田地。
血管生成和分泌蛋白测定
人脐静脉内皮细胞取自LifeLine Cell Technology(Walkersville,MD)。安体外血管生成试剂盒(目录号ECM625)来自Chemicon International。简单地说,用ECMatrix凝胶涂覆96周的组织培养板,并使其在37°C下固化1小时。人脐静脉内皮细胞计数并接种于1×104细胞/孔。向细胞中加入100μl来自NAFA-GFP或NAFA-IκBαSR的无血清条件培养基。孵育6小时后,监测试管形成,并在×10倍放大下拍摄相位对比照片。使用Metamorph软件(加利福尼亚州桑尼维尔的Molecular Devices)中的血管生成管形成程序对管长度和管数进行量化。每个实验一式三份,重复三次。如前所述,NAFA和NAFA-IκBαSR细胞系分泌的蛋白质的相对丰度由细胞因子/趋化因子阵列测定。34
FVB和裸鼠研究
感染稳定表达IκBαSR蛋白或其载体对照的NAFA细胞,通过胰蛋白酶化培养和收获,洗涤,并用PBS在2×107将等分试样(0.1ml)注射到4周大的FVB小鼠的乳腺中,或皮下注射到从美国国家癌症研究所(Rockville,MD)购买的4至6周大的BALB/c无胸腺雌性裸鼠中。每周用数字卡尺测量小鼠肿瘤的发育情况,并在注射后4周拍摄照片。
结果
ErbB2诱导NF-κB活性
为了系统地检测NF-κB在乳腺上皮细胞癌基因诱导信号传导中的作用,使用ErbB2的激活突变体进行分析。为了确定ErbB2是否直接激活NF-κB转录活性,在MCF-7和MCF10A细胞中检测了荧光素酶报告基因与MHC I类增强子NF-κ的三个串联重复序列的融合。ErbB2*(NeuT)激活突变体在MCF-7和MCF10A细胞中诱导NF-κB报告活性增加4.5倍人细胞周期蛋白D1启动子编码NF-κB反应性报告元件30,35ErbB2*同样将cyclin D1启动子激活六倍(数据未显示)。为了确定内源性NF-κB在调节多聚NF-kb B反应元件活性中的作用,我们使用了NF-kB信号的显性抑制剂(IκBαSR)和NF-kb信号的化学抑制剂。IκBαSR是IκB-α抑制剂的一种突变形式,其中位于32和36位的丝氨酸已被改变为丙氨酸,对磷酸化和蛋白质体降解具有抵抗力,因此作为NF-κB活性的一种强效和特异性抑制剂发挥作用。我们之前通过EMSA表明,IκBαSR抑制核提取物中的NF-κB结合。NF-κB的特异性化学抑制剂,Bay 11-7082,36抑制ErbB2诱导的NF-κB报告活性*.IκBαSR抑制NF-κB活性,使用ErbB2*瞬时转导的MCF-7细胞中的多聚NFκBreporter结构进行检测,从四倍到五倍到两倍和MCF10A细胞由致癌ErbB2*转化约45%.IκBαSR的表达抑制了ErbB2对SKBr3和NAFA细胞中p50和p65 DNA结合活性的诱导约60%至50%.IκBαSR抑制SKBr3和NAFA细胞系中3xRel-luc报告活性~50%总之,这些研究证实了先前的研究,即ErbB2在其他细胞系中诱导NF-κB报告活性,并证明IκBαSR表达抑制p50和p65结合活性。
ErbB2诱导NF-κB活性。使用多聚NF-κB结合位点(3xRel-luc)荧光素酶报告子和NF-κ)B结合分析评估NF-κ的活性。A类:用激活ErbB2*突变体(NeuT)的表达载体或对照质粒转染MCF-7细胞。NF-κB抑制剂Bay 11-7082降低了3xRel-luc报告活性(左边)或用编码IκBαSR的表达载体转染(正确的).B类:用NF-κB抑制剂Bay 11-7082处理瞬时转染ErbB2*表达载体的MCF10A细胞(左边)或用ErbB2*表达载体和IκBαSR表达载体稳定转导,测定相对荧光素酶活性(正确的).C类和日期:NF-κB结合活性(C类)或荧光素酶报告活性(天)在用IκBαSR表达载体稳定转导的SKBr3和NAFA细胞中测定。数据是相对荧光素酶活性(平均值±SEMn个>五次单独转染)。
癌基因诱导的接触无关生长需要NF-κB
为了确定NF-κB的单个p50和p65组分在乳腺癌细胞增殖中的作用,我们使用了特异性NF-κ的B siRNA.siRNA-p65选择性降低MCF10A/ErbB2中p65的丰度*或SKBr3(未显示数据)。p50 siRNA选择性降低p50的丰度(以及未示出的数据)。细胞增殖,通过MTT分析测定或细胞计数在MCF10A/ErbB2*细胞和SKBr3细胞中,被p50或p65 siRNA降低(数据未显示)。MTT法测定IκBαSR降低MCF10A/ErbB2*增殖(,左)和细胞生长曲线((左)在第4天增加约40至50%,类似于p65 siRNA的作用(; 中间)或p50 siRNA(; 右侧)。这些研究首次证明了NF-κB复合体的单个p50和p65组分在ErbB2*诱导的人类乳腺癌细胞系细胞增殖中的重要性。
NF-κB组分p50和p65控制ErbB2诱导的细胞增殖。A类:用p65或p50 siRNA转导的MCF10A/ErbB2*(NeuT)细胞进行Western blot。用siRNA转染MCF10A对照细胞或稳定表达ErbB2*的MCF10细胞,转导48小时后进行Westernblot分析。如图所示,使用抗体进行Western blot分析。B类和抄送:使用MTT测定法对p50或p65 siRNA转导的MCF10A细胞系进行细胞增殖测定(B类)或细胞计数(C类). 用编码ErbB2*(NeuT)或对照载体(Vec)的表达载体以及PCMV-IκBαSR或亲代对照载体(GFP)稳定转染MCF10A细胞系。按照材料和方法中的描述,每天对细胞进行等量的MTT分析。数据显示为三个单独实验的平均值±SEM*P(P)< 0.05; **P(P)< 0.01.
为了扩展这些研究,检测了乳腺癌细胞系(NAFA、MCF10A/ErbB2*、SKBr3)(以及未示出的数据)。为了确定NF-κB在维持ErbB2诱导的细胞DNA合成或接触依赖性生长中的作用,使用逆转录病毒表达质粒(MSCV-FLAG-IκBαSR-IRES-GFP)。用编码IκBαSR的表达载体转导细胞,以确定内源性NF-κB活性在维持细胞周期分布和接触依赖性生长中的作用。Western blot证实IκBαSR转基因表达使用化学抑制剂Bay 11-7082抑制NF-κB活性可抑制SKBr3、NAFA和MCF10A/ErbB2*细胞的集落生长(数据未显示)。因此,NF-κB活性是ErbB2表达乳腺癌细胞在培养中接触依赖性生长所必需的。未观察到磷酸化-ERK或磷酸化-Akt的抑制作用,另外两种已知的途径可促进乳腺上皮细胞的增殖(补充图S1可在网址:http://ajp.amjpathol.org). 用编码IκBαSR的表达载体转导这些细胞系可显著降低细胞增殖(; 左),通过菌落形成评估抑制接触诱导依赖性生长(; 右),并且通过抑制NF-κB活性降低细胞周期DNA合成阶段的细胞比例(; 中间)。总之,这些研究证明了NF-κB信号通路在维持乳腺癌细胞系的DNA合成和接触依赖性生长中的重要作用。
内源性NF-κB维持乳腺癌上皮细胞接触诱导的依赖性生长和DNA合成。采用流式细胞术和集落形成分析对三种用编码IκBαSR的逆转录病毒表达载体或对照载体稳定转导的乳腺癌细胞系进行细胞周期分析。数据显示为平均值±SEMn个>三个单独的实验。A类和抄送:NAFA中IκBα的蛋白质印迹(A类)MCF10A和MCF10A-ErbB2*(C类).B类和日期:MTT法测定细胞增殖(左边),细胞周期分布由FACS评估(中间的),并通过计算菌落数分析菌落形成(正确的). *P(P)< 0.05; **P(P)< 0.01.
三维矩阵中ErbB2诱导生长需要NF-κB
乳腺上皮细胞在基底膜上生长时形成三维结构。自发永生化的人腔上皮细胞系MCF10A在3D Matrigel中生长时形成球形结构。37为了研究ErbB2*通过NF-κB调节乳腺细胞生长的机制,使用了人永生化MCF10A细胞。MCF10A细胞的ErbB2*转导导致细胞形态改变,特征为纺锤状外观(,顶部)。IκBαSR转导的ErbB2*表达细胞具有中间形态,显著减少细长和纺锤形(,底部)。与不在软琼脂中生长的MCF10A细胞相比,ErbB2*转导的MCF10细胞形成集落(,右侧)。通过Western blotting直接比较MCF10A-或ErbB2*转导的MCF10A细胞,发现ErbB2*-转导细胞中p50和RelA(p65)的表达增加(数据未显示)。
在3D培养中,NF-κB是ErbB2诱导的乳腺腺泡生长中断所必需的。A类和抄送:MCF10A/ErbB2*(NeuT)细胞(A类)或NAFA(C类)IκBαSR-IRES-GFP转导的细胞(A类和C类,底部)或控制GFP矢量(A类和C类,顶部)生长在3D Matrigel培养基中。免疫荧光和相差显微镜显示多叶结构。用IκBαSR抑制NF-κB活性可将转化后的形态恢复为未转化乳腺上皮细胞观察到的球形形态。33MCF10A/ErbB2*(NeuT)的体积(B类)和NAFA(天)通过IκBαSR的表达,3D中生长的菌落减少了60-80%。E类和德国:MCF10A/ErbB2*的H&E染色(E类)和NAFA(G公司)在3D Matrigel中生长的细胞株显示GFP控制的实心球和IκBαSR表达细胞的空心球(F类和H(H))显示为平均数据的相对数。我和J:MCF10A/ErbB2*和NAFA细胞p50的免疫组织化学染色*P(P)< 0.05; **P(P)< 0.01.
小鼠乳腺上皮细胞也在3D Matrigel中形成球状结构。38因此,我们检测了NF-κB在3D Matrigel中NAFA细胞形态中的作用。NAFA细胞是来源于MMTV-ErbB2转基因小鼠的乳腺上皮细胞。NAFA细胞生长为结构紊乱的复杂多腺泡结构(,顶部),类似于转导ErbB2的MCF10A细胞的形态。33然而,用IκBαSR转导的NAFA细胞在3D Matrigel中生长为球形,类似于未转化的小鼠乳腺上皮(,底部)。38
通过抑制NF-κB活性,在3D Matrigel中生长12天的MCF10A/ErbB2*和NAFA细胞腺泡的平均体积减少了约60至80%这些研究表明,IκBαSR在二维(2D)和三维培养中抑制ErbB2*诱导的乳腺上皮细胞生长,与细胞周期蛋白D1丰度和pRb磷酸化减少相关,而不影响细胞周期蛋白a或细胞周期蛋白E丰度(数据未显示)。3D培养的组织学分析表明,IκBαSR表达细胞增加了空心球的发生率,中心管腔周围的上皮趋向极化。在MCF10-ErbB2*和NAFA细胞系中都观察到这种趋势免疫组织化学分析显示IκBαSR表达细胞中p50免疫染色减少总之,这些研究证明了NF-κB在ErbB2*环境下维持接触依赖性生长中的重要作用。
NF-κB是生长因子诱导乳腺癌细胞DNA合成和生存所必需的
观察到NF-κB介导ErbB2*诱导的接触诱导依赖性生长后,我们研究了内源性NFκB对ErbB2*在细胞增殖、DNA合成、细胞周期和生存方面的作用。人乳腺癌细胞系SKBr3(过表达ErbB2)和NAFA(小鼠乳腺细胞系)经IκBαSR逆转录病毒或对照转导后,暴露于HRG。HRG增加三H-胸腺嘧啶掺入量为~30%(SKBr3)或~40%(NAFA)(补充图S2、A和B,左侧;可在http://ajp.amjpathol.org). HRG增加了DNA合成(S)阶段的细胞比例,并降低了G阶段的比例1阶段。IκBαSR的表达消除了HRG诱导的S期细胞比例增加(补充图S2,A和B,右侧;可在http://ajp.amjpathol.org). IκBαSR的表达通过MTT分析消除了HRG诱导的细胞生长(补充图S2,A和B,中间;可在http://ajp.amjpathol.org).
为了确定内源性NF-κB在细胞凋亡中的作用,使用PE标记的膜联蛋白V结合来识别SKBr3和NAFA细胞培养物中的凋亡和坏死细胞,这些细胞是用IκBαSR表达的逆转录病毒或对照转导的。NF-κB抑制不会改变基础细胞凋亡率,但NF-κB抑制使TNF-α暴露细胞的凋亡率在SKBr3培养基中从3.1%增加到6.4%,在NAFA培养基中从2.9%增加到9.0%(补充图S2、C和D,可在http://ajp.amjpathol.org). 这些发现与先前的研究一致,该研究表明NF-κB抑制增加了TNF-α诱导的3D Matrigel中生长的乳腺癌细胞系的凋亡。39
NF-κB是ErbB2诱导免疫功能和免疫功能缺陷小鼠肿瘤生长所必需的
乳腺肿瘤的生长受到来自局部炎症细胞的异型信号的调节。40因此,我们研究了IκBαSR在调节ErbB2*诱导的免疫小鼠肿瘤生长中的作用。衍生出NAFA系的MMTV-ErbB2转基因小鼠是FVB株,可以在FVB小鼠中进行分析。通过蛋白质印迹分析证实了IκBαSR表达载体的存在比较用IκBαSR载体或对照载体转导的NAFA细胞在免疫力低下的小鼠中评估NAFA细胞的生长。每组由12只单独的动物组成,均发生肿瘤。通过IκBαSR表达,4周时肿瘤体积减少80%这些研究表明,NF-κB参与维持免疫力低下小鼠移植性肿瘤上皮细胞的生长体内.
NF-κB是ErbB2诱导的免疫缺陷小鼠乳腺肿瘤生长所必需的。A类:IκBαSR蛋白的FLAG表位。B类:表达IκBαSR和对照NAFA细胞植入FVB株小鼠后4周内的肿瘤体积(n个=每组12人)。数据显示为平均值±SEM。箭头代表乳腺肿瘤。C类:将IκBαSR或对照载体转导的NAFA细胞植入裸鼠体内。显示了肿瘤大小的典型示例(左边),以及表达IκBαSR的NAFA细胞或对照载体在裸鼠中进行的肿瘤生长曲线(n个=每组20人)(正确的).天:在三只单独的裸鼠中用IκBαSR表达载体或对照载体转导的NAFA细胞源性肿瘤的代表性Western blot分析*P(P)< 0.05; **P(P)< 0.01.
为了确定乳腺上皮细胞IκBαSR的抑制作用是否涉及免疫系统,在雌性BALB/c裸鼠中进行了植入实验这些小鼠是非对称的,具有缺陷的细胞介导免疫反应。植入后27天,IκBαSR表达使平均肿瘤体积减少约50%通过Western blot分析,在切除的载体控制细胞肿瘤(GFP)中检测到内源性IκBα的存在。由于3xFLAG表位,转导的IκBαSR被检测为一个较高分子量的带这些研究表明,乳腺上皮肿瘤细胞NF-κB也参与维持免疫缺陷小鼠体内植入的乳腺肿瘤上皮细胞的生长体内.
NF-κB通过VEGF调节乳腺上皮细胞肿瘤血管生成
直接检测乳腺肿瘤IκBαSR的表达表明,与类似大小的肿瘤相比,血管减少。因此,如前所述,通过对血管计数对新生血管进行定量分析.31与表达对照载体的大小匹配的肿瘤相比,IκBαSR的表达使微血管密度降低了50%以上表达IκBαSR的ErbB2肿瘤的血管减少在组织形态计量学和免疫组织化学分析中也很明显[苏木精-伊红(H&E)染色和CD31免疫组织化学染色显示]. 然后我们检测了候选促血管生成细胞外基质(ECM)整合素结合蛋白,以进一步探讨NF-κB促进乳腺肿瘤血管生成的机制。β1α4整合素结合蛋白VCAM1和αvβ3结合ECM蛋白vWF均无大量变化相反,VEGF的丰度在抑制乳腺上皮细胞NF-κB活性方面显著降低体内 为了确定乳腺上皮细胞NF-κB调节血管生成的机制,我们考虑了NF-κ)B调节分泌因子的可能性。利用人脐静脉内皮细胞进行血管生成检测,IκBαSR转导的NAFA细胞的上清液通过血管分支的数量和长度评估减少新生血管生成因此,NF-κB诱导了刺激血管生成的因子的分泌,而抑制NFκB活性则会减少这些因子的分泌。
ErbB2诱导的乳腺肿瘤中的血管生成是NF-κB依赖性的。答:ErbB2*诱导的乳腺癌(NAFA)表达控制载体(GFP)或IκBαSR的分析(n个=每组5只),以测定微血管密度。B类:H&E染色组织病理学(左边)或用CD31抗体进行免疫染色以标定肿瘤血管(正确的)到哪个(箭头)点。C类:候选促血管生成因子的免疫组织化学染色(左边)和促血管生成因子免疫组织化学染色定量,显示为平均值±SEM(正确的).天:用来自控制载体或IκBαSR转导的NAFA细胞的培养基处理人脐静脉内皮细胞进行血管生成分析(左边)以及通过分支数量和长度对血管形成进行定量(正确的). *P(P)< 0.05; **P(P)< 0.01. 原始放大倍数,×40。
我们最近的研究表明MMTV-ErbB2转基因小鼠循环中VEGF的丰度增加(180 mg/ml对43 mg/ml)。41为了确定NAFA细胞分泌的NF-κB调节蛋白,使用细胞因子阵列分析NAFA和NAFA-IκBαSR的上清液中分泌的趋化因子和细胞因子.34然后进行减法分析以确定NF-κB调节的分泌蛋白VEGF是NAFA细胞分泌的一种蛋白,VEGF的分泌依赖于NF-κB。其他一些分泌因子被鉴定为NF-κB调节,包括GM-CSF和ACRP-30。
NF-κB调节蛋白质分泌。答:使用细胞因子阵列测定NAFA与NAFA-IκBαSR细胞上清液中分泌蛋白的相对丰度。34 B类:培养24小时后,从等量的细胞中分析上清液。丰度降低表明IκBαSR受到抑制。数据是三个单独实验的平均值±SEM。
讨论
由NF-κB介导的免疫反应参与促进乳腺肿瘤的发生。19,40骨髓巨噬细胞被招募到小鼠乳腺肿瘤中,促进乳腺肿瘤的生长。通过CSF1招募的F4/80染色巨噬细胞与肿瘤血管生成增加相关。相比之下,免疫细胞分泌的TNF-α具有显著的抗肿瘤作用。先前的研究使用免疫缺陷小鼠检测了乳腺上皮细胞NF-κB在细胞生长中的作用。17目前的研究在几个方面扩展了先前的观察结果。首先,这些研究表明,在免疫力低下的小鼠中,乳腺癌生长需要乳腺上皮细胞NF-κB体内其次,这些研究证明了乳腺上皮细胞NF-κB在促进血管生成中的功能意义体内第三,这些研究表明乳腺肿瘤NF-κB通过一种异型分泌因子调控血管生成。第四,ErbB2诱导p50和p65结合活性,并使用特定的siRNA,当前的研究表明NF-κB、p50和p65的特定亚组分有助于ErbB2-诱导的乳腺癌细胞增殖。p50和Rel-A丰度增加与ErbB2主要激活NF-κB信号传导的典型途径一致。
目前的研究表明,ErbB2诱导免疫缺乏小鼠肿瘤发生体内涉及NF-κB信号传导。NF-κB增强血管生成和VEGF表达体内我们的研究扩展了之前在细胞培养中进行的研究。NF-κB信号传导是两种ERα中DNA合成和接触依赖性生长所必需的+(MCF-7,MCF10A)和ERα−(SKBr3,NAFA)培养的乳腺癌细胞系。表达低水平ERα的乳腺癌细胞表达高NF-κB活性和ERα−细胞显示组成性活性NF-κB。11通过去除雌二醇而失去雌激素信号也会导致NF-κB活性,这可能有助于培养的人类乳腺癌细胞的激素依赖性。42
ErbB2诱导细胞周期蛋白D1在组织培养中的表达27并且在此ErbB2诱导的细胞周期蛋白D1体内通过NF-κB依赖机制。伴随着磷酸化形式中pRb比例的增加,允许细胞周期进入。细胞周期蛋白D1是ErbB2诱导的肿瘤发生所必需的,因为细胞周期蛋白D_1反义可以阻止ErbB2-诱导的肿瘤生长27和细胞周期蛋白D1敲除小鼠对ErbB2诱导的肿瘤发生具有抵抗力。细胞周期蛋白D1是一个已知的NF-κB激活靶点,因为启动子中−30到−39 bp的NF-kb结合序列。30,35在这里报道的研究中,p50和RelA的丰度增加伴随着ErbB2活性诱导的NF-κB信号的增加。在用血清激活或表达Rac1激活突变的3T3细胞中,细胞周期蛋白D1启动子NF-κB结合序列结合增加了p50/RelA异二聚体和p50同源二聚体的丰度。Rac的显性阴性突变体(N17Rac)抑制ErbB2诱导的向细胞周期蛋白D1启动子的信号传导,并减少p50/RelA异二聚体与细胞周期蛋白D1启动子的结合。30,35因此Rac也参与ErbB2激活NF-κB的途径。总之,这些发现表明细胞周期蛋白D1是ErbB2-NF-κB信号传导的下游靶点。
降低NF-κB活性的当前研究体内NF-κB的主要抑制剂与先前对IκB激酶的研究一致。IκB激酶的肽抑制剂NEMO在组织培养中阻断乳腺癌细胞增殖。17IKKβ的显性阴性突变体也抑制裸鼠的异种乳腺移植。然而,IκB激酶激活NF-κB的其他底物,包括Akt和β-catenin,23两者都能促进乳腺肿瘤的生长。31,43目前的发现与IκB激酶突变的转基因小鼠的乳腺癌抗性一致。然而,IKKα突变小鼠在乳腺发育方面存在严重缺陷。44 IKK公司α不适用IKKα激活环中存在抑制性突变的小鼠,其肺泡末乳芽发育失败,类似于MMTV-IκBαSR小鼠或细胞周期蛋白D1−/−老鼠。44两组乳腺中的细胞周期蛋白D1均较少IKK公司αA/A公司和MMTV-IκBαSR转基因动物。细胞周期蛋白D1由IKKα诱导,其启动子是IKK的直接转录靶点。23
在目前的研究中,乳腺上皮细胞NF-κB增强了血管生成体内.体外培养表明,乳腺上皮细胞NF-κB调节组织培养中一种分泌因子的产生,该分泌因子可增强血管生成。细胞因子阵列分析显示NF-κB诱导NAFA细胞分泌VEGF。实体瘤的生长体内直径超过1至2mm的肿瘤需要诱导和维持肿瘤血管生成。45肿瘤血管生成是促血管生成因子(包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和VEGF)产生增加和抗血管生成因子如血小板反应蛋白1表达减少的结果。46缺氧和细胞因子导致人类肿瘤中VEGF丰度增加。癌基因,包括Ras和Src激活Raf/MAPK途径,诱导乳腺上皮细胞中VEGF转录。47VEGF结合异二聚体整合素αvβ5。48整合素在新合成的血管中表达,并允许内皮细胞和细胞外基质(ECM)之间的相互作用。αV整合素与包含RGD序列的ECM成分结合,例如vWF,而β1α4整合素结合VCAM。48NF-κB不调节整合素配体vWF和VCAM的丰度。PECAM-1/CD31,免疫球蛋白超家族的粘附受体成员,在内皮细胞上表达以调节肿瘤血管生成49被乳腺上皮细胞NF-κB抑制而减少体内.
ErbB2在~30%的人类乳腺癌中过度表达,是乳腺癌治疗的重要靶点,但85%的患者对抗ErbB2-单克隆抗体治疗产生耐药性。抑制NF-κB可提高化疗敏感性。50在这些实验中观察到NF-κB抑制ErbB2肿瘤发生,这为在人类乳腺癌中靶向NFκβ提供了进一步的理论基础。