结果
STIM1通过Orai1依赖和独立机制在ER-PM交界处积聚
我们最初研究了STIM1和Orai1在存储耗尽后形成点状突起是否依赖于这两种蛋白的共同表达。当在HEK 293细胞中自身表达时,mCherry-labeled STIM1(mCh-STIM1)在Ca耗尽后形成明显的斑点2+使用thapsigargin(TG)的商店(). 相反,单独表达的GFP-myc-Orai1对TG没有形成点状反应()但mCh-STIM1的共表达恢复了其形成穿孔的能力(). 这些结果表明,STIM1向ER-PM连接的募集独立于Orai1,而Orai1向这些位点的募集依赖于与STIM1或STIM1相关蛋白的结合(Xu等人,2006年).
STIM1多基结构域的缺失区分了ER-PM交界处STIM1积累的Orai1依赖和独立机制(A) 在HEK 293细胞中单独表达的野生型mCh-STIM1在TG(0 Ca+TG)耗尽后从弥散ER分布(Rest)重新分布到细胞外周。耗尽后,在细胞足迹上可以看到点状突起。(B)eGFP-myc-Orai1单独表达时不会在耗尽后重新分布成点状突触。(C) 当同时表达时,STIM1和Orai1在存储耗尽后形成共定位点。(D) 与野生型STIM1不同,STIM1-ΔK单独表达不能形成punta;然而,当与Orai1共表达时,这两种蛋白在存储耗尽后形成共定位点(E)。(F) 存储耗尽激活I中俄国际商用飞机有限责任公司在表达STIM1-ΔK和Orai1的HEK 293细胞中,证明多基区对I中俄国际商用飞机有限责任公司激活。所有的图像都是使用共聚焦显微镜拍摄的细胞足迹。比例尺,10μm。
为了确定穿孔形成所必需的STIM1区域,我们研究了多基C末端结构域(aa 672–685)的作用。在一些研究中,已报告删除该区域(STIM1-ΔK)以防止穿孔形成和SOC激活(Huang等人,2006年;Liou等人,2007年)但其他人没有(Li等人,2007年). 我们发现,当STIM1-ΔK在HEK 293细胞中单独表达时,在存储耗尽后未能形成点状突起(); 然而,当与Orai1一起表达时,这两种蛋白共同定位于puncta并激活I克拉克存储耗尽后(). 这些数据表明,在没有Orai1的情况下,需要多基结构域将STIM1定位到ER-PM连接,但第二个结构域在这些位置招募并激活Orai1。
确定打开CRAC通道的STIM1的最小细胞溶胶区域
为了鉴定STIM1的CRAC激活结构域,我们首先测试了一系列可溶性胞质STIM1片段激活NFAT依赖性萤光素酶报告基因的能力(NFAT-卢克). 通过逐步截断STIM1全长细胞溶质区生成一系列结构(; STIM1型234–685; CT-STIM1),并在含有NFAT-卢克因为NFAT依赖性转录需要细胞内钙的持续升高2+([钙2+]我)结合佛波酯激活蛋白激酶C(PKC)NFAT-卢克使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐(PMA;1μM)不会刺激荧光素酶的产生。然而,PMA与1μM TG结合,激活Ca2+通过内源性CRAC渠道进入,激活NFAT-卢克显著地(). 因此,我们比较了PMA和PMA+TG中荧光素酶的产生,以评估STIM1片段激活内源性CRAC通道的能力。
CAD作为CRAC通道激活剂的有效性鉴定(A) 全长STIM1及其假定功能域(顶部)和STIM1的截断版本(D1-D9;底部),CAD以灰色显示。(B) 转染野生型(WT)或截短型(D1-D9)STIM1构建物的HEK 293T(NFAT-Luc)细胞中NFAT依赖性荧光素酶活性。如图所示,用1μM PMA或1μM TG+PMA处理细胞。D5(CAD)是激活NFAT所必需和足够的最小区域。数据显示为平均值±sem(n=4)。(C) CAD激活SOCE而不消耗细胞内钙2+商店。平均[Ca2+]我(±sem)在未转染的HEK 293细胞(黑色;n=28)和表达CAD+Orai1(红色;n=15)、CAD+Oracle 1的细胞中E106A型(灰色;n=17),或CAD(342-440)+Orai1(蓝色;n=12)。(D) (左)I中俄国际商用飞机有限责任公司在联合转染WT-GFP-STIM1+myc-Orai1的代表性细胞中生长缓慢。在2 mM Ca中短脉冲至−100 mV期间记录的电流2+o(o)绘制了断裂后的时间。(右)I的特征I–V关系克拉克以20 mM Ca记录2+o(o)来自同一个单元格。(E) (左)I中俄国际商用飞机有限责任公司在与YFP-CAD+myc-Orai1共转染的代表性细胞中具有组成活性。电流按D(右)I–V关系绘制,以20 mM Ca记录CAD感应电流2+o(o)来自同一个单元格。(F) 单独转染CAD或Orai1,或与myc-Orai1和GFP-STIM1、YFP-CAD或YFP-CT-STIM1共同转染的细胞中的电流密度。20 mM Ca电压斜坡期间在−100 mV下测得的电流2+o(o)归一化为电池电容。显示了4-5个细胞的平均值±sem。
虽然CT-STIM1不能单独用PMA激活NFAT报告基因,但截断该蛋白的C-或N-末端会产生几种活性STIM1肽(D3、D5、D6)。通过进行额外的截断,我们确定了STIM1342–448(D5)作为足以激活的最小肽NFAT-luc;我们在下文中将此域称为C类RAC公司一激活d日omain(CAD)。Western分析表明,肽D1、D2、D4和D7-9的失活并非由于表达不足(补充图1A). CAD包含一个假定的螺旋线圈和STIM1的ERM域的一部分,在脊椎动物和无脊椎动物中高度保守秀丽线虫到智人实际上与STIM2中的序列相同,即另一个ER-Ca2+控制CRAC通道激活的传感器(Brandman等人,2007年) (补充图2).
确定CAD是否激活存储操作的Ca2+我们测量了细胞内的[Ca2+]我在表达CAD和Orai1的HEK 293细胞中。CAD诱发持续[Ca2+]我依赖细胞外钙的升高2+()被CRAC通道抑制剂如2-APB和10μM La抑制3+(补充图3A、B)在与显性阴性非导电性Orai1突变(Orai1E106A型;). 重要的是,CAD激活Ca2+在不消耗细胞内储存的情况下进入,因为钙2+TG在Ca中释放2+-游离培养基在CAD表达细胞和未转染细胞中相似(). 这些结果表明CAD使[Ca升高2+]我通过激活独立于存储耗尽的CRAC通道。
作为CRAC通道激活的最终测试,我们对瞬时转染myc-Orai1和YFP-STIM1或YFP-CAD的HEK 293细胞进行了全细胞膜片钳记录。在表达全长YFP-STIM1,I的细胞中克拉克在中断后的几分钟内出现,这与被动存储耗尽的典型缓慢激活相一致(). 我中俄国际商用飞机有限责任公司显示了内校正电流-电压关系的特征(,右),La抑制3+和2-APB调制。相反,表达YFP-CAD的细胞在分裂时出现内向电流(). 该电流被确定为I中俄国际商用飞机有限责任公司基于其对细胞外钙的依赖性2+、内向整流、2-APB的顺序增强和抑制,以及La的抑制3+(和补充图3C、D). 我中俄国际商用飞机有限责任公司在没有Orai1的情况下,转染YFP或YFP-CAD的HEK 293细胞中未观察到细胞分裂()与这些细胞中内源性STIM1和Orai1的低水平一致。有趣的是,CAD激活的电流与原生I不同中俄国际商用飞机有限责任公司因为它缺乏快速钙2+-依赖性失活(Zweifach和Lewis,1995年). 通过向CAD中添加STIM1残基羧基末端来恢复失活状态(Mullins、Park、Dolmetsch和Lewis,手稿正在编写中)。
用YFP-CT-STIM1+myc-Orai1转染HEK 293细胞未能激活构成I中俄国际商用飞机有限责任公司()或抬高休息时间[Ca2+]我(数据未显示),与NFAT萤光素酶测定中缺乏活性一致。尽管CT-STIM1的表达水平与CAD或野生型STIM1相当,但它是不活跃的;补充图1B). 而CT-STIM1+Orai1的共表达并没有提高静息[Ca2+]我在HEK 293细胞中,HEK 293T细胞表达了大量T抗原,并且表达的蛋白质水平远远高于HEK 292细胞(数据未显示)。我们的研究表明,基于其激活I的能力,CAD是比CT-STIM1更有效的Orai1激活剂中俄国际商用飞机有限责任公司在CT-STIM1活性不可检测的表达水平上与WT-STIM2相似().
CAD Associates与Orai1体内和在体外
由于胞质CAD是Orai1通道的有效激活剂,与ER无关,我们假设CAD可能与Orai1结合。为了验证这个想法,我们首先在HEK 293细胞中表达带有或不带有myc-Orai1的YFP-CAD,并检测其细胞内定位。在没有Orai1的情况下,YFP-CAD在细胞质中广泛定位,但Orai1引入导致YFP-CAD大量募集到质膜上,这表明这两种蛋白质形成复合物(). 为了进一步证明CAD和Orai1是同一蛋白复合体的一部分,我们在HEK 293T细胞中表达了标记有Flag的CAD和GFP标记的Orai1,并用抗Flag抗体表达了免疫沉淀CAD。在共表达CAD和Orai1的细胞的免疫沉淀物中检测到GFP-myc-Orai1,但在单独表达CAD或Orai1细胞中未检测到(). 在相互作用的实验中,使用抗Flag抗体对标记的Orai1进行免疫沉淀,通过Western blotting检测YFP-CAD,证实只有当这两种蛋白共存时,CAD才能与Orai1共同免疫沉淀(). 因此,CAD和Orai1在哺乳动物细胞中形成蛋白质复合物。在相同条件下(150 mM盐,1%Triton X-100),我们无法检测到CT-STIM1和Orai1之间的任何相互作用()这表明STIM1全长细胞质结构域对Orai1的亲和力比孤立的CAD弱得多。这一结果可以解释为什么CT-STIM1是CRAC通道的弱激活剂,并表明CAD在CT-STIM2中没有暴露。
CAD Associates与Orai1(A) YFP-CAD在HEK 293细胞(顶部)中自身表达时是细胞溶质的,但与Orai1(底部)共表达时在细胞周长聚集。比例尺,10μm。(B,C)表达CAD、Orai1或CAD+Orai1的细胞的细胞裂解物(左)或免疫沉淀物质(右)的蛋白质印迹。抗Flag抗体协同免疫沉淀GFP-myc-Orai1与Flag-myc-CAD(B),协同免疫沉淀YFP-CAD与Flag-myc-Orai1(C)。(D) CT-STIM1不与myc-Orai1共免疫沉淀(代表4个实验)。(E) 酵母分裂泛素测定的示意图。(F) CAD在分裂泛素分析中与Orai1相关。含有NubG-Orai1和单独的Cub-LV或CAD-Cub-LV的酵母在缺乏色氨酸和亮氨酸但含有组氨酸(SD-TL)的平板上生长良好。只有表达NubG-Orai1和CAD-Cub-LV的酵母在缺乏或存在5 mM 3-氨基三唑(3AT)(一种竞争性HIS3抑制剂,可增加选择的严格性)的情况下生长在缺乏所有三种氨基酸(SD-TLH)的平板上。含有CAD-Cub-LV和NubG-Orai1的酵母也会激活LacZ公司而表达NubG-Orai1和Cub的细胞则不表达。Alg5的同源相互作用显示为阳性对照。
作为CAD与Orai1关联的第三项测试体内为了绘制Orai1的相互作用域,我们将这两种蛋白质引入酵母分裂泛素相互作用系统(Thaminy等人,2004年). 在这个系统中,两种测试蛋白的相互作用使泛素的N端和C端片段重新结合,释放进入细胞核并激活报告基因的LexA-VP16转录激活物(). 将Orai1和泛素N末端片段(NubG-Orai1)的融合蛋白,以及CAD和泛素C末端片段与LexA-VP16融合的融合蛋白(CAD Cub-LV)引入含有LexA-His和β-半乳糖苷酶报告基因的酵母菌株中。含有NubG-Orai1和CAD-Cub-LV的酵母在His选择板上存活,并产生显著水平的β-半乳糖,而仅表达NubG-Orai1及Cub-LV结构域的酵母则没有(),表明CAD和Orai1在异源系统中相互作用。
CAD直接绑定到Orai1
为了测试CAD和Orai1之间的直接结合,我们在大肠杆菌以及昆虫Hi5细胞中含有C-末端八氢istidine和N-末端EEYMPME(“EE”)标记的Orai1蛋白。我们用纯化的EE-Orai1-His培养纯化的GST-CAD或GST8并用谷胱甘肽珠沉淀复合物。GST-CAD与Orai1共沉淀,而GST单独不沉淀,表明CAD直接与Orai结合在体外().
CAD直接绑定到Orai1(A) 谷胱甘肽珠沉淀EE-Orai1-His8GST-CAD,但不仅仅是GST。(B) (左)纯化EE-Orai1-His的尺寸排除剖面8在SDS-PAGE(右)上,峰级分含有EE-Orai1-His8在~37kDa时为一对糖基化和非糖基化带。(C) (左)EE-Orai1-His的尺寸隔离剖面8和CAD-His6在Hi5细胞中共表达,在0.5 M NaCl中纯化亲和力。大部分CAD和Orai1在Superose 6凝胶过滤柱(第4部分)的空隙体积(MW>10 MDa)中共同洗脱。EE-Orai1-His二聚体对应的带8(箭头)经Western blotting鉴定。(D) 多角度光散射(MALS)表明纯化CAD-His的分子量约为58 kDa6约为单体预测质量的四倍。
为了检测Orai1和CAD相互作用产生的蛋白复合物的大小,我们制备了表达EE-Orai1-His的Hi5细胞提取物8单独或与CAD-His联合使用6并用体积排阻色谱进行分析。Orai1和CAD蛋白首次用镍亲和纯化2+-然后用抗EE抗体免疫沉淀NTA和Orai1。仅Orai1的尺寸排除色谱显示出一个表观质量约为290 kD的单分散峰((左)与Orai1一致,在没有CAD的情况下形成多聚体。通过SDS-PAGE对洗脱液组分进行分析,发现约37kD的双倍(,右)代表EE-Orai1-His的糖基化和非糖基化形式8由衣霉素将顶带折叠到下带的能力决定(数据未显示)。与单独的Orai1相比,EE-Orai1-His8从共表达CAD-His的细胞中纯化6大部分在空隙体积中洗脱,与分子量>10 MDa的大蛋白复合物的形成一致(). 该复合物在0.5 M NaCl中稳定,表明多种CAD和Orai1蛋白具有高亲和力疏水相互作用。重要的是,复合物的形成并不涉及大量的额外蛋白质,这表明CAD和Orai1之间的相互作用是直接的(). 多余的免费CAD-His6,镍后凝胶过滤分离2+-通过多角度光散射(MALS)分析了配合物的NTA纯化,表明其分子量约为58kD,或是CAD-His预测重量13.2kD的4.4倍6单体(). 总之,这些结果表明,在没有CAD的情况下,Orai1以多聚体的形式存在,CAD在自由溶液中形成四聚体,将多个Orai1多聚体连接在一起。
STIM1-CAD绑定到Orai1的N端和C端
为了确定Orai1对CAD激活非常重要的区域,我们使用两种方法描述了CAD与Orai1的绑定。首先,我们在酵母中表达NubG与Orai1的N末端、II–III细胞质环和C末端的融合,以及不同的CAD-Cub-LV结构。菌落在选择培养基中的存活和β-gal的产生表明,CAD与Orai1的N-和C-末端结合,但不与II–III环或仅与C泛素片段结合(). 根据β-gal活性水平,CAD似乎与Orai1 C末端的相互作用比与N末端的亲和力更高。接下来,我们在HEK 293T细胞中表达了YFP与Orai1的N末端、II–III环和C末端的融合,以及Flag-myc-CAD。Flag-myc-CAD的免疫沉淀和Western blotting显示,CAD与Orai1的N端和C端相互作用,但与II–III环没有相互作用().
CAD绑定到Orai1的N端和C端(A) 在这种分裂泛素分析中,β-gal的产生和转化子在缺乏组氨酸的平板上的生长表明CAD与Orai1的C末端之间存在强烈的相互作用,与N末端的相互作用较弱,与Orai的II–III环缺乏相互作用。(B) HEK 293T细胞中的CAD与Orai1的YFP标记的N端和C端片段共同免疫沉淀,但不与II–III环共同免疫沉淀。(C) 分离泛素分析显示CAD与Orai1 N末端的aa 48–91相互作用;这似乎是由于与aa 68–91而不是aa 48–70结合。(D) CAD与Orai1-NT(48–91)共免疫沉淀,但与Orai1的整个N末端(aa 1–91)的共免疫沉淀非常微弱。(E) 20 mM Ca的全细胞录音2+o(o)来自联合表达截断Orai1-GFP蛋白和YFP-CAD的HEK 293细胞。删除Orai1的N或C末端将取消功能,但I的实质性水平中俄国际商用飞机有限责任公司由Orai1-ΔN73生成。(F) 第一章摘要中俄国际商用飞机有限责任公司测量值(−100 mV,20 mM Ca时的电流2+o(o),归一化为电池电容)和指示结构(每个4个电池,平均值±sem)。
为了更详细地探讨Orai1的N末端与CAD之间的相互作用,我们使用分裂泛素和HEK 293T联合免疫沉淀分析绘制了Orai1 N末端内负责CAD结合的亚区。在酵母分析中,CAD与Orai1强烈相互作用48–91和Orai168–91但Orai1没有48–70类似地,在HEK细胞分析中,CAD与Orai1共同免疫沉淀48–91但Orai1没有1–70表明CAD与aa 70–91区域结合(). CAD与Orai1之间的交互48–91显著强于CAD和Orai1全长N末端(,右),表明aa 1–48降低了CAD和分离的Orai1 N末端之间的亲和力。
接下来,我们使用全细胞记录测试了Orai1的CAD结合区的功能。我们将CAD引入HEK 293细胞,同时引入缺乏完整N-(Orai1-ΔN)或C-末端(Orai1-ΔC)的Orai1或CAD结合位点之前的N-末端(Oria1-ΔN73)的初始73个残基(Li等人,2007年). 含有细胞外HA表位的Orai1的Western blotting和免疫染色证实,这些突变不会改变通道的表达或细胞表面定位(补充图4). CAD组成激活I中俄国际商用飞机有限责任公司在表达Orai1-ΔN73的细胞中,但在不表达Orai1-ΔN或Orai1-△C的细胞中(),表明Orai1的N端和C端都是CAD激活所必需的,但aa 1–73不是绝对必需的(另请参见(Li等人,2007年). 此外,Orai1中aa 73–84的缺失抑制了CAD诱导的Ca2+流入,流入(补充图5). 结合以下结果这些发现表明,激活CRAC通道需要CAD与Orai1的C末端和Orai1 N末端的膜近端区域结合。
CAD集群CRAC渠道
CAD/Orai1复合体的大尺寸表明CAD将Orai1聚集在一起。为了研究这些复合物的性质并测试非特异性聚集,我们用负染单粒子电子显微镜检查了凝胶过滤柱中的纯化材料(). 仅对纯化后的Orai1进行分析,发现其主要颗粒直径为8-10nm,可能代表单个CRAC通道,具有低频的成对和三联体。相反,在CAD存在的情况下,我们观察到Orai1单一粒子簇的频率和大小随着柱洗脱液分子量的增加而增加。结合MALS结果,这些图像表明CAD四聚体与CRAC通道上的多个位点结合,从而形成这些簇。
CAD链接多个CRAC渠道以形成集群(A) 纯化EE-Orai1-His的负染电镜8(左;分数8来自)或EE-Orai1-His复合体8和CAD His6(右侧面板;分数4和8来自). 比例尺,100 nm(顶部),20 nm(底部,虚线框放大)。(B) A中所示每种情况的簇大小量化;Orai1(n=174),Orai1+CAD(fr 8,n=134;fr 4,n=90)。每个直方图都标准化为其最大bin值。(C) 表达eGFP-Orai1(顶行)或eGFP-Orai1+CAD(底行)的HEK 293细胞的FRAP。在单元格足迹(左)上漂白条后,在指定的时间显示图像。比例尺,5μm。(D) 单个细胞单独表达eGFP-Orai1(黑色)或伴有CAD(红色)的FRAP的时间进程。叠加拟合表明扩散系数为0.12μm2/s(Orai1)和0.026μm2/s(Orai1+CAD)。(E) GFP-Orai1的平均扩散系数和流动分数单独表示(n=9)或用CAD表示(n=6;平均值±sem)。
为了测试CAD是否也在完整细胞中聚集CRAC通道,我们对HEK 293细胞中单独表达或与CAD一起表达的GFP-Orai1进行了光漂白(FRAP)后的荧光恢复实验。我们单独对GFP-Aui1的FRAP测量表明,83±2%的通道在膜中是可移动的,有效扩散系数(D)为0.070±0.011μm2/s(n=9,). 在同时表达GFP-Orai1和CAD的细胞中,流动分数不变(87±4%),但Orai1扩散速度减慢了两倍(D=0.036±0.006μm2/s、 n=6)。因此,CAD似乎不会将CRAC通道固定在不动基质上,但会显著减缓其扩散,这与CAD诱导的Orai1在细胞膜中聚集一致。
CAD在Orai1绑定和STIM1激活中的作用
一个关键问题是,在门店耗尽后,CAD是否负责通过全长STIM1聚集和激活CRAC渠道。为了解决这个问题,我们测量了含有CAD突变的mCherry标记STIM1变异体与eGFP-Orai1共簇并激活Ca的能力2+针对TG的条目(). STIM1-Orai1共定位被量化为总STIM1和Orai1荧光被招募到高荧光协方差区域的分数(补充图6),而Ca2+用单细胞钙测定内流2+成像。对于每组实验,我们测量了mCherry和GFP荧光,以确认不同STIM1结构活性的差异不是由于表达水平的差异造成的(补充图7).
CRAC渠道聚类和STIM1激活是可分离的,需要CAD区域(A) 当与Orai1共表达时,STIM1-ΔCAD在存储耗尽后无法形成puncta和cluster Orai1。相反,STIM11–448(B) ,STIM1型1–440(C) 和STIM1 C437G(D)在存储耗尽后与Orai1在点滴中共存。在A–D中,图像是HEK 293细胞足迹的共焦显微照片。比例尺,10μm。(E) 钙2+表达所示结构的HEK 293细胞的测量值(平均值±sem)。在所有情况下,Orai1都被标记为eGFP,STIM1或其变体被标记为mCherry。(F) 点滴形成与钙2+表达Orai1和STIM1变异体的细胞内流入。每组条形图显示了存储耗尽前后共定位到点状的细胞STIM1或Orai1荧光的分数(平均值±sem,每组n=4个细胞)以及Ca的初始速率2+读取Ca后10-20 s测量的条目(dR/dt,其中R是呋喃-2 350/380荧光比)2+在E中。
我们首先从WT-STIM1(STIM1-CAD)中删除CAD,发现当用eGFP-Orai1表示时,mCh-STIM1-ΔCAD无法形成punta、cluster Orai1或激活Ca2+针对TG的条目(). 此外,在NFAT萤光素酶测定中,STIM1-ΔCAD在用TG+PMA处理后通过内源性通道抑制NFAT的激活()表明它与内源性STIM1形成非功能性低聚物。这些结果表明,STIM1需要CAD才能形成punta,并在ER-PM连接处招募和激活Orai1。
为了测试STIM1中的CAD是否可以独立于其残基C端而工作,我们将STIM1从C端截断到CAD的末端(STIM11–448). 与Orai1、STIM1共存时1–448行为很像WT-STIM1;它分布在静息细胞的内质网,在储存耗尽后,它与Orai1和激活的Ca形成点状结构2+条目()尽管punta和Ca都有2+与WT-STIM1相比,条目的发音略为不明显(). 因此,STIM1羧基末端到CAD的区域并非CRAC通道结合或激活的绝对必要区域,尽管它可能对两者都有微小贡献。
从CAD(342–440)肽中删除最后8个aa会消除其激活CRAC通道的能力(). 因此,我们测试了这种突变是否也能预防STIM11–448通过删除最后8个aa来生成STIM1来激活Orai11–440.STIM1型1–440存储耗尽后未能激活SOCE(),支持STIM1激活CRAC通道需要CAD功能的观点。然而,令人惊讶的是,STIM11–440保留了形成punta和集群Orai1的能力,但程度低于WT-STIM1(). 与此结果一致,联合免疫沉淀实验表明,CAD342-440保留了与Orai1结合的能力(补充图8)尽管它不能激活它。我们对一个STIM1 C437G突变体获得了类似的结果,该突变体与Orai1形成了明显的puncta,但只略微激活了SOCE(). 总之,这些数据表明CRAC信道的集群本身不足以导致信道打开。
讨论
STIM1多基结构域指导STIM1点刺的Orai1非依赖性形成
我们对STIM1-ΔK的研究结果揭示了高度保守的赖氨酸富结构域在STIM1贩运中的新作用,并解决了目前关于其对CRAC通道激活必要性的争论。我们发现,虽然STIM1在单独表达时可以形成puncta,但STIM1-ΔK需要Orai1的共同表达,这表明多基结构域可以使STIM1结合到ER-PM连接处的Orai1-独立靶点。这些结果解释了先前研究中的差异,其中STIM1-ΔK在HEK 293或HeLa细胞中单独表达时未能重新分布(Huang等人,2006年;Liou等人,2007年)但确实形成了点并激活了我中俄国际商用飞机有限责任公司在HEK 293细胞中与Orai1共表达时(Li等人,2007年). 后一发现现在可以通过STIM1-ΔK中CAD域与Orai1的直接结合来解释。
针对STIM1到ER-PM连接的多种机制的存在有望增强STIM1和Orai1在Ca后的生产性相互作用2+存储耗尽。因为STIM1和Orai1的内源性水平一般较低,并且它们的相互作用仅限于ER-PM连接,仅覆盖约5%的细胞表面(Wu等人,2006年),在生理条件下,自由扩散的STIM1和Orai1蛋白质相遇并相互结合的概率预计较低。然而,STIM1通过多基结构域首次招募到ER-PM连接处将在质膜下产生局部高浓度的CAD位点,从而增加扩散CRAC通道与STIM1结合的可能性,并提高CRAC通道激活的速度和程度。
CAD是激活CRAC渠道的STIM1领域
在以前的研究中,STIM1细胞溶质区域被截断或突变,以探测通过生物信息学分析确定的假定结构域的功能。值得注意的是,所有完全抑制CRAC通道激活并阻止穿孔形成的截断都会消除全部或部分CAD(aa 342–448)。其中包括“delta-ERM”(删除aa 251–535)(Huang等人,2006年),“增量-ST”(aa 1–390)(Baba等人,2006年)和“增量-C2”(aa 1–424)(Li等人,2007年)变体。这些缺失的抑制作用现在都可以归因于CAD功能的丧失,而不是提示ERM、富含丝氨酸-脯氨酸和多基结构域在SOC激活中的作用。CAD肽和STIM1的强大能力进一步强调了CAD的核心作用1–448激活SOCE,并在CAD缺失或引入抑制CAD功能的突变后失去STIM1活性().
据报道,全长细胞溶质STIM1结构域CT-STIM1的异源表达可激活CRAC通道(Huang等人,2006年;Muik等人,2008年;Zhang等人,2008年). 在我们的研究中,在CAD与Orai1结合并强烈激活CRAC通道的中等水平表达时,CT-STIM1未能结合到Orai1或激发可检测到的CRAC通道活性。我们只观察到CT-STIM1与Orai1在HEK 293T细胞中过度表达时的作用,这表明它以极低的亲和力结合Orai1。相对于CAD,CT-STIM1的活性大大降低,这表明CAD可能隐藏在CT-STIM1中,并且需要构象变化(可能由STIM1低聚引起)来在储存耗尽后暴露CAD。
CAD直接绑定到Orai1以激活CRAC频道
自从发现STIM1和Orai1并证明它们在ER-PM结处共同聚集以响应存储耗尽以来,人们对STIM1如何激活跨越10–25 nm ER-PM窄间隙的CRAC通道产生了相当大的兴趣和不确定性。已经提出了几种可能的机制,包括扩散信使的局部释放(博洛蒂纳,2008),或直接或通过未鉴定的辅助蛋白介导的与Orai1的物理相互作用(Muik等人,2008年;Varnai等人,2007年;Yeromin等人,2006年). 我们对纯化蛋白的GST下拉和共溶结果提供了第一个明确的证据,证明CAD直接与Orai1结合,而无需辅助伴侣。此外,CAD独立于ER-Ca激活细胞内CRAC通道的能力2+耗竭强烈反对STIM1管腔结构域中耗竭诱导的变化释放CIF等扩散信使的必要性(博洛蒂纳,2008). 我们的结果为一种构象耦合机制提供了强有力的证据,其中STIM1 CAD与Orai1的结合导致构象变化,从而直接导致CRAC通道的开放。
CAD与Orai1的多个区域交互
Orai1的N端和C端结构域以前曾与CRAC通道聚集和激活有关。删除Orai1 C末端或C末端的L273S突变可防止STIM1聚集Orai1并激活I中俄国际商用飞机有限责任公司而N末端的缺失并不影响聚类,但排除了通道激活(Li等人,2007年;Muik等人,2008年)但请看(Takahashi等人,2007年). 此外,CT-STIM1与分离的Orai1 C末端结合较弱,但与N末端结合较弱在体外(Muik等人,2008年). 这些研究得出结论,STIM1仅与Orai1的C末端发生物理交互作用,而N末端是通道选通所必需的。我们使用酵母分裂泛素和哺乳动物细胞联合免疫沉淀分析的结果证实了CAD与Orai1 C末端的强结合,但也证明了与N末端(aa 73–91)的膜近端部分的相互作用,该区域是I的必需区域中俄国际商用飞机有限责任公司激活(Li等人,2007年) (,补充图5). 由于CAD与Orai1中对通道激活至关重要的两个区域相结合,我们假设CAD可以通过桥接通道的N端和C端为CRAC通道选通提供能量。
CAD诱导的CRAC通道聚类与激活无关
纯化的CAD在溶液中形成四聚体()并且可以将Orai1/CRAC通道粒子聚集成扩展阵列体内和在体外(). 这意味着每个CAD四聚体对Orai1具有至少两个结合位点,每个CRAC通道对CAD具有至少两种结合位点。一个关键问题是,CRAC渠道集群本身是否为渠道激活提供了信号?最近的一项研究表明,STIM1二聚化质膜中Orai1的静息二聚体,以创建功能性同源四聚体CRAC通道(Penna等人,2008年). 虽然我们还没有详细解决这个问题,但我们的结果并不支持Penna等人的结论。负染色EM数据表明,CAD诱导了与纯Orai1颗粒大小相似的Orai1颗粒的聚集,这与两个Orai1二聚体合并形成四聚体不一致(). 相反,这些数据支持CRAC通道具有恒定亚单位化学计量比的观点(Ji等人,2008年)CAD将多个通道连接在一起。此外,STIM1截断突变体(1–440)(以及较小程度上的C437G突变体)在ER-PM接合处聚集Orai1而不激活通道的能力()表明聚类和激活是可分离的过程。因此,CRAC通道聚集本身不足以诱导开放,这意味着CAD通过变构机制来打开CRAC通道。
CRAC通道激活的分子机制
本研究的结果以及之前的数据表明,以下模型适用于STIM1激活Orai1。内质网钙耗尽2+存储导致STIM1管腔EF-hand/SAM结构域的构象变化,导致其齐聚。齐聚具有两种功能效应。首先,它增加了多基区的亲和力,使其能够靶向STIM1到ER-PM结;其次,它导致STIM1的构象变化,从而暴露CAD。这些部位暴露的STIM1 CAD局部高浓度促进了与Orai1的结合,形成陷阱以聚集扩散的CRAC通道,并导致形成紧密共定位的STIM1-Orai1簇。最后,CAD的绑定改变了Orai1的构象,以驱动CRAC通道的打开并激发Ca2+条目。需要更多关键步骤的直接证据,例如STIM1齐聚的结构基础和伴随CAD和CRAC通道开放暴露的构象变化,以最终测试该模型。
实验程序
细胞和转染
HEK 293和HEK 293T细胞(ATCC)在含有谷氨酸Max(GIBCO,Carlsbad,CA)、10%FBS(Hyclone,Logan,UT)和1%青霉素/链霉素(Mediatech,Hargrave,VA)的DMEM中培养。使用Flp-In T-REx系统(Invitrogen)生成具有可诱导eGFP-myc-Orai1的HEK 293细胞系,并用50μg/ml潮霉素和15μg/ml杀鼠素维持。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)以0.2-0.5μg DNA的90%融合率转染细胞。
NFAT核糖核酸酶分析
HEK 293T细胞与指示的构建物和NFAT报告基因(萤火虫荧光素酶基因C-末端到IL-2基因的4X-NFAT位点)共同转染。与雷尼利亚利用TK启动子驱动的荧光素酶(pRLTK)基因控制细胞数量和转染效率。12–18小时后,用对照DMSO溶液(模拟)、PMA(1μM)或PMA加TG(1μM)处理细胞8小时。使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)进行分析。对于每种情况,使用96 well自动光度计(Turner Biosystems)从重复的微孔中采集4个样品来测量荧光素酶活性。结果表示为萤火虫与雷尼利亚荧光素酶活性。
免疫沉淀和免疫印迹分析
用PBS清洗转染的HEK 293T细胞(12–24 h),并在50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂中溶解。以12000 rpm旋转裂解液10 min,上清液与抗Flag M2琼脂糖珠(Sigma)或抗myc或-HA抗体孵育,然后与IgG琼脂糖球(Pierce)孵育。裂解物和免疫沉淀物经SDS-PAGE,用HRP-结合二级抗体探测,并用增强化学发光(Pierce)检测。
分裂泛素酵母双杂交检测
根据制造商的说明进行筛选(Dualsystems Biotech)。在缺乏Trp和Leu(-TL)的培养基上选择转化酵母。在缺乏Trp、Leu和His(-TLH)的平板上,在3-氨基三唑(3-AT)的存在下,通过细胞生长观察到相互作用。通过使用显色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃半乳糖苷)测量lacZ活性来评估蛋白质相互作用。
商品及服务税下拉分析
对于GST下拉分析,GST-CAD(0.16μM)或GST(0.15μM)与EE-Orai1-His孵育8(0.1μM)在含有20 Tris-HCl(pH 8.0)、150 NaCl、20咪唑和1 DTT(含蛋白酶抑制剂)的缓冲液中放置1小时。添加谷胱甘肽琼脂糖后,离心小球,用上述缓冲液洗涤,用煮沸的SDS洗脱沉淀蛋白,并用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。
EE-Orai1-His的纯化8
EE-Orai1-His公司8和他的6-CAD整合到杆状病毒中,并在28°C下在Hi5细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中单独或共同表达(Orai1+CAD)48小时。细胞溶解后,通过在1%DDM(正十二烷基-β-d-麦芽糖苷;美国伊利诺伊州阿纳特拉斯)中的再悬浮使膜溶解。使用Ni-NTA珠纯化蛋白质,然后将洗脱的蛋白质与γ结合蛋白G Sepharose珠和抗EE抗体(Covance,CA,USA)在4°C下孵育过夜,并用1 mg/ml EE肽洗脱(Anaspec,CA,US)。DDM保持在0.1%,在此净化步骤之前,NaCl浓度为0.5M。然后将蛋白质通过在20 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、10%甘油、0.02%DDM和0.004%CHS中平衡的Superose 6大小排除柱,以去除聚集物质和EE肽。经SDS-PAGE分析判断,Orai1纯度>98%。
His的MALS分析6-计算机辅助设计
伊斯6-从表达His的细胞中分离出CAD6-CAD和EE-Orai1-His8MALS使用DAWN EOS光散射系统进行分析(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)。根据单体牛血清白蛋白标准化检测器响应。
电子显微镜
EE-Orai1-他的8单独或与他的铜净化6-将CAD在20 mM Tris、150 mM NaCl和0.02%DDM缓冲液中稀释至最终浓度约0.01 mg/ml,并用甲酸铀酰进行负染,如所述(Ohi等人,2004年). 使用配备100 kV钨丝的Phillips CM-10电子显微镜记录图像。在Gatan 1k×1k CCD相机上以39000倍标称放大率和−1.5μm离焦拍摄图像。
共焦显微镜
转染后6 h,将HEK 293细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸的无菌盖玻片上,并在完整的DMEM中再维持12–18 h,然后在含有(mM):155 NaCl,4.5 KCl,2 CaCl的Ringer溶液中成像2,1氯化镁2,10 D-葡萄糖和5 Na-Hepes,pH 7.4。为了耗尽储存,用钙中1μM TG处理细胞2+-自由振铃器(通过替换2 mM MgCl制备2和1 mM EGTA用于CaCl2)在装有PL APO 100x/NA 1.4浸油物镜的Leica SP2 AOBS倒置共聚焦显微镜上,分别在488和594nm处同时激发eGFP和mCherry 10分钟。在615-840 nm(mCherry)和510-570 nm(eGFP)处收集荧光发射。所有实验均在22–25°C下进行。
光漂白后的荧光恢复(FRAP)
用mCh-CAD瞬时转染可诱导HEK 293细胞,并用10μM LaCl维持三抑制慢性钙2+条目。15–16 h后,在含有LaCl的培养基中用1μg/ml四环素诱导eGFP-myc-Orai1表达三用2 mM Ca冲洗细胞2+在上述共焦系统上成像之前,转染后24小时的Ringer溶液。预漂白和恢复图像在488nm下以低功率(20mW Ar激光,50%功率,6%透射)进行扫描。在50%激光功率下对3μm带材进行漂白,全透射约2s。恢复期内的漂白可忽略不计(<5%)。FRAP恢复曲线按所述进行分析(参见补充方法).
钙2+成像
对于,细胞在37℃的DMEM中加载1μM fura-2/AM 30 min2+在340和380 nm的2 mM Ca中进行成像2+Ringer的解决方案,配有Nikon Eclipse 2000-U倒置显微镜,配有荧光弧光灯、激励滤光轮和滨松Orca CCD相机。使用Openlab(即兴)收集图像,并使用Igor Pro进行分析。
对于,细胞按上述方式加载2μM fura-2/AM 25分钟2+在2 mM Ca中用350和380 nm激发进行成像2+如前所述,使用VideoProbe成像系统在Axiovert 35倒置显微镜上的Ringer解决方案(Bautista等人,2002年). mCherry阳性细胞通过540±12 nm激发和580LP发射滤波器(Chroma)进行鉴定。
电生理学
在使用STIM1和Orai1衍生构建物进行电生理实验之前8–24小时,使用Lipofectamine 2000以1:1质量比转染HEK 293细胞。转染CAD+Orai1的细胞在10μM LaCl中培养三避免成分活性I的毒性中俄国际商用飞机有限责任公司和氯化镧三在密封形成之前立即被冲洗掉。我中俄国际商用飞机有限责任公司在不含LaCl的培养细胞中三与氯化镧培养的细胞相似三,但大多数细胞没有氯化镧三分手后不久就去世了。
使用标准全细胞膜片钳技术记录电流(普拉克里亚和刘易斯,2001年). 用含有(mM)150 Cs天冬氨酸、8 MgCl的内溶液填充电阻为2–5 MΩ的移液管210 EGTA和10 HEPES(pH 7.2,CsOH)。在5 kHz下对电流进行采样,在2 kHz下对电流进行过滤,并针对移液管溶液相对于浴中Ringer s的结电势(−13 mV)对所有电压进行校正。