生物化学杂志。2009年4月17日；284(16): 10361–10366.
抑制SUV39H1甲基转移酶活性数据库C1*
,‡ ,‡ ,‡ ,§ ,‡和‡,1
李振宇
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
陈丽红
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
尼哈·卡布拉
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
王传贵
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
贾芳
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
陈建东
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
‡分子肿瘤学系，H.Lee佛罗里达州坦帕市莫菲特癌症中心和研究所，邮编33612§华东生物医学科学研究所中国上海师范大学200241
摘要
SUV39H1是组蛋白H3K9特异性甲基转移酶，对异染色质的形成、基因表达的调控和诱导癌前细胞衰老。SUV39H1与SirT1形成综合体活性由SirT1结合刺激。在这里，我们提供的证据表明的产品数据库C1(d日已在中删除b条雷斯特c（c）癌症1)基因破坏SUV39H1-SirT1复合物。此外，DBC1与SUV39H1催化结构域结合并抑制其组蛋白H3甲基化的能力在体外和体内.内源性DBC1的敲除增加了细胞H3K9甲基化水平。正如预期的那样，DBC1还与SirT1结合并抑制SirT1。这些结果确定DBC1是SUV39H1的新型细胞抑制剂活动。DBC1可能是异染色质形成和通过破坏SUV39H1-SirT1复合物并使其失活实现基因组稳定性两种酶。
SUV39H1是果蝇属Su（var）3-9组蛋白特异性介导组蛋白H3三甲基化的甲基转移酶赖氨酸9(1). 老鼠被击倒实验表明，SUV39H1及其睾丸特异性同源物SUV39H2是异染色质区H3K9甲基化的大部分需要(2). SUV39H1已展示给与pRb形成复合物，并通过E2F1靶基因启动子甲基化(三). SUV39H1/H2-双色小鼠在胚胎发育过程中生存能力降低，生长速度减慢成年动物，因染色体异常分离而不育精子发生(2).SUV39H1缺失小鼠是可行的，但易患自发性B细胞淋巴瘤(2). 此外，SUV39H1缺陷块ras（拉斯维加斯）-诱导过早衰老并促进T细胞淋巴瘤与Eμ-N杂交后的发展-ras（拉斯维加斯）转基因小鼠(4). 这些观察表明SUV39H1与肿瘤抑制因子有关路径。
Sir2信号(秒沉默我信息第页调节器2)作为NAD依赖性脱乙酰酶发挥作用并调节染色质沉默酿酒酵母(5). 增加证券投资风险2基因剂量导致酵母寿命延长(6). 哺乳动物的同源物Sir2（SirT1）通过去乙酰化和激活转录因子PGCα(7). 转基因小鼠胰腺β细胞过度表达SirT1表明葡萄糖水平提高葡萄糖耐受性和胰岛素分泌增加(8,9). 此外，SirT1的药理激活剂，如白藜芦醇可以模拟热量限制对低等生物体的抗衰老作用，减少胰岛素喂食高脂肪食物的小鼠的抵抗力，并延长生存期(10–12).一种更有效的SirT1激活剂在改善胰岛素敏感性治疗2型糖尿病动物模型降低血糖水平(13).
SirT1通过调节组蛋白乙酰化和异染色质发挥作用地层(5). 当目标为其他蛋白质的启动子，SirT1去乙酰化组蛋白H4K16和H3K9和招募H1以促进抑制染色质的建立(14). SirT1还脱乙酰许多非组蛋白，如p53、Foxo和Ku70，用于调节敏感性凋亡(15–19).最近的研究表明，SirT1与其他染色质修饰相互作用形成多聚体复合物的酶，其中不同的酶在顺序的或协调的方式。一个有趣的例子是交互SirT1和SUV39H1之间(20,21). SirT1与SUV39H1的N-末端色域和脱乙酰SUV39H2赖氨酸266刺激其甲基转移酶活性。此外，仅SirT1绑定还通过其他机制激活SUV39H1与脱乙酰酶活性无关。重要的是，SirT1-小鼠胚胎成纤维细胞异染色质区H3K9me3明显缺失(21). 因此SUV39H1-SirT1复合物可以协同促进H3K9甲基化SirT1的脱乙酰酶活性和SUV39H1。
最近的研究还表明，SirT1与DBC1相互作用(d日已在中删除b条雷斯特c（c）癌症1)(22,23).数据库C1是最初通过定位到染色体8p21的一个区域来确定在人类乳腺癌中被纯合删除(24). 然而，数据库C1未被视为删除的主要目标，其在癌症的发展仍有待确定。DBC1是一种大核蛋白923个残基中没有明确的功能域。肿瘤坏死因子期间α诱导细胞凋亡，DBC1经历蛋白酶裂解和细胞质易位，可能在细胞死亡过程中起作用(25). DBC1使用N端子假定亮氨酸拉链结合到SirT1催化结构域并抑制其脱乙酰酶活性(22).DBC1敲除增加SirT1活性并保护细胞免受DNA损伤损伤诱导的细胞凋亡。在本研究中，我们提供的证据表明为了结合和抑制SirT1，DBC1还结合到SUV39H1并导致其完全失活。此外，DBC1表达干扰SUV39H1和SirT1之间的交互。我们的结果表明DBC1可以通过靶向异染色质的两个亚基来调节异染色质的形成SUV39H1-SirT1复合体。
材料和方法
细胞系、质粒和试剂-H1299和293T细胞保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中。Wei Gu博士提供了表达SirT1的质粒(15). FLAG标记的小鼠DBC1通过PCR扩增cDNA获得。FLAG标记的DBC1缺失突变体使用小鼠cDNA构建物生成。血凝素（透明质酸）2-带标签的人DBC1是陈俊杰博士送的一份厚礼。抗-SirT1单克隆抗体10E4通过使用SirT1-（470-747）免疫产生。抑制DBC1RNA干扰表达，ON-TARGET加DBC1的siRNA池从Dharmacon购买。H1299细胞转染100n个米siRNA和Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）48小时。
西方印迹法-细胞在裂解缓冲液（50米米三氯化氢，pH 8.0，5 m米EDTA，150米米氯化钠，0.5%Nonide P-40和1 m米苯甲基磺酰氟）和14000×离心15分钟克上清液是用于免疫沉淀和蛋白质印迹。不溶核芯块用裂解缓冲液清洗一次，用0.4提取米HCl用于组蛋白。然后用NaOH和Tris-HCl缓冲液中和组蛋白。单元格裂解物（10–50μg蛋白质）和组蛋白（～1μg蛋白）通过SDS-PAGE进行分级，并转移至Immobilon-P过滤器（密理博）。用磷酸盐缓冲盐水堵塞过滤器1小时含有5%脱脂奶粉和0.1%吐温20。内源性人SirT1用单克隆抗体对全细胞提取物进行Western blotting检测10E4.使用Bethyl Laboratories的抗体检测DBC1。过滤器使用SuperSignal（Pierce）或ECL Plus试剂（Amersham）开发生物科学）。
荧光素酶报告分析-培养细胞（50000/孔）在24孔板中，转染含有10 ngGal4-TK-核糖核酸酶报告子，10 ng巨细胞病毒lacZ公司，0.8纳克Gal4-E2F1-C、5~20 ng SUV39H1、5~10 ng Rb和30 ng DBC1质粒。使用Lipofectamine 2000试剂进行转染之后分析细胞荧光素酶和β-半乳糖苷酶的表达24–48 h。荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性比率用作转录活性的指示器。
体外甲基化试验-H1299细胞被转染编码Myc-SUV39H1、FLAG-DBC1和FLAG-DBCl缺失突变体的质粒。SUV39H1用抗Myc抗体和蛋白G珠免疫沉淀，而DBC1用M2珠免疫沉淀（Sigma）。珠子（～20-μl床层体积）与15μl甲基化缓冲液（50米米三氯化氢，pH 8.5，5 m米氯化镁2、和4米米二硫苏糖醇）、10μg核心组蛋白（Sigma）和2μCi属于S公司-[三H] 腺苷蛋氨酸（15 Ci/mmol；Amersham生物科学），并在30°C下混合培养1小时。样品是在Laemmli样品缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE分馏，转移至聚偏二氟乙烯膜，喷涂EN3HANCE™，暴露在-80°C下进行24–48小时的涂膜。在获得三H标记组蛋白放射自显影，滤器被清洗甲醇并用于Western blotting检测蛋白质表达水平。
脱乙酰酶测定-编码SirT1、SirT1-363A和将FLAG-DBC1转染到H1299细胞中。在50个细胞中裂解细胞米米三氯化氢，pH 8.0，5 m米EDTA，150米米氯化钠，和1米米苯甲基磺酰氟的超声和14000×离心15分钟克和不溶性碎屑被丢弃。将含有10μg蛋白质的细胞裂解液用于脱乙酰分析。A类三H标记组蛋白脱乙酰酶试剂盒（上游）用于测试SirT1活性。曲古菌素A（200 ng/ml）为添加到反应中以抑制NAD+-独立组蛋白细胞中的脱乙酰酶裂解。组蛋白脱乙酰酶活性(三H（H）计数）通过样品中的相对SirT1浓度进行标准化通过SirT1酶联免疫吸附试验测定。在SirT1中酶联免疫吸附试验，抗体10E4固定在酶联免疫吸附测定板，然后与细胞孵育裂解物。用兔抗SirT1抗体检测结合的SirT1。
体外结合试验-GST-DBC1截断突变体为以表示大肠杆菌并与谷胱甘肽珠结合。SUV39H1型翻译为Tn个T翻译工具包[35S] 蛋氨酸（Promega）。GST-DBC1珠与35将标有S的SUV39H1在4°C下放置1小时。用5%蔗糖，50米米三氯化氢，pH 7.4，5 m米乙二胺四乙酸，0.1%Nonidet P-40和500米米氯化钠。结合蛋白用15洗脱米米还原型谷胱甘肽，通过SDS-PAGE和放射自显影术。
结果
DBC1特别与SUV39H1互动-最近的研究发现DBC1与SirT1结合并抑制其脱乙酰酶活性(22,23). 此外，SirT1与SUV39H1相互作用并刺激其甲基转移酶活性(21). 在测试效果时在SUV39H1-SirT1复合物上的DBC1中，我们发现DBC1也会相互作用SUV39H1表现强劲。在共转染试验中FLAG-DBC1特异性共沉淀Myc-SUV39H1()，没有检测到DBC1与阴性对照Myc-MDX之间存在结合。因为在内源性SUV39H1的极低水平中内源性SUV39H1和DBC1未检测到。然而，当细胞转染Myc-SUV39H1，Myc-SUV 39H1的IP（但不是Myc-MDX）共沉淀内源性DBC1(). 如预期，内源性或转染SirT1的IP也是共沉淀内源性DBC1(). SUV39H1-DBC1共沉淀没有被SirT1的表达（数据未显示），表明相互作用没有由于SirT1的桥接效应（见下文）。在一个在体外结合试验，GST-DBC1有效地被拉下在体外-翻译的SUV39H1型(),表明绑定是一种直接交互。这些结果表明DBC1是SUV39H1的一个新颖而独特的绑定伙伴。
DBC1和SUV39H1之间的相互作用。 一，H1299细胞为用所示质粒瞬时转染48小时。内源性DBC1用抗DBC1抗体免疫沉淀。共沉淀的SUV39H1通过抗Myc蛋白质印迹检测(工作分解结构). DBC1、Myc-MDX和通过抗DBC1和抗Myc证实了WCE中Myc-SUV39H1的表达水平抗体。b条，用抗体10E4免疫沉淀SirT1，而SUV和MDMX用抗Myc抗体免疫沉淀。用抗DBC1蛋白印迹法检测共沉淀DBC1。SUV39H1和通过抗Myc Western印迹检测MDMX。c（c），HA-DBC1是用FLAG标记的组蛋白甲基转移酶和用抗HA抗体免疫沉淀。检测到共沉淀酶通过反FLAG Western印迹。检测到HA-DBC1在WCE中的表达带有抗DBC1抗体。d日，瞬时转染H1299细胞带有指示的质粒。小鼠免疫沉淀SUV39H1抗SUV39H1抗体。共沉淀SirT1和DBC1用抗体10E4和抗DBC1抗体。SUV39H1被检测用兔抗SUV抗体复制。
SUV39H1-DBC1和SirT1-DBC1中涉及的DBC1域的映射互动。H1299细胞瞬时转染质粒48h。一，DBC1用抗FLAG免疫沉淀抗体。抗SUV39H1 Western检测到SUV39H2共沉淀吸墨剂(工作分解结构).重量，野生型。b条,在里面体外-翻译的SUV39H1与GST-DBC1截短突变体孵育与谷胱甘肽珠结合。通过SDS-PAGE和放射自显影术。c（c）、DBC1和截断突变体用M2珠免疫沉淀。兔检测到SirT1共沉淀抗SirT1抗体，而DBC1由兔抗FLAG抗体检测。d日，图表总结了中的结果a–c.荷兰统计局,核定位信号；LZ公司，亮氨酸拉链。
为了进一步测试SUV39H1-DBC1相互作用的特异性，DBC1为用几种FLAG标记的组蛋白甲基转移酶（EHMT1，Setdb1、Setdb2和Set9）。常见的FLAG表位允许我们比较与FLAG-SUV39H1的结合效率。结果表明，只有SUV39H1显示可检测到与DBC1的结合(). 此外，具有酶活性的SUV39H1-324K与野生型SUV39H1相比，该突变体与DBC1的结合相同(). 因此，SUV39H1-DBC1结合在组蛋白H3K9中高度特异甲基转移酶。
SUV39H1与SirT1形成复合物，并被Sir1激活(21). 为了测试DBC1与SUV39H1-SirT1相互作用，转染细胞与通过IP/Weistern印迹分析SUV39H1、SirT1和DBC1。结果如前所述，SUV39H1-SirT1结合效率高(21). 有趣的是，DBC1表达强烈抑制SUV39H1-SirT1复合物的形成，并伴有SUV39H1-DBC1复合体的形成(). 一个DBC1SirT1和SUV39H1结合缺陷的突变体（残基108–922）不影响SUV39H1-SirT1复合体。因此，DBC1绑定到SirT1或SUV39H1颠覆了SUV39H2-SirT1综合体。这个结果也排除了SirT1作为SUV39H1-DBC1交互的中介。
SUV39H1和DBC1上结合位点的定位-要识别DBC1和SUV39H1上调节相互作用和缺失突变体的域为SUV39H1和DBC1生成。转染FLAG-DBC1突变体的Co-IPMyc-SUV39H1还显示DBC1的N末端残基1–240对于结合SUV39H1是必要和充分的(). 在一个在体外结合测定，GST-DBC1-（100–240）足以进行绑定在里面体外-翻译的SUV39H1(). 因此，DBC1似乎使用了一个域（残基100–240）而不是小肽区域相互作用配有SUV39H1。前八个氨基酸残基（位置100–107）这个结构域似乎对结合很重要，因为突变型108–922无法绑定SUV39H1(). 使用SUV39H1突变体的缺失映射显示位置220和300之间的区域足以与DBC1结合(). 有趣的是，这个区域是SET域的一部分编码甲基转移酶活性。这种互动可能是有责任的DBC1对SUV39H1活性的抑制（见下文）。
SUV39H1-DBC1交互中涉及的SUV39H2域的映射。
一用抗HA抗体免疫沉淀DBC1。SUV39H1型用兔抗FLAG抗体检测共沉淀。重量,野生型；工作分解结构，Western blot。b条，图表总结了结果如图所示。色度，色域。
DBC1绑定到SUV39H1和SirT1，但破坏了SUV39H2-SirT1复合体而不是搭桥(). 这个表明DBC1上的SUV39H1-和SirT1-绑定站点可能重叠，阻止三聚络合物的形成。然而，亮氨酸拉链DBC1的区域（位置243–264）被报告为结合位点用于SirT1(22)，而不是与我们确定的SUV39H1绑定站点重叠（位置1-240）。为了解决这个问题，我们测试了SirT1的DBC1缺失突变体通过共转染和IP/Weistern印迹结合。结果表明：删除DBC1的N-末端残基1-108消除了大部分SirT1结合，而DBC1-（1-240）片段保持完全活性用于SirT1绑定(). DBC1-（1-240）能够废除SirT1报告基因检测中p53转录活性的抑制（数据未显示）。对公布结果的审查还表明DBC1-（Δ1–230）突变体失去了大部分SirT1结合(22). 因此，我们得出结论DBC1使用相同的N末端结构域（氨基酸1-240）结合SUV39H1和SirT1。这与它破坏SUV39H1-SirT1复合物，而不是形成三聚复合物。
DBC1抑制SUV39H1的甲基转移酶活性-要测试DBC1对SUV39H1的功能作用，纯化的核心组蛋白用作底物测定SUV39H1的甲基转移酶活性。Myc-SUV39H1型转染细胞并用抗Myc IP进行免疫纯化。这种酶该制剂在组蛋白H3甲基化中表现出很强的活性属于S公司-[三H] 腺苷蛋氨酸。然而，当Myc-SUV39H1通过与FLAG-DBC1共沉淀纯化，该复合物几乎没有甲基转移酶活性(). 相比之下，SUV39H1与如前所述，SirT1比SUV39H1表现出更强的活性(21). 在第二个控件中，SUV39H1通过结合铜净化MDM2型三也留下了激活。因此，DBC1与SUV39H1结合可使其组蛋白甲基化酶失活功能，可能通过阻断催化SET域。
DBC1通过其N末端抑制SUV39H1甲基转移酶活性域。H1299细胞瞬时转染质粒48h。一、不同数量的SUV39H1（相对水平1×、2×、4×、8×和16×）进行免疫沉淀用抗Myc抗体。用抗体10E4免疫沉淀SirT1；MDM2型用抗FLAG抗体免疫沉淀SUV39H1。珠子是用于在体外组蛋白H3甲基化的检测三H放射自显影术。通过Western blotting检测到SUV39H1。考马斯染色显示细胞膜上的组蛋白H3。b条,SUV39H1以与一.用抗FLAG抗体免疫沉淀DBC1和缺失突变体。这个珠子用于在体外组蛋白H3的甲基化。表达式DBC1突变体水平和SUV39H1的共沉淀通过蛋白质印迹(工作分解结构).重量，野生型。
因为DBC1是一种大蛋白，但只使用一个小的N末端区域来结合SUV39H1，我们测试了仅N末端域是否足以停用SUV39H1。当使用DBC1缺失突变体使SUV39H1铜化时共转染后，SUV39H1被最小的DBC1片段（残基）捕获1–240），处于非活动状态(). 因此，DBC1的N端域为必要且足以约束和抑制SUV39H1。
体内对SUV39H1的DBC1抑制-测试DBC1是否对SUV39H1的监管作用体内，H1299细胞用DBC1 siRNA抑制其表达。全球H3K9三甲基化水平通过酸提取组蛋白的Western blotting进行分析。结果表明DBC1的部分敲除导致适度但可重复的K9me3总水平增加(). SUV39H1瞬时转染H1299细胞诱导K9me3总量显著增加。DBC1的共表达取消SUV39H1引入K9me3(). SUV39H1是被Rb募集以抑制E2F1活性(三,26). 在一项报告基因检测中，SUV39H1与Rb合作抑制Gal4-E2F1-C（E2F1激活域）激活Gal4-TK-核糖核酸酶报告子。的表达式DBC1部分抵消了Rb和SUV39H1的抑制作用(). 这些结果表明，SUV39H1的活性体内受DBC1.数据库。
DBC1禁用SUV39H1体内. 一，H1299细胞为用DBC1 siRNA或对照siRNA转染。提取组蛋白用抗H3K9me3抗体检测H3K9 me3水平，并用抗H3抗体。用抗DBC1抗体检测WCE中的DBC1。b条，293T细胞瞬时转染提取48 h的质粒组蛋白，并用抗H3K9me3抗体。用抗DBC1抗体检测WCE中的DBC1。用抗Myc抗体检测WCE中的SUV39H1。c（c），H1299用所示质粒转染细胞48小时。相对荧光素酶活性通过共转染进行测定和标准化lacZ公司控件。d日，瞬时转染H1299细胞与所示质粒作用48小时。p53 Lys乙酰化382是用抗Ac-K382抗体检测，用p53抗体DO1重复。e（电子），将H1299与所示质粒转染48小时对裂解液进行组蛋白脱乙酰酶分析(HDAC公司)活动使用三H标记的乙酰化H3肽作为底物。（f），一个模型显示了SUV39H1-SirT1综合设施的DBC1法规。误差线代表三个实验中的S.D。
最近的研究表明DBC1抑制SirT1脱乙酰酶活性。我们的结果证实了这一观察结果。DBC1的共同转染阻断了这种能力SirT1去乙酰化p53-Lys382 体内().此外，与DBC1共表达的SirT1表现出降低的脱乙酰酶活性在体外当使用乙酰化组蛋白H3肽作为基板().因此，DBC1是SirT1和SUV39H1的有效调节器破坏复合物的形成，并使其酶功能失活两种蛋白质().
讨论
上述结果确定了第一种细胞抑制剂SUV39H1。SUV39H2-SirT1复合物的形成不仅导致SUV39H1的脱乙酰和功能激活，但也可能允许二者酶协同有序地促进组蛋白甲基化异染色质形成(21). 通过中断SUV39H1-SirT1结合并失活SUV39H1和SirT1，DBC1具有作为染色质修饰的有效调节器的潜力。
SUV39H1负责异染色质区(2).SUV39H1缺乏会导致自发性B细胞淋巴瘤和未能诱导过早衰老以应对激活的ras（拉斯维加斯）致癌基因(4).视网膜母细胞瘤蛋白Rb的生长调节也涉及招募SUV39H1。因此，SUV39H1具有肿瘤的整体生物学功能抑制器。
尽管SirT1能够在急性DNA损伤期间抑制细胞凋亡也具有生长抑制物的特征。SirT1-缺陷小鼠胚胎成纤维细胞增殖增强并自发永生(27). SirT1击倒增加人成纤维细胞的增殖(28). 此外，转基因SirT1过表达抑制肠肿瘤的发生腺瘤病息肉病大肠杆菌突变小鼠(29). SirT1也抑制E2F1过度表达后导致细胞周期停滞(30). SirT1缺乏消除小鼠胚胎成纤维细胞异染色质区的形成(21). SUV39H1和SirT1相互作用对rDNA转录的抑制也很重要葡萄糖缺乏(20). 这些观察结果表明，SirT1和SUV39H1在一个共同的途径中发挥作用。形成SUV39H1-SirT1复合物，并在该复合物中激活SUV39H2配合物为功能合作和协同作用提供了分子基础。DBC1中断和停用SUV39H1-SirT1复合物表明DBC1可能是异染色质形成、基因表达、基因组稳定性和细胞增殖。
致谢
我们感谢Moffitt分子生物学核心的DNA序列分析。我们也感谢陈俊杰博士和魏谷博士的建设。
笔记
*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生研究院拨款CA121291（致J.C.）。
脚注
2使用的缩写是：HA，血凝素；siRNA，小干扰RNA；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；免疫沉淀；WCE、，全细胞提取物；MDMX，小鼠双分钟基因X。
三L.Chen、Z.Li和J.Chen，未公布数据。
工具书类
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