肌生长抑制素和生长/分化因子11功能的冗余

骨骼肌Gdf11型突变体

我们还试图确定肌肉抑制素和Gdf11在肌肉质量控制方面是否在功能上冗余Mstn公司^-/-小鼠出生时不存在（A.C.M.和S-J.L.，未发表的观察结果），因此Gdf11型^-/-和Mstn公司^-/-Gdf11型^-/-小鼠排除了骨骼肌表型的比较。因此，我们生成了一个靶向结构，其中包含Gdf11型插入基因液氧P重组位点进入内含子1并侧翼a新基因下游Gdf11型3英尺UTR(Gdf11型^{弗洛克斯-新})（图​（图2A2安培和​和2B）。2B型). 在胚胎干（ES）细胞中进行同源重组并将靶细胞注射到囊胚中后，我们获得了能够传播Gdf11型^{弗洛克斯-新}通过生殖系的等位基因。携带Gdf11型^{弗洛克斯-新}然后将等位基因杂交到EIIa Cre公司转基因小鼠Gdf11型^{弗洛克斯/+}携带一个上游和一个下游的老鼠液氧P现场拆除后新基因。剩余部分的重组液氧预测P位点会删除外显子2和3(Gdf11型^Δ2–3)，这将去除生物活性的羧基末端结构域。为了证明液氧P位点产生了一个空等位基因，我们产生了种系重组液氧中的P个站点Gdf11型^{弗洛克斯/+}老鼠(Gdf11型^Δ2–3/+). 对来自Gdf11型^Δ2–3/+交配表明Gdf11型^Δ2–3/+和Gdf11型^{Δ2–3/Δ2–3}小鼠分别有1个和5个额外的胸椎（数据未显示）。这些胸椎数字与Gdf11型^+/-和Gdf11型^-/-老鼠[18]确认重组液氧P站点位于Gdf11型^弗洛克斯等位基因导致无效等位基因。

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图2

肌肉特异性靶向Gdf11型基因（A）目标战略的表示。3个外显子显示为方框，编码序列为黑色，3'UTR为打开状态。目标构造由一条粗线表示，该粗线包含液氧P序列生态RI限制站点插入第二个Xba公司I位点位于外显子1和a的侧翼新基因插入生态3'UTR下游的RI现场。C介导的重组液氧P站点位于新基因导致aGdf11型^弗洛克斯等位基因。重组Gdf11型^弗洛克斯等位基因产生Gdf11型^Δ2–3等位基因。用于区分等位基因的寡核苷酸引物标记为a、b和c克里表达转基因是使用MLC1级启动子/1/3增强子和SV40 t抗原内含子和多腺苷酸化信号。（B） Southern杂交显示检测到Gdf11型⁺,Gdf11型^弗洛克斯、和Gdf11型^-（零，来自原始基因敲除线）等位基因。（C） Northern印迹分析MLC-Cre公司转基因在胸肌和股四头肌中表达，但在其他组织中不表达。（D） 检测Gdf11型基因组DNA中的等位基因Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}和Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}MLC-Cre公司PCR检测小鼠（右侧面板）。在大鼠的股四头肌和胸肌中检测到重组Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}MLC-Cre公司但不在心脏、大脑或肾脏中。未发现重组Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}老鼠。左侧面板显示控制反应。（E） 骨骼肌的Northern印迹分析Gdf11型表达强烈减少Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司肌肉与Gdf11型^{弗洛克斯/-}肌肉。

对于骨骼肌特异性重组液氧P序列，利用肌球蛋白轻链1/3启动子/增强子构建了Cre缺失转基因株(MLC-Cre公司)（图​（图2A）。2安培). 正如预期，克里在这一行中的表达仅限于骨骼肌（图​（图2C）。2摄氏度).MLC-Cre公司小鼠杂交到Gdf11型^{弗洛克斯/+}然后回传给Gdf11型^{弗洛克斯/+}老鼠或杂交到Gdf11型^+/-从最初的淘汰线开始。重组Gdf11型^弗洛克斯在骨骼肌基因组DNA中特异性检测到​（图2D）。二维). 在Gdf11型^{弗洛克斯/-}肌肉，Cre介导的重组导致骨骼肌几乎完全减少Gdf11型表达式（图​（图2E第二版).

测量了所有8种可能的基因型的体重和肌肉质量，这些基因型是由Gdf11型^{弗洛克斯/+}MLC-Cre公司和Gdf11型^+/-老鼠。两组之间的体重或肌肉质量没有差异Gdf11型^+/+,Gdf11型^+/+MLC-Cre公司,Gdf11型^+/-,Gdf11型^+/-MLC-Cre公司,Gdf11型^{弗洛克斯/+}，或Gdf11型^{弗洛克斯/+}MLC-Cre公司证明没有杂合或转基因表型的小鼠（数据未显示）。接下来，我们对Gdf11型^{弗洛克斯/-}和Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司老鼠。在体重或肌肉质量方面Gdf11型^{弗洛克斯/-}和Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司鼠标（未显示数据和图​图3A3A级).

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图3

骨骼肌特有的肌肉重量、纤维数量和纤维类型Gdf11型a中的突变小鼠Mstn公司野生型或空背景（A）胸肌、三头肌、股四头肌、腓肠肌/跖肌和胫骨前肌的重量(n个= 7–12). （B） EDL肌肉中的总纤维数、IIA、IID/X和IIB纤维数(n个= 3–4). EDL肌肉在所有基因型中平均少于4条I型纤维，因此未显示I型数据。（C） 比目鱼肌中I型、IIA型、IID/X型和IIB型纤维的总数(n个= 3–5). 骨骼肌特异性Gdf11型与之不同，缺失对肌肉质量、纤维数量或纤维类型没有影响Mstn公司删除(*P（P）< 0.05,^†对< 0.01,^‡对< 0.001). 数据为平均值±标准偏差。

骨骼肌的纤维类型组成各不相同，其代谢和收缩特性也不同[28]. 在小鼠中，I型纤维是缓慢收缩和氧化的，IIB型纤维是快速收缩和糖酵解的，IIA型和IID/X型纤维在表型上是中间的。Mstn公司^-/-与对照组相比，小鼠的肌肉纤维数量和不同纤维类型的比例总体上有所增加Mstn公司^+/+导致更多糖酵解肌的小鼠[10,29,30]. 为了确定Gdf11是否调节纤维数量或类型，我们在Gdf11型^{弗洛克斯/-}和Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司来自每一块肌肉最宽部分的老鼠。我们选择了一块快速肌肉，指长伸肌（EDL）和一块慢速肌肉，比目鱼肌进行分析，因为之前已经证明它们在纤维数量和类型上有变化Mstn公司^-/-老鼠[29,30]. 不像肌肉Mstn公司^-/-小鼠EDL或比目鱼肌中的纤维总数在Gdf11型^{弗洛克斯/-}和Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司鼠标（图​（图3B3B公司和​和3C）。3C公司). 光纤类型组成Gdf11型^{弗洛克斯/-}和Gdf11型^{弗洛克斯/-}MLC-Cre公司小鼠也没有显著差异（图​（图3B3B公司和​和3C3C公司).

因为只有在缺乏Gdf11的情况下才能发现肌生长抑制素在轴向骨骼模式中的作用，所以我们询问在缺乏肌生长抑素的情况下是否存在由肌肉中Gdf11缺失引起的表型。Mstn公司^-/-Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}小鼠杂交到Mstn公司^-/-Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}MLC-Cre公司在8周龄和6个月龄时测量小鼠的体重和肌肉质量。在两个年龄段的基因型之间，体重或肌肉质量没有发现显著差异（数据未显示，图​图3A）。3A级). 接下来，我们确定了纤维数量和纤维成分。EDL和比目鱼肌的纤维总数或单个纤维类型的数量在Mstn公司^-/-Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}和Mstn公司^-/-Gdf11型^{弗洛克斯/弗洛克斯}MLC-Cre公司鼠标（图​（图3B3B公司和​和3C3C公司).

我们的结果表明，肌肉生长抑制素和Gdf11在调节骨骼发育和模式方面具有多余的功能，但在骨骼肌大小方面没有多余的功能。我们当然不能排除通过少量的Gdf11型突变体肌肉中残留的表达或Gdf11可能在骨骼肌发育早期激活MLC公司发起人。血清中可检测到Gdf11[31]因此，我们也不能排除其他组织产生的Gdf11不受肌肉特异性重组影响而参与肌肉质量调节的可能性。

然而，Gdf11信号传导的这些基因操作对肌肉质量缺乏影响是有些出乎意料的，因为肌肉生长抑制素和Gdf11高度同源，并且因为肌肉生长抑制素在调节骨骼肌质量方面的功能与其他TGFβ家族成员的功能明显多余。注射可溶性Acvr2b受体导致Mstn公司^-/-证明除肌肉生长抑制素外，至少还有一种其他配体是骨骼肌大小的负调控因子的小鼠[15]. 另一种Acvr2b结合配体也必须被卵泡抑素抑制；Mstn公司^-/-小鼠的肌肉质量是Mstn公司^+/+鼠标同时Mstn公司^-/-过度表达肌肉特异性卵泡抑素转基因使骨骼肌质量增加了四倍Mstn公司^+/+老鼠[32]. 其他几个TGFβ超家族成员是肌生长抑制素功能冗余的潜在候选者。除Gdf11外，其他家族成员，如激活素和一些骨形态发生蛋白，结合Acvr2b和卵泡抑素[31,33-36]. 使用Acvr2b亲和纯化法可以从血清中分离出肌肉生长抑制素、Gdf11、激活素和一些BMP[31]. 然而，BMP对卵泡抑素的亲和力远低于激活素、肌抑素和Gdf11[8,9]. 此外，激活素抑制鸡肢体中C2C12成肌细胞和骨骼肌前体的分化，因此可能是肌肉抑制素功能冗余的候选者[31,37]. 除肌肉生长抑制素外，可能还有多个TGFβ家族成员是肌肉质量的负调节因子，它们对肌肉生长的影响很小。如果是这样的话，这些因子的缺失或抑制可能会导致肌肉质量的显著增加，但前提是不存在肌肉抑制素和其他多余配体。

不仅配体冗余，肌生长抑制素和Gdf11受体功能也冗余。虽然肌抑制素对激活素II型受体（Acvr2，也称为ActRIIA）的亲和力很低[2,5]，Acvr2型^-/-老鼠，就像Acvr2b公司^-/-小鼠的骨骼肌质量相对于Mstn公司^-/-老鼠[15]. 这表明Acvr2和Acvr2b都是体内肌抑制素的受体。同样，Acvr2b公司^-/-小鼠的轴向骨骼发生了前向同源异形转变，比Gdf11型^-/-老鼠[38]. 这个Acvr2型^+/-Acvr2b公司^-/-轴向骨骼模式密切相关Gdf11型^-/-老鼠[三]表明Acvr2和Acvr2b都是Gdf11的受体。这些数据表明，针对Acvr2和Acvr2b受体功能或肌生长抑制素和其他具有类似功能的TGFβ生长因子的治疗策略将导致肌肉质量增加，而不仅仅针对Acvr 2b或肌生长激素。

统计分析

八种不同基因型之间杂交产生的体重和肌肉重量Gdf11型^{弗洛克斯/+}MLC-Cre公司和Gdf11型^+/-以基因型为因子，通过单因素方差分析对小鼠进行分析，如果对< 0.05. 两种基因型之间的所有其他比较均由Student’st吨-测试。