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大脑行为免疫。作者手稿；PMC 2010年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
大脑行为免疫。2009年5月；23(4): 455–463.
2009年1月8日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.bbi.2009.01.01
预防性维修识别码：PMC2666112型
尼姆斯：美国国立卫生研究院94285
PMID：19167480

干扰素α通过激活STAT5抑制小鼠HT22细胞糖皮质激素受体介导的基因转录

方虎、医学博士、博士，Thaddeus W.W.步调、博士和安德鲁·米勒，医学博士
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

干扰素（IFN）-α是一种先天性免疫细胞因子，可在临床人群中诱发显著的抑郁症状。关于干扰素-α与抑郁之间的关系，已经考虑了许多机制，包括干扰素-alpha对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的影响。在这里，我们研究了小鼠干扰素（mIFN）-α及其信号通路对糖皮质激素受体（GR）功能的影响，GR在HPA轴调节中起关键作用。mIFN-α处理HT22小鼠海马细胞24小时（100–1000 IU/ml）发现显著抑制地塞米松（DEX）诱导的GR介导的MMTV-荧光素酶活性，并显著降低DEX诱导的GR-与其DNA反应元件的结合。值得注意的是，mIFN-α治疗24小时对DEX诱导的GR易位或GR蛋白表达没有影响。通过药物抑制janus激酶/信号转导子和转录激活子（Jak-STAT）信号通路，而不是通过抑制p38有丝分裂原活化蛋白激酶，可以显著逆转mIFN-α对DEX诱导的GR功能的抑制。此外，用靶向STAT5而非STAT1或STAT2的siRNA预处理细胞，显著减弱了IFN-α对DEX诱导的MMTV萤光素酶活性的抑制。免疫沉淀实验显示IFN-α加DEX治疗后活化STAT5和GR的核共免疫沉淀。综上所述，这些结果表明，IFN-α对海马HT22细胞GR功能的负调控是通过激活Jak/STAT信号通路介导的，从而导致核STAT5-GR蛋白-蛋白质相互作用。鉴于GR在抑郁症中的作用，IFN-α对海马来源细胞GR功能的影响可能导致IFN-α治疗患者HPA轴的改变和抑郁症状。

关键词：Jak-STAT、干扰素α、STAT5、糖皮质激素受体、重度抑郁症、细胞因子

简介

干扰素（IFN）-α是一种先天免疫反应的细胞因子，具有抗病毒和抗增殖活性(阿巴斯和利希特曼，2003年). 因此，IFN-α已成为治疗某些癌症（如恶性黑色素瘤和包括丙型肝炎在内的病毒感染）的主要药物(希思科特，2007年). 尽管IFN-α有疗效，但众所周知，根据剂量的不同，IFN-α会导致20-50%的患者出现抑郁症状(Raison等人，2005年).

关于干扰素-α与抑郁症之间的关系，已经考虑了许多机制，包括干扰素对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的影响。例如，一项研究发现，在干扰素-α治疗期间出现严重抑郁的患者更有可能表现出对第一次注射干扰素的过度HPA轴反应(Capuron等人，2003年). 鉴于促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）在调节HPA轴流出中的作用，这些结果表明，CRH通路对IFN-α的敏感性增加可能是IFN-α诱导抑郁症发展的一个脆弱因素。值得注意的是，CRH的高分泌被认为在抑郁症的发展中起着重要作用，IFN-α已被证明可以刺激实验动物下丘脑和杏仁核中CRH的表达(Raber等人，1997年). IFN-α也被证明会导致皮质醇昼夜斜率变平和夜间皮质醇浓度增加，这两者都与IFN-α诱导的抑郁症状增加有关(Raison等人，2008年).

抑郁症患者CRH高分泌和皮质醇斜率变平被认为部分与糖皮质激素对HPA轴负反馈调节受损有关，这种作用可能由糖皮质激素受体（GR）功能降低介导(内默洛夫，1996年;Raison和Miller，2003年). 事实上，抑郁症患者在体内和体外都表现出GR功能下降，表现为在DEX抑制试验（DST）和DEX-CRH试验期间合成糖皮质激素地塞米松（DEX）未能抑制皮质醇分泌(Holsboer，2000年;Ising等人，2005年)降低外周血单个核细胞对DEX体外抑制有丝分裂原诱导淋巴细胞增殖作用的敏感性(Pariante，2004年). 此外，转移性乳腺癌患者在DST期间皮质醇斜率变平与皮质醇不受抑制有关(Spiegel等人，2006年). 与干扰素α相关的是，最近的一份报告表明，几个细胞株72小时的干扰素-α治疗与GR mRNA和蛋白表达降低有关(Cai等人，2005年). 此外，血浆IFN-α水平与获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者外周血单核细胞GR结合亲和力降低和皮质醇敏感性降低有关，尽管在本研究中未观察到IFN-α对GR功能的直接影响(Norbiato等人，1996年). 最后，已知IFN-α可以刺激p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和信号转导子和转录激活子（STAT）通路(Platanias，2005年)p38 MAPK和STAT诱导均被证明抑制GR功能(Biola等人，2001年;Stocklin等人，1996年;Wang等人，2004年). 总之，这些数据表明，IFN-α可能导致抑郁症的一种机制是通过破坏GR功能及其在HPA轴反应调节中的作用。

本研究旨在进一步探讨干扰素-α对GR功能的影响以及所涉及的信号通路。在这些研究中，使用了小鼠HT22细胞、海马衍生细胞系和小鼠IFN-α（mIFN-α）。海马GR已被证明对维持正常HPA轴功能至关重要，并与抑郁症的潜在HPA轴病理生理学有关(De Kloet等人，1998年). 此外，给小鼠注射mIFN-alpha已被证明能激活包括海马神经元在内的多个脑区的IFN-alha信号分子(Wang等人，2008).

材料和方法

细胞和试剂

由Y.Sagara博士（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）善意提供的小鼠海马HT22细胞在37°C和5%CO条件下生长2在补充有10%热灭活（56°C，30分钟）胎牛血清（Hyclone，Logan，UT）、50 U/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的DMEM中。GR-绿色荧光蛋白（GFP）嵌合体是由英国伦敦精神病学研究所Carmine Pariante博士赠送的。药理学试剂包括重组I型小鼠IFN-α（mIFN-α）（新泽西州皮斯卡塔韦PBL生物医学实验室）、DEX（密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich）、janus激酶（Jak）抑制剂I（加利福尼亚州圣地亚哥Calbiochem）和SB203580（加州圣地亚哥Calbiochem）。

转染

用小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）-荧光素酶报告基因构建体瞬时或稳定转染HT22细胞，该构建体包含启动子区上游的多个糖皮质激素受体结合位点[（糖皮质激素反应元件（GRE）]。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）完成转染。用G418处理2周后产生稳定转染的HT22细胞，并通过限制稀释进行克隆。然后对克隆进行DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性筛选。在无血清培养基中瞬时转染MMTV-核糖核酸酶报告子或GR-GFP。转染后5小时，将剥离的胎牛血清（FBS）添加到微孔中。

荧光素酶检测

将HT22细胞接种到12孔板中，培养20–24小时，直至70–80%融合。药物治疗后，用1X冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗HT22细胞一次，然后用被动裂解缓冲液（见下文）进行裂解。然后在室温（RT）下以10000 rpm的转速离心细胞15秒，以清除细胞碎片。使用微孔板光度计（Luminoscan Ascent，Thermo Labsystems，芬兰赫尔辛基）和荧光素酶底物（Promega，Madison，WI）测量荧光素酶活性。报告的所有活性值均为三个独立实验的平均值，表示为相对于载体对照的折叠变化。

细胞核、细胞溶质和全细胞提取物

用1×PBS冲洗细胞单层，然后在含有20 mM Tris（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgC2、5 uM二硫苏糖醇、1 uM苯甲基磺酰氟、1 uM胃蛋白酶抑制素、50 mU胰蛋白酶抑制剂抑肽酶、10 uM亮氨酸蛋白酶和2 mM钒酸钠的核均一缓冲液（NHB）中收集。将Igepal CA-630（Nonide P-40）添加到0.15%的最终浓度，并在Dounce均质器中用16次冲程使细胞均质。匀浆以3500 rpm离心5分钟。将上清液保存为细胞溶质提取物，将核颗粒重新悬浮在0.5体积的NHB中，并像以前一样离心。将完整核团再次悬浮在NHB原始体积的一半中，然后再次离心。将大多数颗粒（完整的细胞核）重新悬浮在含有20 mM HEPES（pH 7.9）、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、5 uM二硫苏糖醇、1 uM苯甲基磺酰氟、1 uM胃蛋白酶抑制素、50 mU胰蛋白酶抑制剂抑肽酶、10 uM亮氨酸蛋白酶、2 mM钒酸钠、，和25%甘油或免疫沉淀（IP）缓冲液，含有10 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM乙二醇四乙酸、1 mM-EDTA、1%Triton X-100、1 uM苯甲基磺酰氟、1 uM-胃蛋白酶抑制素、50 mU胰蛋白酶抑制剂抑肽酶、10 uM-亮氨酸蛋白酶和2 mM钒酸钠。在冰上提取细胞核30分钟。然后将样品在4°C下以10000 rpm离心10分钟。这些上清液含有核蛋白。为了产生全细胞提取物，在1X PBS中收集细胞，并在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行溶解[50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA、150 mM NaCl和含1%NP-40的蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml胃蛋白酶抑制素和1μg/mlleupeptin]在冰上孵育30分钟后，将细胞裂解物以13000×克在4°C下保持10分钟，并收集上清液。为了使相关分析的样品装载量正常化，使用商用双辛酸（BCA）分析法（皮尔斯，罗克福德，IL）测定蛋白质浓度，并以牛血清白蛋白作为蛋白质标准。

蛋白质印迹分析

50μg细胞溶质蛋白或全细胞蛋白与十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液混合，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。对于核提取物的蛋白质印迹分析，在SDS-PAGE之前，将25μg总蛋白与SDS缓冲液混合。然后将分离的蛋白质电泳转移到硝化纤维素膜上。将膜在5%牛奶/三缓冲盐水吐温20溶液中封闭1小时，然后在存在针对GR（M-20；Santa Cruz Biotechnology，Santa Crux，CA）或磷酸化（p-）STAT5a/b（Tyr694；Cell Signaling，Danvers，MA）的一级抗体（1:1000稀释）的情况下培养过夜。随后将清洗过的膜与二级抗体（1:2000稀释）孵育1小时。使用Amersham Biosciences Corp.（新泽西州皮斯卡塔韦）的商用化学发光试剂盒再次清洗膜并进行可视化。

瞬时转基因GR-GFP的定位

HT22细胞在盖玻片上生长，然后使用Lipofectamine 2000转染试剂用2μg表达载体转染GR-GFP嵌合体，并使其恢复16小时。然后用载体、IFN-α和/或DEX处理细胞，如所述。细胞在−20°C下用甲醇固定/渗透10分钟。然后将4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma）以0.5mg/ml的浓度加入1X PBS中，然后在RT下孵育10分钟。使用1X PBS洗涤3次，去除未结合染料。然后使用VECTASHIELD®荧光显微镜安装介质，使用DAPI（加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室）或ToPro（Invitrogen Life Technologies）安装盖玻片。使用尼康E800荧光显微镜观察GR-GFP。用亲本GFP构建物或嵌合GFP–GR构建物瞬时转染HT22细胞后，在约20–30%的细胞中观察到荧光，反映了转染效率的水平。

电泳迁移率变化分析

从Invitrogen Life Technologies获得了一个含有GRE序列的合成寡核苷酸（5′-AAG ATT CAG GTC ATG ACC TGA GGA）。将寡核苷酸退火，然后使用T4-多核苷酸激酶和[γ-32P] ATP符合制造商说明。总共，在RT条件下，将5–10μg不同处理的核提取物与1μg poly d（I-C）孵育15分钟，以结合非特异性DNA结合蛋白。[γ-32P] 然后添加DNA（1μl，最终浓度1 nM），并在室温下培养15分钟。在添加[γ-32P] DNA与特定的DNA蛋白结合竞争。将反应混合物加载到5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：双丙烯酰胺，30:0.8）上，并在150V下在1X TBE缓冲液（0.09M Tris，0.09M硼酸盐，和2mM EDTA，pH 8.3）中运行。凝胶干燥后，通过放射自显影术观察蛋白-DNA结合。

siRNA程序

预先设计的STAT1 siRNA（5′-TCCTATTATTATAATAA-3′）、STAT2 siRNA（5′-TTGGGTTACTACAGGAAA-3′）和非靶向siRNA（5'-AAGGAGGCTGAACATTCCGTC-3′）购自Qiagen（加利福尼亚州巴伦西亚Qiangen Inc.）。为了确保两种STAT5亚型都被减少，从siRNA中获得了针对STAT5a和STAT5b亚型同源区域的STAT5特异性siRNA（5′-CUACAGUCGUGUGGUGA-3′）设计中心（科罗拉多州拉斐特市Dharmacon）。所有siRNA双链体在100nM下使用，并使用2μL Lipofectamine 2000试剂/20pmol siRNA转染48小时。48小时后，细胞与MMTV-核糖核酸酶构建物和肾素质粒共同转染。4小时后，将转染复合物替换为含有所示处理的剥离血清培养基。在处理后收集细胞裂解物，并使用双荧光素酶报告分析系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）分析荧光素酶和肾素活性。利用肾素活性校正荧光素酶值的转染效率。

免疫沉淀

核蛋白（300μg）与蛋白A琼脂糖预先孵育，然后将所得上清液与5 ug多克隆抗GR抗体（M-20；Santa Cruz Biotechnology）在4°C孵育2小时。将蛋白质-A琼脂糖（加州圣地亚哥圣克鲁斯）添加到混合物中，并将样品再旋转1小时。通过造粒该混合物，分离出结合GR和任何相关蛋白。使用1X PBS将颗粒冲洗两次，并在添加Laemmli样品缓冲液后，通过100°C培养10分钟，从琼脂糖中洗脱结合蛋白。这些样品通过SDS-PAGE进行分离，并通过STAT5-pY或GR抗体的蛋白质印迹进行分析。

数据分析和统计

描述性统计[包括平均值和标准误差（SEM）]用于表征所有实验中的相关测量。采用双向方差分析（ANOVA）探讨mIFN-alpha和DEX治疗的主要影响以及它们在MMTV-核糖核酸酶活性、GR蛋白水平或GR-DNA结合作为依赖性结果的研究中的相互作用。在两步过程中分析了探索药理学抑制剂对DEX诱导的MMTV萤光素酶活性的mIFN-α抑制作用的实验结果。首先在药物抑制剂控制条件下（即载体处理细胞），采用双向方差分析法分析DEX和mIFN-alpha的主要作用及其相互作用，以首先确认mIFN-alpha对DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性的影响。然后使用单独的单向方差分析来确定Jak-STAT或p38 MAPK抑制对mIFN-alpha对DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性的影响的总体主要影响。在涉及针对相关STAT通路的siRNA治疗的研究中，在对DEX和mIFN-alpha的主要作用及其相互作用进行双向ANOVA分析后，使用单向ANOVA来确定siRNA在mIFN-alpha和DEX治疗的细胞中的主要作用。首先对仅以STAT5为靶点的siRNA研究结果进行双向方差分析，分析DEX和mIFN-alpha的主要作用及其相互作用，然后进行单向方差分析，比较所有治疗条件。显著的主要影响之后是Fisher最小显著差异检验，以探索相关的事后比较。显著性水平设为p<0.05，所有显著性检验均为双尾检验。

结果

mIFN-α减弱DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性和DEX诱导GR-GRE结合

对核提取物的RT-PCR分析显示，HT22细胞表达编码小鼠IFN-α受体1的mRNA（参见补充图1). 为了确定干扰素-α处理对HT22细胞GR功能的影响，稳定转染MMTV-荧光素酶报告基因构建物的细胞用载体处理24小时，mIFN-α（100或1000 U/ml）处理24小时、载体处理22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理2小时，或mIFN-阿尔法（100或1000U/ml22小时，然后用mIFN-alpha加DEX治疗2小时。DEX有显著的主要影响(F类[1,12]=249.98,第页<0.01）和mIFN-α(F类[2,12]=30.92,第页<0.01）MMTV-核糖核酸酶活性的处理以及这些处理条件之间的显著交互作用(F类[2,12]=26.63,第页<0.001). 100和1000 U/ml的mIFN-alpha均显著降低了DEX单独对DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性的影响，较高剂量的mIFN-alpha表现出更强的抑制作用(第页=0.06) (图1). 值得注意的是，单用mIFN-alpha（100 U/ml）显著降低了MMTV-核糖核酸酶活性（相对于溶媒对照条件）(第页<0.05).

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mIFN-α抑制地塞米松诱导的HT22细胞荧光素酶活性

HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。在无血清培养基中使用脂蛋白试剂和pAH-Luc质粒进行瞬时转染。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（100或1000 U/ml）处理细胞24 h，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（100%或1000 U/ml）处理细胞22 h，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2 h。对所有样品进行了一式三份的分析，所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。如前所述测量荧光素酶活性。*与相同DEX治疗组FLSD中的中等剂量组相比，p<0.05。

为了检测mIFN-alpha（1000 U/ml）对DEX诱导的GR-GRE结合的影响，从如上所述处理的HT22细胞中获得核提取物。来自3个独立实验的代表性电泳迁移率变化分析（EMSA）如所示图2混合实验的密度分析显示DEX对GR-GRE结合的主要影响(F类[1,8]=9.78,第页<0.02），以及DEX和IFN-α治疗之间的显著交互作用(F类[1,8] = 21.18,第页<0.01). 事后分析显示，与单独使用DEX相比，用mIFN-α加DEX处理细胞导致的GR-GRE结合显著减少(第页<0.05) (图2). 此外，mIFN-alpha单独增加了GR-GRE结合，与经载体处理的对照细胞相比(第页<0.05).

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mIFN-α降低地塞米松诱导的HT22细胞GR-GRE结合

面板A：细胞在100 mm培养皿中生长，直至100%融合。用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（1000U/ml，22小时）处理细胞，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。然后分离核提取物，并使用来自每个处理条件的10μg核蛋白进行凝胶迁移率变化分析32P标记的合成双链GRE寡核苷酸。图中显示了具有代表性的凝胶。B组：所示数据表示从三个独立实验中获得的平均±SEM光密度，以控制百分比表示（车辆状况）。*与车辆控制相比p<0.05，**p<0.05与单独使用DEX相比。

mIFN-α治疗不影响GR蛋白表达或GR核转位

为了确定mIFN-alpha对MMTV-荧光素酶活性和GR-GRE结合的影响是否是由于GR蛋白表达降低所致，HT22细胞用载体处理24小时，或用mIFN-alpha（1000 U/ml）处理1、5、12或24小时。对全细胞提取物进行GR蛋白检测，从3个独立实验中获得的代表性Western blot显示在图3使用来自混合实验的数据，密度分析显示mIFN-alpha治疗在检测的时间点对GR蛋白表达没有主要影响(F类[4,10]=0.41,第页>0.05)(图3).

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mIFN-α治疗1、5、12和24小时并不会降低HT22细胞中GR蛋白的全细胞表达

细胞在6孔培养板中生长，直至80%融合，然后用载体或mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，处理时间如图所示。western blot检测全细胞GR。面板A：所示值表示三个独立实验中GR蛋白的平均（±SEM）光密度，表示为对照组的百分比（车辆条件）。B组：显示了在所示mIFN-α处理后GR蛋白表达的代表性印迹。

用Western blot检测mIFN-alpha损伤DEX诱导的GR从细胞质向细胞核移位的程度（3个独立实验的代表性blot显示于图4). 细胞按照图1如上所述。DEX治疗（50 nM）对两种细胞溶质都有显著的主要影响(F类[1, 8]=6.45,第页<0.05）和核(F类[1,8]=39.49,第页<0.01）GR蛋白。然而，mIFN-α治疗（1000 U/ml）对细胞溶质或核部分（细胞溶质：F类[1,8]=0.03,第页>0.05; 核能：F类[1,8]=0.015,第页>0.05) (图4). 此外，mIFN-α和DEX治疗之间没有相互作用（胞质：F类[1,8]=0.04,第页>0.05; 核能：F类[1,8]=0.06,第页>0.05). 事后分析表明，在存在或不存在mIFN-α的情况下，从DEX处理的细胞中获得的核提取物显示出类似数量的核GR蛋白，与对照条件相比，在每种情况下都显著增加(第页<0.05) (图4). 在这两种治疗条件下，核蛋白的增加伴随着细胞溶质GR蛋白的减少。

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mIFN-α不能减弱HT22细胞GR的核转位

面板A：细胞在添加10%FBS的DMEM中生长汇合。用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（1000U/ml，22小时）处理细胞，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。使用针对GR产生的抗体对细胞核和胞质提取物进行蛋白质印迹分析。显示了胞质和核蛋白提取物的代表性印迹。B组：所示值表示三个独立实验中GR蛋白的平均（±SEM）光密度，表示为对照组的百分比（车辆条件）。*与同一隔间内的车辆对照组相比，p<0.05。面板C：在实验治疗开始前，将转染GR-绿色荧光蛋白（GFP）嵌合体的细胞在含有煤焦剥离血清的DMEM中培养16小时。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，载体处理23小时，然后用载体加DEX（50nM）处理1小时，或mIFN-alpha（1000U/ml。GR-GFP荧光图像描绘了具有代表性的细胞。

通过使用GR-GFP构建物和荧光显微镜对核易位进行评估，证实mIFN-α对DEX诱导的GR易位没有影响。用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞23小时，载体加DEX（50nM）处理细胞1小时，或mIFN-alpha（1000U/ml图4). 根据初步研究证明在这些条件下GR易位最大的结果，在这些实验中使用了一小时的DEX治疗。未发现任何处理对亲代GFP结构有影响(补充图2).

抑制Jak-STAT信号而非p38 MAPK信号逆转mIFN-α诱导的DEX诱导的MMTV荧光素酶活性变化

先前的研究表明，IFN-α通过Jak-STAT信号通路以及p38 MAPK发挥作用(Platanias，2005年). 与这些数据一致，发现mIFN-alpha（1000 U/ml）能以时间依赖的方式有效诱导磷酸化（激活）STAT1、STAT2、STAT5和p38（参见补充图3). 因此，我们研究了药物阻断Jak-STAT和p38 MAPK可以在多大程度上逆转mIFN-α对DEX诱导的GR功能的抑制。在稳定转染HT22细胞中检测MMTV-荧光素酶活性，分别用载体处理24小时、mIFN-alpha处理24小时和载体处理22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理2小时或mIFN-alpha（1000 U/ml）处理2个小时在载体或mIFN-alpha治疗前2小时，在存在或不存在浓度增加的非特异性Jak抑制剂Jak抑制剂I（0.1–10.0μM）或p38 MAPK抑制剂SB203580（1–20μM）的情况下，使用IFN-alfa加DEX治疗22小时（持续至细胞收获）。在单独的实验中，Jak抑制剂I和SB203580分别抑制STAT5和p38的活化（磷酸化）（参见补充图4和5). 与早期实验的观察结果一致，DEX的显著主要影响(F类[1,8]=279.62,第页<0.001）和mIFN-α(F类[1,8]=35.96,第页<0.01）观察到MMTV-尿苷酶活性的治疗。还发现DEX和mIFN-α治疗之间存在显著的相互作用(F类[1,8]=29.90,第页<0.01). 事后分析表明，与单独使用DEX治疗相比，使用mIFN-α加DEX治疗导致MMTV萤光素酶活性水平显著降低(图5). 当统计分析仅限于在存在或不存在Jak抑制剂1或SB203580的情况下用mIFN-alpha加DEX处理的细胞时，发现Jak抑制剂一对MMTV-核糖核酸酶活性的主要影响(F类[3, 28]=17.01,第页<0.01），而对SB203580无影响(F类[3, 28]=1.18,第页>0.05). 事后分析显示，与单用mIFN-α+DEX处理的细胞相比，用mIFN-alpha和DEX+1或0.1μM Jak 1抑制剂处理的细胞显示出更高水平的MMTV-核糖核酸酶活性(图5).

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抑制Jak-STAT信号而非p38 MAPK信号逆转mIFN-α诱导的DEX诱导的MMTV荧光素酶活性变化

面板A：稳定转染MMTV-核糖核酸酶报告基因构建物的HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。然后，在存在或不存在Jak抑制剂I（0.01–1.0μM）或SB203580（1–20μM）浓度增加的情况下，用载体处理细胞24小时，mIFN-α处理细胞24个小时，载体处理细胞22个小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-阿尔法（1000 U/ml）处理细胞22小时，然后再用IFN-α加DEX处理细胞2个小时。对所有样品进行了一式三份的分析，所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。按照描述测量萤光素酶活性。*与单独用DEX处理的细胞相比，p＜0.05；**与mIFN-alpha加DEX处理的细胞相比，p<0.05。

抑制STAT5蛋白表达逆转mIFN-α对DEX诱导的MMTV荧光素酶活性的影响

使用靶向STAT1、STAT2或STAT5 mRNA的siRNAs进一步探讨了Jak-STAT信号通路在mIFN-α介导的GR抑制中的作用（参见补充图6用于证明使用siRNA成功靶向STAT蛋白表达）。用siRNA转染细胞，然后用MMTV-核糖核酸酶报告体转染，如方法部分所述。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，载体处理22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理2小时，或用mIFN-alpha处理22小时然后用mIFN-alpha加DEX处理2小时。证实了早期实验中的观察结果，DEX的主要影响(F类[1,8]=50.69,第页<0.01）和mIFN-α(F类[1,8]=32.35,第页<0.01）的MMTV-核糖核酸酶活性，以及两种处理之间的显著交互作用(F类[1,8]=31.10,第页<0.01). 事后分析表明，mIFN-α显著降低了DEX诱导的GR荧光素酶活性(图6). 分析针对特定STAT蛋白的siRNA对仅限于mIFN-α+DEX处理细胞的MMTV-核糖核酸酶活性的影响，揭示了siRNA处理的主要作用(F类[4, 10]=51.93,第页<0.01). 事后分析表明，用针对STAT5的siRNA转染细胞可显著逆转mIFN-α对DEX诱导的GR介导的基因转录的抑制作用。然而，用针对STAT1或STAT2的siRNA转染细胞没有效果。

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针对STAT5而非STAT1或STAT2的siRNA逆转mIFN-α对地塞米松诱导的HT22细胞MMTV-核糖核酸酶活性的抑制

面板A。细胞在60mm培养皿中生长，直至80%融合。用100 nM靶向STAT1、STAT2或STAT5的siRNA瞬时转染细胞24小时，或用非靶向siRNA转染细胞，然后用MMTV-核糖核酸酶报告结构转染细胞。转染后，用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理细胞2小时，m干扰素-alpha处理细胞22个小时，然后再用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。*与单独使用DEX的细胞相比，p<0.05；**与用mIFN-α加DEX处理的细胞相比，p＜0.05。

在缺乏mIFN-α的情况下，抑制STAT5蛋白表达不会改变DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性

为了确定STAT5在缺乏IFN-α的情况下是否在DEX诱导的MMTV荧光素酶活性中发挥作用，比较了用靶向STAT5的siRNA转染的细胞与用非靶向siRNA转导的细胞中DEX诱导MMTV-淀粉酶的反应。还纳入了其他相关控制条件（STAT5 siRNA+mIFN-alpha，仅STAT5 siRNA）。用或不用STAT5 siRNA或非靶siRNA转染HT22细胞，然后用MMTV萤光素酶报告基因转染（如上所述）。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，载体处理22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理2小时，或用mIFN-alpha处理22小时然后用mIFN-alpha加DEX处理2小时。与之前的实验一样，DEX的主要影响(F类[1,8]=41.59,第页<0.01）和mIFN-α(F类[1,8]=32.58,第页<0.01），并且两种治疗条件之间存在显著交互作用(F类[1,8]=31.54,第页<0.01）对MMTV萤光素酶活性的影响。事后分析表明，mIFN-α显著降低了DEX诱导的GR荧光素酶活性(图7)在未转染针对STAT5的siRNA的细胞中。对所有处理条件下MMTV-核糖核酸酶活性的分析表明，处理条件的主要影响显著(F类[8, 18]=22.40,第页<0.01). 事后分析表明，DEX诱导的GR介导的基因转录在转染靶向STAT5的siRNA的细胞与未转染siRNA细胞中没有显著差异(图7).

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在没有mIFN-α治疗的情况下，siRNA对STAT5蛋白表达的抑制不会改变DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性

面板A：HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。然后用100 nM针对STAT5的siRNA瞬时转染细胞24小时，或用非靶向siRNA转染细胞，然后用MMTV-核糖核酸酶报告体转染细胞。转染后，用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理细胞2小时，m干扰素-alpha处理细胞22个小时，然后再用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。*与单独使用DEX的细胞相比，p<0.05；**与mIFN-alpha加DEX治疗的细胞相比，p<0.05。

用mIFN-α和地塞米松处理的HT22细胞中STAT5和GR共同免疫沉淀

使用免疫沉淀法检测GR和STAT5之间的直接蛋白相互作用。从用mIFN-alpha（1000 U/ml）、mIFN-alpha加DEX（50 nM）或载体处理的细胞中提取核蛋白30分钟，并与抗GR抗体孵育用于免疫沉淀。然后使用特异性抗磷酸-STAT5抗血清进行Western blot分析。这些实验中30分钟的治疗时间来源于之前的一项研究，该研究检测了IL-2对GR-STAT5蛋白-蛋白质相互作用的影响(Biola等人，2001年). 如所示图8在mIFN-alpha加DEX治疗条件下，GR抗体沉淀磷酸-STAT5，表明STAT5和GR在DEX和mIFN-alpha治疗后参与核蛋白-蛋白质相互作用。

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干扰素-α和地塞米松处理HT22细胞后，STAT5和GR参与蛋白质相互作用

图像是三个独立实验的代表。用载体、mIFN-alpha（1000 U/ml）或mIFN-alpha加DEX（50 nM）处理30分钟的细胞生成核提取物，并使用带有抗GR抗体的蛋白A或蛋白G-淀粉珠进行免疫沉淀。然后使用10%Tris-HCl凝胶将蛋白质溶解，电泳转移到硝化纤维素膜上，并用抗p-STAT5或抗GR抗体进行印迹。

讨论

数据表明，用mIFN-α处理小鼠HT22细胞可抑制GR功能，表现为DEX诱导的GR介导的基因转录降低和GR-GRE结合降低。在类似的处理条件下，mIFN-α对全细胞GR蛋白表达或GR核转位没有影响。药物抑制Jak-STAT信号通路（而非p38 MAPK）可逆转mIFN-α对GR功能的影响。用siRNA干扰STAT5编码基因的表达也可以逆转mIFN-alpha对GR功能的影响，而用针对STAT1和STAT2的siRNA处理细胞则没有显示出显著效果。值得注意的是，在没有IFN-α的情况下，使用siRNA抑制STAT5对DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性没有影响。用mIFN-α加DEX治疗后，磷酸化-STAT5和GR的免疫共沉淀显示了核磷酸化-STAT5-GR蛋白-蛋白的相互作用。综上所述，数据表明，IFN-α通过激活STAT5抑制GR功能，然后STAT5与细胞核中的GR相互作用，阻止GR-GRE结合和报告基因激活。

在没有配体的情况下，GR存在于与伴侣分子组装相关的细胞质中，尤其是热休克蛋白。GR与激素结合后，与伴侣复合体分离，从而发生构象变化，包括暴露核定位信号。然后GR与细胞骨架结合(Galighana等人，1998年)并通过核孔转移到细胞核。GR一旦进入细胞核，就会形成同型二聚体，并与相关糖皮质激素敏感基因上的GRE结合，或通过直接的蛋白质相互作用与其他转录因子结合(Guiochon-Mantel等人，1996年). 考虑到GR信号传导的许多步骤，在许多点上，诸如IFN-α之类的细胞因子可以破坏GR功能，包括对GR蛋白表达、激素结合、核移位以及GR与其DNA反应元件和核转录因子的相互作用的影响(Pace等人，2007年).

许多研究发现细胞因子可以改变GR的表达(Miller等人，1999年;佩斯等人，2007年). 与IFN-α相关，用IFN-α治疗肝母细胞瘤（Huh7）和T细胞白血病衍生（Jurkat）细胞株72小时后，发现GR mRNA和蛋白降低(Cai等人，2005年). 然而，与本文报道的观察结果一致，干扰素-α治疗24小时后GR表达的变化不明显(Cai等人，2005年)，表明mIFN-α治疗相对较短时间（例如24小时）对GR功能的抑制并不涉及GR蛋白表达的降低。关于激素结合，已发现艾滋病患者血浆IFN-α水平与单核细胞GR结合亲和力呈负相关(挪威等，1996年). 然而，尽管在目前的研究中没有直接测量结合亲和力，但IFN-α加DEX后GR核完整易位的数据表明，激素结合后配体依赖性构象变化以及与相关细胞骨架元素的相互作用（间接反映激素亲和力）没有中断(Galighana等人，1998年).

一些研究已经检测了细胞因子暴露导致GR核移位的变化。例如，IL-1和IL-2在体外均能抑制DEX诱导的GR易位(Goleva等人，2002年;Pariante等人，1999年;Wang等人，2004年). 此外，IL-1受体缺陷小鼠不能产生应激诱导的糖皮质激素抵抗，这已被证明是继发于小鼠脾细胞GR易位减少，并与内毒素休克易感性增加有关(Engler等人，2008年;Quan等人，2001年). IL-1抑制GR易位与p38 MAPK信号通路有关(Wang等人，2004年). 事实上，用p38抑制剂SB203580和靶向p38的反义寡核苷酸治疗可以逆转IL-1诱导的LMCAT细胞GR介导的基因转录抑制(Wang等人，2004年). 有趣的是，p38也与IL-2和IL-4对外周血单个核细胞GR结合亲和力的影响有关(Irusen等人，2002年). 尽管IFN-α已被证明激活p38 MAPK信号通路(普拉塔尼亚斯，2005年)，IFN-alpha对GR核转位没有影响，p38 MAPK的抑制并没有显著减弱IFN-alpha对于GR功能的影响，这表明Jak-STAT信号通路可能是mIFN-α对GR影响的更相关的介体。

干扰素-α的许多作用由Jak-STAT信号介导，包括对恶性细胞的初级病毒防御和免疫监视(Caraglia等人，2005年;普拉塔尼亚斯，2005年;Platanias and Fish，1999年). 激活后，I型IFN-α受体在脂质双层内二聚，允许这些受体的转磷酸化。IFN-α受体反过来磷酸化关键的Jak酪氨酸残基。磷酸化的Jak酪氨酸部分然后从细胞质中募集无活性的STAT单体，如STAT1、STAT2和STAT5。这些STAT被活化的Jaks磷酸化，导致STAT二聚体化和随后的核移位，其中这些复合物起转录因子的作用(Platanias，2005年;罗加茨基和伊瓦什基夫，2006年). 关于GR，数据表明，IFN-α诱导的Jak-STAT通路激活通过STAT5-GR蛋白-蛋白质相互作用导致GR功能抑制。这些数据与IL-2处理细胞后获得的类似结果一致(Biola等人，2001年;Goleva等人，2002年). 然而，与IFN-α不同，IL-2对GR功能的抑制（如上所述）似乎涉及GR易位的损害以及GR和STAT5之间的直接核蛋白-蛋白质相互作用(Goleva等人，2002年). 值得注意的是，催乳素也被证明通过STAT5-GR蛋白-蛋白质相互作用破坏了DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性。事实上，联合免疫沉淀研究表明，GR和STAT5在从同时使用催乳素和DEX处理的细胞获得的核提取物中相互作用(Stocklin等人，1996年). 有趣的是，虽然STAT5抑制DEX诱导的GR介导的基因转录，但GR的激活可能不会反过来抑制STAT-5介导的基因转录。STAT5调节基因β-酪蛋白就是这样。例如，与单独使用催乳素治疗相比，使用催乳激素和糖皮质激素治疗HC11乳腺上皮细胞会导致β-酪蛋白mRNA的表达增加(Stocklin等人，1996年). GR和STAT5之间的这种协同作用导致STAT5介导的基因转录增加，在肝细胞中也被描述为对生长激素的反应(Engblom等人，2007年). 最后，应该注意到IFN-α导致GR的核定位增加(图8)与DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性降低有关(图1). 这些数据表明，虽然STAT5-GR相互作用可能增加细胞核中的GR蛋白，但这些相互作用可能通过破坏与GR转录相关的类固醇受体辅因子的结合来抑制GR转录活性。

有趣的是，虽然STAT5似乎抑制GR功能，但在当前研究中，STAT1或STAT2对GR没有影响。值得注意的是，STAT1已被证明在IFN-α给药后小鼠大脑中IFN-α应答基因的诱导中发挥关键作用(Wang等人，2008). 然而，IFN-α激活Jak-STAT通路似乎会导致基因组和非基因组效应，包括STAT蛋白与包括GR在内的其他转录因子的相互作用。这种效应，特别包括STAT5与GR的相互作用，可能反过来影响相关糖皮质激素反应基因的下游表达。

尽管IFN-alpha对GR功能的影响是否普遍适用于初级海马神经元或位于其他脑区的神经元以及全身其他类型的细胞尚待确定，但STAT5对海马起源细胞系GR的抑制作用值得关注，鉴于海马GR在HPA轴功能调节中的作用(Herman等人，2005年). 海马形态和功能的改变与抑郁症相关(Duman等人，1997年)这些变化被认为是导致抑郁症患者HPA轴异常的原因。值得注意的是，我们的小组此前曾报道过，初次注射IFN-α后HPA轴的强烈反应与IFN-α诱导的抑郁症的易感性相关(Capuron等人，2003年). 此外，慢性IFN-α给药与昼间皮质醇曲线变平和夜间血浆皮质醇浓度增加有关，这两者都与抑郁症状有关(Raison等人，2008年). 在一定程度上，海马GR介导的CRH和HPA轴功能的反馈抑制受损可能与这些效应有关（正如重度抑郁症患者和皮质醇昼夜曲线平坦患者对DEX激发试验的反应改变所反映的那样）(Pariante，2004年;Raison等人，2008年;Spiegel等人，2006年)，本文的研究结果可能揭示干扰素α诱导相关临床人群神经内分泌变化和抑郁的可能分子机制。由于Jak STAT信号传导可能是这种作用的基础，因此抑制包括STAT5和/或Jak STAT信号传导途径在内的STAT蛋白可能是一种可能的治疗策略，用于使长期暴露于IFN-α或其他先天免疫细胞因子的患者的GR功能和情绪改变正常化。

总之，用mIFN-α治疗小鼠海马细胞系会干扰DEX诱导的GR活性。因为IFN-α被广泛用作各种疾病的免疫治疗，而且研究表明IFN-α诱导的抑郁症与HPA轴功能改变有关，这些数据对介导这些效应的病理生理机制提供了潜在的重要见解。STAT5上游Jak-STAT信号传导的中断以及STAT5基因表达的中断消除了mIFN-alpha对GR功能的影响。因此，STAT5与p38 MAPK一样(Wang等人，2004年)和Jun N末端激酶(Wang等人，2005年)，可能是GR信号受损的重要因素（及其与情绪障碍的关系）(Raison和Miller，2003年)因此，这可能是炎症加重患者发生抑郁症的病理生理学相关因素。

补充材料

01

补充图1HT22细胞表达小鼠IFN-α受体1。

为了确认小鼠HT22细胞中IFN-α受体的表达，HT22细胞在添加了10%FBS的DMEM中在60 mm培养皿中生长，以汇合。根据制造商说明，使用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）分离总RNA。提取后，将RNA样品溶解在无RNase的水中，并使用MBA 2000系统（美国康涅狄格州谢尔顿市佩金-埃尔默）测定其浓度和A260/280比率。然后使用SuperScript第一链合成系统实时（RT）聚合酶链式反应（PCR）（Invitrogen Life Technologies）和随机引物逆转录1μg总RNA。用于扩增小鼠IFN-α受体1 mRNA的引物为5′-CGAGGCGAAGTGGTTAAAAG-3′（正向）和5′-CCTGGCACAGCATTATT-3′（反向）。在优化引物浓度、模板浓度和PCR周期后，使用SuperMix（Invitrogen）进行PCR。PCR在94℃下保持2分钟，然后在94℃热循环35个周期15秒，60℃热循环15秒，然后在72℃热循环30秒。核提取物的RT-PCR分析显示HT22细胞表达小鼠IFN-α受体1的mRNA编码。

单击此处查看。（56万，百万分）

02

补充图2.

HT22细胞在转染亲本GFP构建物之前生长在盖玻片上，然后恢复16小时。然后用载体、IFN-alpha和/或DEX处理细胞，如下所述图4然后在−20°C下用甲醇固定/渗透细胞10分钟。然后在1X PBS中以0.5 mg/ml的速度添加4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma），然后在RT下培养10分钟。使用1X PBS洗涤3次，去除未结合染料。然后使用VECTASHIELD®荧光显微镜安装介质，使用DAPI（加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室）或ToPro（Invitrogen Life Technologies）安装盖玻片。使用尼康E800荧光显微镜观察GFP。

单击此处查看。（140万，ppt）

03

补充图3用mIFN-α治疗HT22细胞可诱导p-STAT1、p-STAT2、p-TAT5和p-p38表达。

用mIFN-alpha（100 U/ml）处理HT22细胞0、5、15、30或60 min，然后用Western blot检测整个细胞提取物中的STAT1、p-STAT1，STAT2，p-STAT2、STAT5、p-STAT5，p38和p-p38蛋白。

单击此处查看。（135K，ppt）

04

补充图4用Jak抑制剂I处理HT22细胞可阻断IFN-α诱导的全细胞p-STAT5表达。

在增加Jak抑制剂I浓度（0.01–1.0μM）的情况下，用mIFN-α（1000 U/ml）处理HT22细胞60分钟，然后通过Western blot检测整个细胞提取物中的STAT5和p-STAT5蛋白。显示的车道上都有相同的污点。

单击此处查看。（409000，ppt）

05

补充图5用SB203580处理HT22细胞可阻断mIFN-α诱导的全细胞p-p38表达。

在增加SB203580（10–20μM）浓度的情况下，用mIFN-α（1000 U/ml）处理HT22细胞60分钟，然后通过Western blot检测整个细胞提取物中的p38和p-p38蛋白。

单击此处查看。（63K，ppt）

06

补充图6用针对不同STAT的siRNA处理HT22细胞可选择性降低mIFN-α诱导的STAT1、STAT2和STAT5蛋白的表达。

将100 nM靶向或非靶向siRNA瞬时转染HT22细胞24小时，然后用mIFN-α治疗24小时。在48小时结束时，通过Western blot检测核提取物中的STAT蛋白，以确认STAT蛋白表达受到抑制（显示了每个siRNA的三个独立实验的代表性blot）。STAT蛋白的光密度表示为载体对照条件的百分比。与非靶siRNA和对照条件相比，每种情况下siRNA治疗的主要效果是（STAT1（F[3,8]=6.68，p<0.05）、STAT2（F[3]=11.31，p<0.01）和STAT5（F[8]=19.11，p<0.01），靶siRNA治疗导致各自STAT蛋白显著降低（p<0.05）。

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致谢

本研究由NIMH（MH069124和MH075102）资助。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

工具书类

  • Abbas AK，Lichtman AH。细胞和分子免疫学。5.桑德斯；宾夕法尼亚州费城：2003年。[谷歌学者]
  • Biola A、Lefebvre P、Perrin-Wolff M、Sturm M、Bertoglio J、Pallardy M。白细胞介素-2通过涉及STAT5（信号转导子和转录激活子5）而非AP-1的机制抑制糖皮质激素受体转录活性。分子内分泌学。2001;15:1062–1076.[公共医学][谷歌学者]
  • Cai W，Khoustov VI，Xie Q，Pan T，Le W，Yoffe B.干扰素-α诱导的糖皮质激素和血清素受体的调节是抑郁症的一种机制。[见评论]《肝病杂志》。2005;42:880–887.[公共医学][谷歌学者]
  • Capuron L、Raison CL、Musselman DL、Lawson DH、Nemeroff CB、Miller AH。首次注射干扰素-α后HPA轴反应过度与干扰素治疗期间抑郁的发生相关。美国精神病学杂志。2003;160:1342–1345.[公共医学][谷歌学者]
  • Caraglia M、Marra M、Pelaia G、Maselli R、Caputi M、Marsico SA、Abbruzzese A.α-干扰素及其对信号转导途径的影响。细胞生理学杂志。2005;202:323–335.[公共医学][谷歌学者]
  • De Kloet ER、Vreugdenhil E、Oitzl MS、Joels M.健康与疾病中的脑皮质激素受体平衡。内分泌评论。1998;19:269–301.[公共医学][谷歌学者]
  • Duman RS、Heninger GR、Nestler EJ。抑郁症的分子和细胞理论。[见注释]普通精神病学档案。1997;54:597–606.[公共医学][谷歌学者]
  • Engler H，Bailey MT，Engler A，Stiner-Jones LM，Quan N，Sheridan JF。白细胞介素-1受体1型缺陷小鼠未能在脾脏中形成与社会应激相关的糖皮质激素抵抗。心理神经内分泌学。2008;33:108–117. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Engblom D、Kornfeld J、Schwake L、Tronche F、Reinmann A、Beug H、Hennighausen L、Moriggl R、Schutz G。肝细胞中糖皮质激素受体-Stat5的直接相互作用控制着体型和成熟相关基因的表达。基因与发育。2007;21:1157–1162. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Galighana MD、Scruggs JL、Herrington J、Welsh MJ、Carter-Su C、Housley PR、Pratt WB。糖皮质激素受体通过细胞质到细胞核的热休克蛋白90依赖性（格尔德霉素抑制）运动需要完整的细胞骨架。分子内分泌学。1998;12:1903–1913.[公共医学][谷歌学者]
  • Goleva E，Kisich KO，Leung DY.STAT5在IL-2诱导的糖皮质激素抵抗发病机制中的作用。免疫学杂志。2002;169:5934–5940.[公共医学][谷歌学者]
  • Guiochon-Mantel A、Delabre K、Lescop P、Milgrom E.恩斯特·谢林海报奖。类固醇激素受体的细胞内运输。类固醇生物化学与分子生物学杂志。1996;56:3–9.[公共医学][谷歌学者]
  • 宾夕法尼亚州希思科特。抗病毒治疗：慢性丙型肝炎。病毒性肝炎杂志。2007;14:82–88.[公共医学][谷歌学者]
  • Herman JP、Ostrander MM、Mueller NK、Figueiredo H.应激调节的边缘系统机制：下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴。神经心理药理学和生物精神病学进展。2005;29:1201–1213.[公共医学][谷歌学者]
  • Holsboer F.抑郁症的皮质类固醇受体假说。神经精神药理学。2000;23:477–501.[公共医学][谷歌学者]
  • Irusen E、Matthews JG、Takahashi A、Barnes PJ、Chung KF、Adcock IM。p38丝裂原活化蛋白激酶诱导的糖皮质激素受体磷酸化降低其活性：在类固醇敏感性哮喘中的作用。过敏与临床免疫学杂志。2002;109:649–657.[公共医学][谷歌学者]
  • Ising M，Kunzel HE，Binder EB，Nickel T，Modell S，Holsboer F.地塞米松/CRH联合检测作为抑郁症的潜在替代指标。神经心理药物生物精神病学进展。2005;29:1085–1093.[公共医学][谷歌学者]
  • Miller AH，Pariante CM，Pearce BD。细胞因子对糖皮质激素受体表达和功能的影响。糖皮质激素抵抗与抑郁症的相关性。高级实验医学生物。1999;461:107–116.[公共医学][谷歌学者]
  • 内默洛夫CB。抑郁症的促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）假说：新发现和新方向。分子精神病学。1996;1:336–342.[公共医学][谷歌学者]
  • Norbiato G、Bevilacqua M、Vago T、Clerici M。获得性免疫缺陷综合征中的糖皮质激素和干扰素α。临床内分泌代谢杂志。1996;81:2601–2606.[公共医学][谷歌学者]
  • 佩斯·TWW，胡·F，米勒·AH。细胞因子对糖皮质激素受体功能的影响：与糖皮质激素抵抗以及抑郁症的病理生理学和治疗相关。大脑、行为和免疫。2007;21:9 – 19. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pariante CM。抑郁症患者体外糖皮质激素受体功能。强调。2004;7:209–219.[公共医学][谷歌学者]
  • Pariante CM、Pearce BD、Pisell TL、Sanchez CI、Po C、Su C、Miller AH。促炎细胞因子白细胞介素-1α可减少糖皮质激素受体移位和功能。内分泌学。1999;140:4359–4366.[公共医学][谷歌学者]
  • Platanias LC。I型和II型干扰素介导的信号机制。自然评论。免疫学。2005;5:375–386.[公共医学][谷歌学者]
  • Platanias LC，Fish EN。干扰素激活的信号通路。实验血液学。1999;27:1583–1592.[公共医学][谷歌学者]
  • Quan N、Avitsur R、Stark JL、He L、Shah M、Caligiuri M、Padgett DA、Marucha PT、Sheridan JF。社会压力增加了内毒素休克的易感性。神经免疫学杂志。2001;115:36–45.[公共医学][谷歌学者]
  • Raber J、Koob GF、Bloom FE。干扰素α和转化生长因子β1调节杏仁核促肾上腺皮质激素释放因子的释放：与下丘脑反应的比较。国际神经化学。1997;30:455–463.[公共医学][谷歌学者]
  • Raison CL、Borisov AS、Woolwine BJ、Massung B、Vogt GJ、Miller AH。干扰素-α对昼间下丘脑-垂体-肾上腺轴活动的影响：与促炎细胞因子和行为的关系。分子精神病学。2008epub，1-13。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Raison CL、Demetrashvili M、Capuron L、Miller AH。干扰素-α的神经精神不良反应：识别和管理。中枢神经系统药物。2005;19:105–123. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Raison CL，Miller AH公司。糖皮质激素信号不足在应激相关疾病病理生理学中的作用。美国精神病学杂志。2003;160:1554–1565.[公共医学][谷歌学者]
  • Rogatsky I，Ivashkiv LB.细胞因子信号的类葡萄糖调节。组织抗原。2006;68:1 – 12.[公共医学][谷歌学者]
  • Spiegel D，Giese-Davis J，Taylor CB，Kraemer H。转移性乳腺癌的应激敏感性：下丘脑-垂体-肾上腺轴功能分析。心理神经内分泌学。2006;31:1231–1244. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stocklin E，Wissler M，Gouilleux F，Groner B.Stat5与糖皮质激素受体之间的功能相互作用。自然。1996;383:726–728.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang J，Campell IL，Zhang H。系统性干扰素-α调节中枢神经系统中的干扰素刺激基因。分子精神病学。2008;13:293–301.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang X、Wu H、Lakdawala VS、Hu F、Hanson ND、Miller AH。抑制Jun N末端激酶（JNK）可增强小鼠海马HT22细胞糖皮质激素受体介导的功能。神经精神药理学。2005;30:242–249.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang X、Wu H、Miller AH。白细胞介素-1α诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶激活抑制糖皮质激素受体功能。分子精神病学。2004;9:65–75.[公共医学][谷歌学者]