乙醇诱导肝损伤发病机制中的早期补体依赖性和TLR-4非依赖性阶段

摘要

介绍

酒精性肝病（ALD）的发展是一个复杂的过程，涉及肝脏中的实质细胞和非实质细胞，以及肝脏对损伤和炎症的反应中其他类型细胞的募集(1). 越来越多的证据表明，在慢性乙醇暴露期间，先天免疫反应的不同成分被激活。例如，库普弗细胞，即肝脏中的常驻巨噬细胞，在慢性乙醇诱导的肝损伤中起着重要作用(2). 内毒素/脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种成分，在长期乙醇暴露期间是Kupffer细胞的重要激活剂，导致促炎细胞因子和趋化因子的产生增加(三;4)以及活性氧（ROS）(5). 缺乏toll样受体4（TLR-4）复合物成分的小鼠(TLR4级−/−或CD14号机组−/−），以及TNF受体I(TNFRI公司−/−），可防止慢性乙醇诱导的脂肪变性、炎症和早期纤维化(三;4).

补体也与慢性乙醇诱导的肝损伤有关(6–8). 慢性乙醇喂养小鼠6-8周会增加C3的激活，3^第个补体途径的成分，增加血浆中C3a的浓度(6)以及C3在肝脏中的沉积(9). 缺乏C3的小鼠(C3类−/−）不会因长期摄入乙醇而导致脂肪变性(6;8). 相反，缺乏C5的小鼠(C5级−/−）仍表现出肝脏甘油三酯增加，以应对长期乙醇暴露，它们完全免受乙醇诱导的ALT和炎症细胞因子增加的影响(6). 缺乏CD55/DAF（一种补体调节蛋白）的小鼠对慢性乙醇喂养的反应表现为脂肪变性、ALT和炎性细胞因子加重，这表明CD55/DAF可以阻止慢性乙醇诱导的肝损伤(6).

先天免疫反应在乙醇诱导的肝损伤中的作用的研究通常集中在相对较长的乙醇暴露时间（4-8周）。然而，先天免疫反应的激活可能是对各种侮辱的早期反应。特别是，补体的激活是对感染、组织损伤或压力的快速反应；补体的快速激活有助于协调先天免疫的不同方面，并提供与适应性免疫反应的联系(10). 因此，我们假设先天免疫反应的激活，包括促炎细胞因子的表达增加和补体的激活，可能是对乙醇暴露的早期反应。在此，我们报告称，在肝脏中甘油三酯积聚或血浆中ALT升高之前，乙醇暴露会导致补体激活产物和TNF-α表达的早期短暂增加。重要的是，在乙醇喂养期间，肿瘤坏死因子-α表达的早期短暂增加需要Kupffer细胞以及C3a受体或C5a受体。然而，与TLR-4对乙醇对肝脏的长期、慢性影响的贡献相反(三)早期乙醇诱导的补体激活和TNF-α表达与TLR-4无关。这些数据说明了在肝脏对乙醇反应的早期，先天免疫反应的多个成分之间的特定动态相互作用。

方法

结果

为了解决先天免疫反应和乙醇诱导肝损伤之间的相互作用，我们让雌性C57BL/6小鼠随意随着乙醇浓度的增加，获得Lieber-DeCarli乙醇饮食(图1). 乙醇喂养的小鼠继续以与配对喂养的对照组相同的速度生长(图1A). 在乙醇喂养的小鼠中，肝甘油三酯(图1B)和血浆ALT(图1C)肝细胞损伤标志物，早在7d（4%d3）时即增加。在整个乙醇喂养期间，肝甘油三酯继续以稳定的速度积聚(图1B). 尽管血浆ALT在接触5%乙醇的第一周内最高(图1C)，血浆ALT在乙醇喂养期间保持升高。

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图1

C57BL/6小鼠肝甘油三酯蓄积、血浆ALT和肝细胞因子表达的时间进程随意乙醇供给

允许小鼠自由进食含乙醇浓度增加的液体食物（2%，2%，4%，7%，然后再添加4周）。A）乙醇喂养和配对喂养小鼠的体重。B）总甘油三酯和C）测定血浆ALT活性。对于面板A、 B和C，数值表示平均值±SEM，除第32天外，每个时间点的n=至少5（对喂食）和10（乙醇喂食），其中n=7（乙醇喂吃）。不同上标的数值之间存在显著差异，p<0.05。对于面板D、 E和F，裂解物由冷冻肝脏和TNFα制备（D），IL-6（E）和干扰素-γ（F）用ELISA测定蛋白质。将肝细胞因子归一化为成对喂养的百分比。成对喂养时肝细胞因子浓度没有随时间变化（数据未显示）。在2%的d2时间点，两人喂养的TNF-α、IL-6 45±3 pg/mg和IFN-γ133±10 pg/mg蛋白的浓度分别为42±6 pg/mg、45±3。数值表示每个时间点的平均值±SEM，n=至少3（双馈）和7（乙醇馈）*在每个时间点，与配对喂养的小鼠相比，p<0.05。

众所周知，在乙醇诱导的肝损伤中，一些炎症细胞因子的表达增加；TNF-α在乙醇性肝损伤的发生发展中起重要作用(4;17). 对我们的乙醇喂养小鼠的分析表明，仅在乙醇喂养4天后（2%d2），肝脏中的TNF-α蛋白短暂增加，7天后（4%d3）下降到基线以下(图1D). 在对乙醇的反应早期，IFN-γ和IL-6的表达也表现出类似的快速和短暂诱导(图1E和1F). 在这一初始反应后，肝脏TNF-α和IFN-γ在喂食5%wk4乙醇后再次升高(图1D-E)，以前关于慢性乙醇喂养后肝脏TNF-α表达增加的典型报道(6). 免疫组织化学染色显示TNF-α蛋白在整个肝脏中表达(图2A); ELISA法测定与TNF-α浓度相关的染色强度(图1D). 用巨噬细胞特异性标记物F4/80和TNF-α进行的共定标研究表明，F4/80阳性细胞在乙醇喂养后具有较高的TNF-β免疫染色（2%d2）(图2B)

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图2

乙醇喂养野生型小鼠肝脏TNF-α蛋白的免疫组化分析及乙醇对其影响TNFRI公司−/−小鼠

A）在C57BL/6小鼠的冷冻肝脏切片中观察到免疫反应性TNF-α。B）石蜡包埋切片中可见F4/80（绿色）和TNF-α（红色）的共放大。图像代表每个时间点至少3只老鼠。C/D/E）C57BL/6和TNFRI公司允许−/−小鼠自由摄入11天（4%第7天）含乙醇的饮食或双喂对照饮食。B）总肝甘油三酯和C）测定血浆ALT活性。数值代表平均值±SEM，n=6（双馈）和n=10（乙醇馈C57BL/6），n=3（双馈和乙醇馈）TNFRI公司−/−. 带有不同上标的值之间存在显著差异，p<0.05。D）在福尔马林固定的肝脏切片中，通过免疫组织化学观察到免疫反应性4-羟基壬醛（4-HNE）加合物。图像代表每个时间点至少3只老鼠。

为了评估肝TNF-α早期峰值的病理生理学意义，我们评估了乙醇诱导肝损伤的标志物TNFRI公司在肝脏TNF-α瞬时升高后，喂食乙醇11天（4%d7）的−/−小鼠。在野生型小鼠中，肝脏甘油三酯(图2C)，血浆ALT(图2D)以及4-羟基壬醛加合物的积累(图2E)乙醇暴露后第11天（4%d7），脂质过氧化程度增加。相反，虽然肝甘油三酯仍在TNFRI公司−/−小鼠(图2C)在没有TNF受体I的情况下，乙醇喂养不会增加ALT和4-羟基壬醛加合物(图2D/E） ●●●●。

接下来，我们讨论了早期乙醇诱导的肝脏TNF-α增加的分子机制。当小鼠摄入1%或2%乙醇时，在黑暗/喂食期3小时后测得的血浆乙醇浓度无法检测到(图3A). 相反，当饮食中乙醇浓度为4%或更高时，血浆中乙醇浓度增加(图3A). CYP2E1的表达在长期乙醇喂养后（5%wk4）被诱导，但在第4天尚未增加（2%d2）(图3B). 类似地，在5%wk4时，4-羟基壬醛加合物（脂质过氧化的一种测量方法）增加，但在第4天（2%d2）未检测到加合物(图3C). 在第4天（2%d2），血浆脂联素浓度和富含血小板的血浆中的内毒素浓度均未受到乙醇喂养的影响（数据未显示）。

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图3

血浆乙醇、肝脏CYP2E1表达和4-羟基壬醛加合物形成

A）在喂食/黑暗循环后3小时测量血浆乙醇浓度。数值代表平均值±SEM，n=3（双馈）和6–10（乙醇馈）。B）Western blot检测第4天（2%d2）和第39天（5%wk 4）肝裂解物中的免疫反应性CYP2E1蛋白。数值以成对喂食的增加百分比表示，并表示平均值±SEM，n=4，*p<0.05。C）在第4天（2%d2）和第39天（5%wk 4）的小鼠福尔马林固定肝切片中，通过免疫组织化学观察到免疫反应性4-羟基壬醛（4-HNE）加合物。图像代表每个时间点至少3只老鼠。

我们最近的研究(6)和其他(8)在慢性乙醇诱导的肝损伤中与补体激活有关。由于补体激活产生C3a和C5a，这是增加炎症细胞因子生成的过敏毒素，我们接下来研究了在乙醇喂养期间补体激活的时间过程。我们之前已经证明，6周的乙醇喂养会增加血清C3a浓度(6). 在这里，我们采用了另一种方法，并使用产生的抗体检测C3的C3b-iC3b/C3c（此处缩写为C3b）部分在卵裂后发现的新上皮细胞(18). 免疫组织化学显示在第4天C3b沉积快速短暂增加（2%d2）(图4A)，与TNF-α表达动力学平行(图2). 随后，在喂食5%wk4乙醇时，C3b积累(图4A). 第4天，与TNF-α的定位相反，C3b沉积集中在肝窦区。

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图4

乙醇会快速短暂地增加野生型肝脏中C3b的沉积，但不会C3类−/−，喂食乙醇期间的小鼠

A）野生型小鼠可以自由食用含乙醇的食物或双喂对照食物。在冷冻肝脏切片中可见免疫反应性C3b-iC3b/C3c。图像代表每个时间点至少3只老鼠。B） 野生型和C3类允许−/−自由摄入含乙醇的饮食4天（2%d2）。冰冻肝切片免疫组化检测C3b和TNF-α。图像代表了每个实验组至少3只小鼠。

如果在这些早期时间点，乙醇诱导的TNF-α增加需要补体激活，则不应在C3类乙醇喂养期间的−/−小鼠。正如预期的那样，在缺乏C3蛋白的情况下，在C3类喂食乙醇第4天（2%d2）时的−/−小鼠(图4B). 此外，乙醇诱导的TNF-α蛋白增加在C3类−/−与第4天的野生型小鼠相比（2%d2）(图4B)认为补体激活是乙醇诱导TNF-α表达早期增加所必需的。

补体激活产生C3a和C5a，它们在与受体C3aR或C5aR相互作用时诱导炎性细胞因子的表达。因此，我们接下来使用缺乏C3aR的小鼠(C3aR−/−）或C5aR(C5aR公司−/−），以确定是否需要其中一个或两个受体来早期增加伴随乙醇喂养的肝脏TNF-α表达。而野生型小鼠喂食乙醇4天后（2%d2）肝脏TNF-α表达增加(图5)，两种情况都没有增加C3aR公司−/−或C5aR公司−/−小鼠(图5). 在来自C3aR公司−/−和C5aR公司第4天喂食乙醇后的−/-（数据未显示），表明乙醇诱导的TNF-α表达的消失是由于这些敲除菌株中缺少C3aR或C5aR，而不是缺乏补体激活。

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图5

乙醇不会增加肝脏中TNF-α的表达C5aR公司−/−或C3aR公司−/−小鼠

A） C3aR公司和C5aR公司允许−/−小鼠和野生型小鼠（WTaR）自由进食含乙醇的液体食物4天（2%第2天），并在冷冻肝脏切片中通过免疫组织化学检测TNF-α。B）肝切片中免疫反应性TNF-α的定量。数值代表平均值±SEM，n=4-6，*p<0.05（与双喂相比）。

先前的研究表明，乙醇诱导的LPS增加及其与Kupffer细胞TLR-4的相互作用是慢性乙醇诱导的肝TNF-α生成和随后的肝损伤的重要因素(2;4;17). 此外，TLR-4和C3a受体/C5a受体信号协同增加细胞因子的表达(19;20). 因此，我们接下来研究补体、Kupffer细胞和TLR-4之间的相互作用是否是乙醇诱导早期TNF-α表达增加所必需的。我们用氯膦酸钠处理小鼠，以在暴露于乙醇之前耗尽枯否细胞(16). F4/80的定位显示，在氯膦酸钠治疗后4天，乙醇喂养和配对喂养小鼠的Kupffer细胞均显著减少(图6A). 而Kupffer细胞的缺失并不影响乙醇诱导的C3b沉积(图6B)，Kupffer细胞的缺失消除了乙醇对肝脏TNF-α表达的诱导作用(图6C). 相反，TLR-4的缺失对早期乙醇诱导的C3b沉积或TNF-α表达的增加没有影响(图7).

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图6

肝巨噬细胞耗竭可阻止乙醇诱导的早期肝TNF-a表达增加，但不能阻止C3b沉积

在乙醇暴露4天（2%第2天）之前，用含有PBS或氯膦酸盐的脂质体预处理小鼠以耗尽库普弗细胞。免疫组织化学分析A）在福尔马林固定的肝切片中测量F4/80B）C3b和C）在冷冻肝脏切片中评估TNF-α。图像代表了每个实验组至少3只小鼠。

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图7

乙醇增加肝脏C3b沉积和TNF-α表达TLR4级−/−小鼠

野生型和TLR4级允许−/−小鼠自由进食含乙醇的食物4天（2%第2天）。在冷冻肝脏切片中进行C3b和TNF-α的免疫组织化学分析。图片代表了至少3只老鼠。

讨论

乙醇诱导的肝损伤的病理生理学发展遵循脂肪变性、肝细胞损伤和炎症的特征模式，在某些情况下发展为纤维化和肝硬化。虽然在人类中，这一过程可能需要数年时间，但在动物模型中，脂肪变性和肝细胞损伤的早期阶段可以在数周内重现。LPS激活肝巨噬细胞、炎性细胞因子（尤其是TNF-α）表达增加、补体激活和ROS生成都是慢性乙醇诱导肝损伤的重要因素(三–5). 然而，这些不同贡献者的动态尚不清楚。在此，我们发现，在乙醇诱导肝甘油三酯积累、血浆ALT升高、CYP2E1诱导和4-HNE加合物积累之前，肝脏TNF-α表达早期增加。在缺乏C3、C3aR或C5aR的小鼠中未观察到这种早期、短暂的TNF-α增加，这表明乙醇介导的补体激活以及C3a和C5a与其受体的相互作用有助于早期诱导TNF-a表达(图8). 乙醇激活补体不涉及肝巨噬细胞；然而，乙醇诱导的早期肝TNF-α增加需要巨噬细胞。有趣的是，早期乙醇诱导的C3b沉积增加或TNF-α积累都不需要TLR-4。综上所述，我们的数据表明，接触乙醇会迅速激活先天免疫的多种成分，包括补体、枯否细胞和炎性细胞因子的产生；这些途径之间的协同作用是乙醇诱导肝损伤的重要机制。

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图8

乙醇诱导肝损伤发病机制中早期互补依赖期的图示

1)向小鼠喂食乙醇会导致补体的早期激活，C3b在肝脏中的沉积证明了这一点。C3a和C5a与它们的受体相互作用，很可能位于Kupffer细胞表面，以刺激TNF-α的表达。然后，肝脏中的TNF-α表达被放大，因为肝细胞也会产生TNF-β。TNF-α表达的早期阶段与TLR-4无关。2） 在较长时间的乙醇暴露后，TLR-4依赖性和补体依赖性途径都有助于乙醇诱导的肝损伤的进一步发展。

最近的研究已确定补体途径是慢性乙醇诱导肝损伤的重要调节器，两者都有C3类−/−和C5级−/−小鼠免受长期摄入乙醇的特定影响(6;8).CD55/DAF公司−/−小鼠缺乏一种重要的补体调节蛋白，在长期乙醇喂养后表现出更严重的损伤(6). 有趣的是，C3或C5的缺乏对慢性乙醇诱导的肝损伤具有不同的保护作用。喂食6周乙醇后，C3类−/−小鼠虽然免受乙醇诱导的脂肪变性的影响，但仍表现出炎症细胞因子的表达增加，包括TNF-α、IL-6和IFN-γ，以及ALT的适度增加。相比之下，慢性乙醇喂养不会增加小鼠的肝细胞因子或ALTC5级−/−小鼠，即使它们发生脂肪变性(6). 这些数据表明，在长期乙醇暴露期间，C3和C5对脂肪变性、肝细胞损伤和炎性细胞因子产生增加的贡献不同。

在此，我们进一步描述了补体激活在肝脏对乙醇反应中的作用，确定了C3aR和C5aR在肝脏TNF-α表达的早期、补体依赖性增加中的重要作用。C3a和C5a是有效的过敏毒素，能够增加炎症细胞因子反应(21)导致多种慢性炎症疾病，包括心肌缺血再灌注、呼吸窘迫综合征、关节炎和抗体依赖性II型自身免疫(21;22). 在健康肝脏中，枯否细胞和星状细胞同时表达C3a和C5a受体。炎症细胞因子可诱导肝细胞中C5a受体的表达(23)或再生肝细胞(24). 虽然慢性乙醇喂养（5%wk4）没有增加肝脏总C3aR或C5aR mRNA（数据未显示），但C3aR和C5aR的缺失阻止了乙醇诱导的早期肝TNF-α的增加(图5). 虽然目前的研究表明C3a和C5a都有助于乙醇诱导的早期TNF-α增加，但我们早期的研究表明，C5a而不是C3a对慢性乙醇喂养后乙醇诱导的炎症细胞因子表达持续增加更为重要(6). 长期接触乙醇后，C5a在肝损伤中的作用更大，这可能与C5a向感染/损伤部位募集中性粒细胞的能力有关(25;26). 另外，虽然C3a具有多种促炎特性，但在某些条件下，它也具有抗炎活性。例如，C3a受体敲除小鼠在内毒素血症模型中表现出更高的敏感性，表明C3a受体具有重要的抗炎作用(27).

虽然C3aR和C5aR都需要用于早期乙醇诱导的肝TNF-α增加，但TLR-4不需要用于此反应。这与TLR-4在调节慢性乙醇暴露引起的TNF-α表达增加和肝损伤中的关键作用相反(三,4). TLR-4在早期与慢性乙醇诱导的TNF-α表达中的作用差异可能是由于本研究中使用的乙醇剂量相对较低和/或乙醇暴露时间较短。因此，虽然我们的数据表明肝脏细胞因子表达的早期增加主要依赖补体激活，但其他因素，包括TLR-4的激活和ROS的增加(三,4)在乙醇诱导的肝损伤后期，有助于持续产生炎症细胞因子。

系统补体的激活可以通过经典途径、凝集素途径和替代途径启动，尽管蛋白酶激活C5的额外外源途径在某些病理生理条件中可能起作用(28;29). Kupffer细胞局部产生和激活C5也有助于小鼠II型自身免疫损伤(21). 需要更多的研究来确定复杂的肝脏细胞环境中C5的局部激活是否有助于乙醇诱导的肝损伤。

以前的报告表明TNFRI公司使用4周以上的乙醇灌胃给药，可以保护−/−小鼠免受乙醇诱导的慢性肝损伤(三;4). 在这里，我们暴露了TNFRI公司当最初在野生型小鼠中观察到损伤标记物增加时，为了更直接地评估肝脏TNF-α早期增加在介导随后的乙醇诱导肝损伤中的作用，在较短的时间内（4%d7）使用乙醇。这个TNFRI公司−/−小鼠在第11天完全免受乙醇诱导的ALT和4-羟基壬醛加合物积累增加的影响，但仍表现出肝脏脂肪变性。这些数据支持这样的假设，即TNF-α的早期增加是ROS生成增加和肝细胞损伤所必需的。TNF-α在乙醇诱导的丙氨酸氨基转移酶升高和脂肪变性中的作用的这种二分法与越来越多的证据相一致，这些证据表明，与甘油三酯积累相比，不同的机制有助于乙醇诱导的谷胱甘肽氨基转移酶增加。例如，C5级在慢性乙醇暴露期间，−/−可防止细胞因子和ALT增加，但不会导致甘油三酯积累(6). 或者，在乙醇暴露的早期，肝脂肪变性可能更依赖于NADH/NAD比值的变化，这是由乙醇代谢引起的，导致β-氧化减少，而不是依赖补体和炎症细胞因子的甘油三酯积累机制，这些细胞因子涉及调节脂肪酸合成的基因上调和脂肪酸氧化相关基因下调，以及VLDL分泌受损(30).

我们的研究表明，补体对于乙醇诱导的TNF-α的早期表达是必要的，库普弗细胞也参与介导乙醇对肝脏炎症细胞因子表达的早期影响。Kupffer细胞的作用可能是由于乙醇暴露早期的C3aR和C5aR信号转导，而与TLR-4的激活无关。因此，本研究阐明了在肝脏对乙醇的反应过程中，先天免疫系统的多种元素的复杂整合。值得注意的是，单一成分的缺乏，如C3aR或C5aR的缺乏，阻止了乙醇诱导的TNF-α表达的早期增加。因此，这些数据增加了我们对肝脏对侮辱的高度协调反应的理解，例如乙醇引起的损伤。

致谢

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