鲜血。2009年4月2日；113(14): 3333–3336.
吞噬细胞、粒细胞和骨髓生成
宿主唾液酸化聚糖的分子模拟允许细菌病原体与中性粒细胞Siglec-9结合并抑制先天免疫反应
,1,* ,1,* ,1 ,1 ,1和
1 亚伦·F·卡林
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
内山佐治
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
Yung-Chi Chang（永志昌）
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
阿曼达·L·刘易斯
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
维克托·尼泽特
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
阿吉特·瓦尔基
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
1加州大学圣地亚哥分校拉荷亚分校医学系、儿科系、细胞与分子医学系
通讯作者。 *答：。F.C.和S.U.对这项研究做出了同等贡献。
收稿日期：2008年11月3日；2009年1月16日接受。
摘要
人类中性粒细胞Siglec-9是一种凝集素，通过氨基末端V-set Ig结构域识别唾液酸（Sias），并在其细胞质尾部具有基于酪氨酸的抑制基序。我们假设Siglec-9将宿主Sias识别为“自我”，包括顺式中性粒细胞自身表面与Sias相互作用，从而抑制不需要的中性粒细胞反应性。在这里，我们发现中性粒细胞与固定化的多聚Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc单元结合在trans中通过Siglec-9。B组唾液酸化荚膜多糖链球菌（GBS）也呈现末端Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc单位，类似地与中性粒细胞Siglec-9结合，以Sia-和Siglec-9-依赖的方式抑制中性粒细胞反应。GBS唾液酸化荚膜多糖与Siglec-9的相互作用也促进了中性粒细胞氧化爆发的减少、中性粒细胞胞外DNA陷阱的形成减少以及细菌存活率的提高。因此，GBS可以通过唾液聚糖分子模拟（细菌免疫逃避的一种新机制）激活宿主抑制受体，从而损害中性粒细胞的防御功能。
介绍
虽然脊椎动物天然免疫细胞的抗菌特性已被广泛研究，但对抑制炎症反应的机制了解较少。这种消极的调控系统可能被微生物破坏。相关的兴趣是哺乳动物唾液酸（Sia）端接唾液聚糖的“分子模拟”，这些唾液酸是人类的专性共生体或潜在病原体。1表面Sia的表达可以钝化替代途径补体的激活并降低免疫原性。1然而，这可能无法完全解释脊椎动物唾液聚糖近完美模拟物的聚合细菌进化。例如，人类特有的共生/病原体组B链球菌（GBS）含有一种荚膜多糖（CPS），其结构为Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc，2与人类糖蛋白末端常见的序列相同的序列。
识别Sia的免疫球蛋白超家族凝集素（Siglecs）是在免疫细胞上表达的I型跨膜蛋白。三,4CD33-related Siglecs（CD33rSiglecs）的快速进化亚群被假定（但未被证明）通过识别宿主唾液聚糖来负性调节炎症反应。三许多CD33rSiglecs具有保守的细胞质酪氨酸基基基序，包括膜近端免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）和膜远端ITIM样基序。三,4宿主Sias的广泛表达和免疫细胞上同源ITIM携带的CD33rSiglecs的显著性表明，它们可能在“自我”识别中发挥作用，抑制先天免疫反应以防止自身反应。三
CD33rSiglec与唾液酸化配体结合的功能结果尚不清楚。交叉链接抗体和/或Siglec转染到Siglec缺陷细胞系已证明ITIM和ITIM样基序对抑制细胞活化和增殖的重要性，5–12甚至诱导细胞凋亡。13,14然而，非天然转染细胞和/或非天然配体的抗Siglec抗体的使用限制了对此类数据的解释。
虽然CD33r-Siglecs识别同一细胞表面的Sias（所谓的顺式相互作用），15相邻细胞表面或多价探针上的高密度Sias，16重唾液酸化糖蛋白，17–19或细菌CPS20可以与Siglecs交战在trans中可能会超过顺式-接触部位的Sia配体。
这里我们展示了唾液聚糖结扎在trans中可以通过Siglec-9传递负调控信号，Siglec-8在人类中性粒细胞上表现突出。三,4功能结果是GBS通过宿主唾液聚糖的分子模拟，对先天免疫进行破坏。
方法
细菌
GBS COH1是一种高度封装的血清型III菌株，在37°C的Todd-Hewitt肉汤中繁殖至对数生长期。
中性白细胞
根据《赫尔辛基宣言》，根据加州大学圣地亚哥分校人类受试者机构审查委员会批准的方案，正常人类志愿者在获得知情同意的情况下，捐献小样本用于中性粒细胞的分离。使用Polymorphprep（挪威奥斯陆Axis-Shield）进行分离。为了进行预标记，中性粒细胞被重新悬浮在500μL Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，Ca−，镁− +/−calcein-AM（Invitrogen，Carlsbad，CA）在37°C下保持30分钟，清洗3次，并在1.5 mL HBSS中重新悬浮。
中性粒细胞与聚糖的结合
将pH为9.4的碳酸盐缓冲液中的天然或合成聚糖添加到96 well Immulon 4HBX板（Thermo Electron，Waltham，MA）中（100μL），在4°C下培养过夜，洗涤3次，并在室温下用磷酸盐缓冲盐（PBS）加3%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。添加标记的中性粒细胞，并测量初始荧光强度（FI）。30分钟后，使用12孔多通道移液器用PBS去除非粘附性中性粒细胞，并测量最终FI。
Siglec-9的抗体抑制
中性粒细胞在有或无NBSAb（小鼠IgG1克隆E10-286；BD Biosciences Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥）或BSAb（鼠IgG2a克隆191240；明尼阿波利斯研发系统公司，明尼苏达州）的情况下以1:200的稀释度孵育5分钟，并在用于各种分析之前用HBSS加钙和镁加3%BSA清洗。
结果和讨论
人中性粒细胞对固定化α2-3连接Sias的依赖性粘附
中性粒细胞与含有多个Siaα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1拷贝的聚丙烯酰胺阵列表现出特异性结合，即使事先没有去除竞争性细胞表面的Sia(A） ●●●●。Siglec-9是中性粒细胞上的主要CD33rSiglec，它识别α2-3连接的Sias，并可能参与结合。为了研究这一点，我们使用Siglec-9-Fc嵌合蛋白的竞争分析验证了抗-Siglec-9 IgG小鼠单克隆抗体与Sia-结合位点（BSAb）反应或不与Sia结合位点（NBSAb）反应作为功能试剂。BSAb而非NBSAb抑制Siglec-9-Fc与Siaα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1包被孔的结合(B） ●●●●。因此，这两种抗体被确认为功能试剂，以分析阻断或不阻断Sia结合位点之间的差异。BSAb还选择性地减少中性粒细胞与含Sia-聚糖探针的相互作用(C） 证实CD33rSiglec可以介导与唾液聚糖的粘附作用在trans中，不排除竞争对手顺式西亚斯。唾液聚糖的高密度和/或其排列使其能够击败细胞表面唾液聚糖的竞争。
人中性粒细胞表面Siglec-9与唾液酸相互作用在trans中（A）中性粒细胞与固定化α2-3连接的Sias结合。用携带Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc或Galβ1-4GlcNAc多个拷贝的聚丙烯酰胺阵列对微孔进行涂层（100μL 1 mg/mL储备液稀释为1:100；GlycoTech，马里兰州盖瑟斯堡）。加入荧光标记的中性粒细胞，让其粘附，然后冲洗掉未结合的细胞。通过将最终FI除以初始FI并乘以100来确定粘附中性粒细胞的百分比。（B） IgG抗-Siglec-9 Sia结合位点（BSAb）和Sia非结合位点（NBSAb）抗体作为功能试剂的验证；96个平板在4°C的碳酸盐缓冲液（2μg/mL）中涂上100μL蛋白A过夜。然后将重组可溶性Siglec-9-Fc嵌合体添加到100μL酶联免疫吸附测定（ELISA）缓冲液（2μg/mL）中，在4°C下过夜。洗孔，在室温下用BSAb、NBSAb或PBS预处理30分钟，然后用ELISA缓冲液洗3次。然后在室温下用生物素化Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc聚丙烯酰胺阵列探针孵育微孔1小时，洗涤3次，用ELISA缓冲液中稀释为1:1000的链霉亲和素碱性磷酸酶孵育，然后再次洗涤，用100μL底物/孔培养微孔。（C） 中性粒细胞与固定化α2-3键唾液酸结合需要Siglec-9。如A组所述，在进行结合试验之前，用BSAb、NBSAb或PBS培养中性粒细胞。（D）中性粒细胞通过Siglec-9与GBS荚膜多糖的α2-3连接Sias结合。如前所述，使用变形酶（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）消化从GBS菌株COH1中分离出细胞壁提取物。23如前所述，使用离子交换和尺寸排除色谱法从细胞壁制剂中进一步纯化CPS。2纯化后的CPS与A组一样放置在微量滴定孔上。加入用BSAb或NBSAb预处理过的中性粒细胞，使其粘附，然后冲洗掉非粘附细胞。（E） 中性粒细胞通过Siglec-9与GBS细胞表面提取物结合。将未纯化的III型GBS（COH1）细胞表面提取物，包括唾液酸化的CPS，固定在ELISA孔中，并研究用BSAb或NBSAb预处理的中性粒细胞的结合，如图A所示。所有结果都代表了至少3个一式三份的实验。在30分钟的试验结束时，中性粒细胞的存活率约为85%，抗体对存活率或活化没有重大影响（数据未显示）。误差条代表SEM。
GBS对Siglec-9的唾液酸依赖性结合
血清型III GBS的CPS呈现末端Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc聚糖，这是一个类似于合成聚糖包被孔和天然人类细胞表面聚糖的序列，可以与重组Siglec-9-Fc相互作用。20为了确定GBS血清型III CPS是否可以通过这种分子模拟作用与人类中性粒细胞结合，我们将纯化的CPS放置在微孔中，并用唾液酸酶处理一个子集。中性粒细胞粘附在天然但未脱硅的CPS上（数据未显示）。BSAb而非NBSAb减少了结合(D） ●●●●。与固定化合成唾液聚糖一样，GBS血清Ⅲ型CPS上致密的Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc表达与中性粒细胞上的Siglec-9结合在trans中通过肽聚糖主干的突变酶裂解分离出包括更自然环境中的GBS CPS的III型GBS表面提取物。同样，中性粒细胞与这些提取物的结合是Sia依赖性的（未显示），并被BSAb选择性阻断(E） ，确认Siglec-9依赖性。
Siglec-9的GBS参与减弱人类中性粒细胞反应
中性粒细胞是识别并直接杀死微生物的特殊粒细胞。因为它们以Siglec-9依赖性的方式与唾液酸化血清Ⅲ型GBS CPS相互作用，我们测试了完整的活GBS改变功能反应的能力。通过细菌识别激活的中性粒细胞产生活性氧化物种，释放颗粒蛋白和染色质，形成中性粒细胞胞外陷阱（NET），诱捕并杀死细菌。21与NBSAb中的中性粒细胞相比，在BSAb存在下，中性粒细胞与活GBS相互作用产生更强的氧化爆发，释放更多颗粒蛋白酶(A、 B）。同样，与NBSAb相比，在BSAb存在的情况下，GBS刺激的中性粒细胞产生更多的NET(C、 D）。因此，GBS CPS唾液聚糖与Siglec-9的结合减弱了中性粒细胞激活对细菌识别反应的关键方面。
Siglec-9的GBS参与减弱人类中性粒细胞免疫功能（A）GBS通过Siglec-9的参与减弱中性粒细胞氧化爆发。用最终浓度为20μM的二氯荧光素二醋酸盐标记BSAb或NBSAb处理的中性粒细胞，并在37°C下培养20分钟。以10倍感染率（MOI）添加GBS COH1 WT，并在37°C下培养30分钟。使用FACS分析测量氧化突发。MFI表示平均荧光强度。（B） GBS通过Siglec-9的参与减少中性粒细胞释放颗粒蛋白酶。中性粒细胞用BSAb或NBSAb（10650μL细胞与GBS COH1细菌混合，MOI为10，一式三份），并在37°C下培养30分钟。试管在1000下离心克持续5分钟，将上清液收集到96 well板的孔中；向每个孔中添加0.5μL溶于20 mM二甲基亚砜中的MeOSuc-Ala-Ala-Pro-ValNmec。在室温下孵育20分钟后，通过405 nm处吸光度的变化以荧光分光光度法监测底物的水解。未刺激中性粒细胞释放弹性蛋白酶的基线设置为100%，图表显示了相对释放百分比。（C，D）NET的生产减弱了Siglec-9的GBS CPS参与。抗体处理的中性粒细胞与细菌在37°C的MOI 100下培养30分钟。使用Cytox Orange对NETs进行染色，并在荧光显微镜下对每个孔的中心样条进行计数。y轴显示了每个井样带计算的净距数。（E） GBS参与Siglec-9可减弱抑制性细胞因子IL-10 mRNA表达的上调。将GBS COH1 WT添加到6孔板中MOI 10处的抗体阳性中性粒细胞中，在37°C下放置30分钟，并用反转录聚合酶链反应引物正向（AACCTCCTGCCATCAA）和反向（GGAAGACCCCCCCCCGCACAGATAG）定量IL-10 mRNA的表达。（F） Siglec-9通过其囊膜Sia的GBS结合促进了对中性粒细胞完全杀伤的抵抗。y轴显示存活率，即恢复的克隆形成单位（cfu）除以接种cfu乘以100。（G） Siglec-9通过CPS-Sia与GBS的结合促进了对中性粒细胞胞外杀伤的抵抗。总中性粒细胞和细胞外中性粒细胞杀伤试验如前所述。24向经抗体处理的中性粒细胞中添加细胞分裂素D，并与GBS COH1 WT、GBS COH2δNeuA（Sia-minus）、，25或A组链球菌M1菌株在MOI 10下培养，并在37°C下培养。每个样品的一部分在5、10、20和30分钟时进行电镀，第二天计算存活的细菌cfu。该图显示了30分钟时的存活cfu百分比。在其他时间点也出现了类似的差异。
除了释放杀菌因子外，中性粒细胞还合成细胞因子，以增强或抑制免疫反应。其他研究表明，将Siglec-9转染到巨噬细胞细胞系可增加抗炎细胞因子白介素-10（IL-10）的产生。22我们发现，不能通过BSAb产生的Siglec-9参与唾液酸化GBS的中性粒细胞产生较少的IL-10 mRNA(E） ●●●●。因此，细菌唾液聚糖通过中性粒细胞Siglec-9发出信号，增加抗炎细胞因子的表达。
因此，GBS唾液聚糖分子模拟的一个新的功能结果是与中性粒细胞Siglec-9相互作用，阻止这些细胞正常反应。这可能通过促进中性粒细胞杀伤的逃避而促进GBS致病性。事实上，与NBSAb相比，中性粒细胞与BSAb共培养时杀死更多GBS(F） ●●●●。BSAb的阻断作用取决于细菌细胞表面唾液酸聚糖的表达，因为Sia-阴性GBS或另一种非唾液酸化细菌（A组）都不会出现这种情况链球菌(G） ●●●●。
综上所述，这些数据首次证明，通过精确模拟宿主唾液聚糖的分子，通过宿主抑制受体的参与，微生物可以逃避中性粒细胞反应。GBS的这种特性可能在易感人群（如新生儿、孕妇和老年人）发生侵袭性血源性感染时起到辅助作用。
确认
这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助P01HL57345（A.V.）和HD051796（V.N.）的支持。
脚注
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：A.F.C.、S.U.和Y.C.C.进行了研究，准备了数字和图例，并阅读了论文；A.F.C.、A.L.L.、V.N.和A.V.设计了研究，分析了数据，并撰写了论文。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通讯员：Ajit Varki，9500 Gilman Dr，加利福尼亚大学圣地亚哥分校，La Jolla，CA 92093-0687；电子邮件：ude.dscu@ikrav1a.
工具书类
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