抗流感CD8的交感神经系统控制⁺T细胞反应

6-OHDA处理宿主但不处理T_{CD8（CD8）+}捐赠者增强抗病毒T_{CD8（CD8）+}回应。

接下来我们研究了6-OHDA对T的影响_{CD8（CD8）+}反应是由于反应T内在的持续变化_{CD8（CD8）+}或支持T的环境变化_{CD8（CD8）+}激活。为此，我们求助于OT-I TCR转基因小鼠，它们能产生T_{CD8（CD8）+}针对K^b条-奥瓦_257–264复合物。表达血清学上不同的同源CD45等位基因CD45.1或CD45.2的OT-I小鼠分别用6-OHDA或生理盐水治疗。CD8（CD8）⁺从两组小鼠中纯化T细胞，以1:1的比例混合，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记，并转移到正常小鼠中。小鼠腹腔感染了一种表达Ova的IAV基因工程病毒_257–264通过流式细胞术对NA糖蛋白（WSN-OVA）的柄部和2个脾脏OT-I群体的分裂进行体外分析。感染后第2天，6-OHDA处理小鼠的OT-I T细胞和对照小鼠的OT-I T细胞分裂程度相似(图S3B类). 相比之下，6-OHDA治疗受体大大增强了未经治疗小鼠转移的OT-I的分裂(图S3A类). 该实验首先证明，6-OHDA治疗可以增强OT-I对IAV的反应，其次，这是由于反应环境的改变，而不是由于T细胞的永久性内在改变_{CD8（CD8）+}他们自己。

6-OHDA增强T_{CD8（CD8）+}对直接和交叉引物抗原的反应。

在抗病毒反应期间，抗原可以呈现给T_{CD8（CD8）+}被感染的专业抗原呈递细胞（pAPC；“直接启动”）或获得外源性病毒抗原的pAPC（“交叉启动”）。为了直接检测SNS参与交叉启动，我们注射KD2SV细胞[H-2^d日表达SV40大T抗原（Tag）的细胞进入C57BL/6（H-2^b条)小鼠和测量的初级T_{CD8（CD8）+}4种特定决定因素的体外反应(22). 6-OHDA处理的小鼠表现出对每一个决定因素的局部（PEC）和脾脏反应显著增强，这在定义明确的Tag免疫优势层次中保持了相对地位(图2A类). 总的来说，标记特定的T_{CD8（CD8）+}针对H-2测量的响应^b条表达Tag（C57SV）的细胞也表现出类似的增加。

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图2。

6-OHDA治疗增强CD8⁺T细胞通过增强pAPC的刺激能力对直接抗原和交叉引物抗原作出反应。黑色条代表6-OHDA处理的小鼠，灰色条代表盐处理的小鼠。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.005; ***,P（P）< 0.0005. (A类)小鼠腹腔注射KD2SV细胞。七天后，SV40 CD8⁺测量T细胞对SV40（Tag 206、Tag 404、Tag 289和Tag 223）和对照（OVA 257）肽和C57SV细胞的反应。分析3只小鼠的脾脏反应，每组3只小鼠收集PEC。实验独立进行了3次。(B类)小鼠经腹腔感染重组VV-VFP-Ub-OVA257小基因，CD8⁺检测T细胞对VV（B8R 20）、Minigene（OVA 257）和对照（NP366）肽的反应。分析每组3只小鼠对脾脏和PEC的反应。实验独立进行了3次。(C类)小鼠经静脉感染VV编码的微小基因，脾脏用25D-1.16染色。实心灰色表示未感染的小鼠，虚线表示感染无关病毒（VV-VFP-Ub-NP366）的小鼠，实线表示感染VV-VFP-Ub-OVA257的对照小鼠，虚线表示感染VV-VFP-Ub-OVA257的6-OHDA处理的小鼠。静脉阳性细胞的数量位于闸门内，闸门上方显示闸门群的中值荧光强度（MFI）。该实验独立重复2次。(D类)用感染（对照组：灰色条；6-OHDA：黑色条）和未感染（控制组：白色条；6-OHDA：孵化条）小鼠的pAPC制剂刺激OT-I T细胞体外增殖试验。pAPC群体用25D-1.16染色。实心灰色代表未感染对照小鼠，虚线代表未感染6-OHDA治疗的小鼠，实线代表感染PR8-OVA的对照小鼠，而虚线代表感染了PR8-OVA的6-OHDA处理的小鼠。将每组3只小鼠的脾脏汇集在一起，以生成pAPC制剂。(电子)来自感染小鼠的分类DC群体被用作增殖试验中的刺激物，类似于D类并与OT-I电池以1:1的比例进行电镀。将每组5只小鼠的脾脏汇集在一起，形成DC群体。中的实验D类和电子分别重复3次。

为了专门研究6-OHDA对直接启动的影响，我们用重组痘苗病毒（rVV）感染小鼠，该病毒编码由羧基末端金星荧光蛋白（VFP）、泛素（Ub）和卵黄蛋白（Ova）组成的嵌合蛋白_257–264如van Endert及其同事所述(23)，肽决定簇通过Ub-水解酶从融合蛋白中快速释放，其行为类似于细胞溶质小基因产物。6-OHDA治疗增加了原发性T_{CD8（CD8）+}对Ova的响应_257–264免疫显性VV决定簇B8R_20–27(图2B类). 通过使用表达Tag的rVV，也发现了类似的结果_404–412作为一种细胞溶质决定因子，它也只由直接启动表达。总之，这些数据强烈表明，SNS具有调节初级T细胞的功能_{CD8（CD8）+}对直接抗原和交叉抗原的反应。

对直接呈现的rVV编码抗原的6-OHDA增强免疫原性的一个潜在解释是，SNS限制了pAPC的VV感染或感染的pAPC表达的同源肽类I复合物的数量。为了解决这种可能性，我们用表达VFP-Ub-Ova的rVV感染小鼠_257–264（或表达VFP-Ub-NP的控件_366–374)并测量VFP和K的脾细胞表达^b条-椭圆形_257–264通过使用25-D1.16mAb进行复杂的表面表达。6-OHDA治疗对VFP或K的表达没有显著影响^b条-奥瓦_257–264复合体(图2C类).

6-OHDA增加幼稚T的pAPC刺激_{CD8（CD8）+}.

先前的一项研究报告称，化学性交感神经切除小鼠的腹腔巨噬细胞能够激活T_CD4细胞+与体外对照巨噬细胞相比，对蛋白质抗原的反应更大(24). 因此，我们测试了受感染的6-OHDA治疗和对照动物的pAPC体外激活原始T细胞的能力。

我们测试了PR8-OVA腹腔感染小鼠12小时后获得的脾脏pAPC的刺激能力。我们发现，当刺激剂pAPC制剂来自6-OHDA处理的小鼠与对照小鼠相比，幼稚OT-i分裂增强了2到3倍(图2D类). 这显然不是由于同源抗原的表达增加，因为6-OHDA没有提高细胞表面K的水平^b条-椭圆形_257–26425-D1.16抗体染色测定的复合物(图2D类).

脾脏pAPCs包括DC，被认为是启动原始T细胞的主要APCs_{CD8（CD8）+}体内反应。我们将感染小鼠的DC分类为CD8α⁺和CD11b⁺DC子集。CD8α⁺DC是比CD11b更好的刺激物⁺DC。重要的是，6-OHDA对小鼠的治疗增强了CD11c的能力⁺与对照组相比，激活幼稚OT-I的子集(图2电子). 尽管此前有报道称，骨髓源性DC暴露于去甲肾上腺素会减少IL-12分泌，同时增加IL-10分泌(34)，这不太可能解释我们观察到的6-OHDA对DC功能的影响。

首先，尽管去甲肾上腺素降低了CD11b⁺DC IL-12分泌，对CD8α影响不大⁺DC IL-12分泌(图S4A类). 这不是因为β2 AR表达的差异，至少在mRNA表达水平上是如此(图S4B类). 第二，在感染后1至7天直接测量脾脏IL-10和IL-12不支持6-OHDA通过降低IL-10和增加IL-12发挥作用的假设；事实上，在D1时IL-12实际上降低(图S4C类).

总之，这些数据表明，6-OHDA处理增强了包括DC在内的pAPC体外激活幼稚T细胞的能力，这表明6-OHDA增强抗病毒T细胞作用的潜在机制_{CD8（CD8）+}响应。然而，这种效应似乎不是通过调节IL-10或IL-12来介导的。

病毒和免疫。

A/波多黎各/8/34（PR8），PR8-OVA(28)和WSN-OVA(29)用作感染性尿囊液。通过组织培养50%感染剂量（TCID）测定病毒滴度₅₀)Madin Darby犬肾（MDCK）细胞和LD₅₀8周龄B6小鼠。小鼠腹腔注射PR8，剂量为2×10⁶/毫升TCID₅₀或1 mL PR8-OVA（6×10）⁷/毫升TCID₅₀用0.1 LD对小鼠进行静脉感染₅₀PR8在25μL PBS中。如前所述生成重组痘苗病毒(30). 小鼠腹腔感染5×10⁶VV的pfu。小鼠缺乏CD4⁺在第−3、−2、−1和+4天通过注射200μg GK1.5 i.p.来培养细胞。小鼠CD25耗竭⁺在第−4天通过静脉注射500μg PC61来培养细胞。

化学交感神经切除术和拮抗剂。

用100μg/kg 6-OHDA（Sigma）在0.9%NaCl和10⁻⁷M抗坏血酸在第−7天和第−5天，在第−3天为200μg/kg。对照组小鼠注射0.9%氯化钠和10⁻⁷M抗坏血酸。用酪氨酸羟化酶抗体或蔗糖-磷酸-葡萄糖酸（SPG）反应对冷冻脾切片进行染色，以证实交感神经切除术(31)纳多洛尔、酚妥拉明、美托洛尔和ICI118551（Sigma）通过植入皮下注射的Alzet渗透泵（Alzet）持续给药。纳多洛、酚妥拉明和美托洛耳在生理盐水中给药，而ICI1185501在50%生理盐水/50%二甲基亚砜中给药。对照组小鼠接受单独给药的泵。纳多洛尔的剂量为1 mg/kg/天，酚妥拉明、美托洛尔和ICI118551的剂量为10 mg/kg/日。

流式细胞术25D-1.16体内感染细胞染色。

小鼠静脉感染1.2×10⁷rVV或i.p.的pfu为6×10⁷TCID公司₅₀IAV公司。感染后12小时，用I型胶原酶（沃辛顿生物化学公司）在37°C下消化脾脏1小时。脾细胞用FC-受体阻断抗体（克隆2.4G2）孵育，并用单克隆抗体25D-1.16（识别K^b条-SIINFEKL复合物）。使用LSRII（BD）进行流式细胞术，并使用FlowJo软件（TreeStar）进行分析。ICS的执行如前所述(21).

pAPC群体的制备。

脾脏在37°C下用I型胶原酶消化1h。对于pAPC制剂，CD8α的第一步⁺使用DC隔离试剂盒（Miltenyi Biotec）和AutoMacs净化系统（Miltenxi Biotech）。该制剂由约10%的CD11c组成⁺细胞。为了对DC群体进行分类，用FC-受体阻断抗体（克隆2.4G2）处理脾细胞，并用抗CD11b-FITC（BD）、抗CD11c-PE（BD。使用FACSAria（BD）对细胞进行分类，结果纯度<95%。

抗-IAV抗体效价。

如前所述，通过ELISA测定PR8-感染MDCK细胞裂解物的总IgG滴度(32).

肺部病毒滴度。

肺在PBS中均质并按重量标准化。TCID检测肺匀浆中的病毒₅₀在MDCK细胞中。对于RT-PCR，使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）分离RNA，使用铂一步定量RT-PCR ThermoScript（Invitrogen）对基质进行RT-PCR。引物正向，5′-GGACTGCAGCGTACGCTT-3′；背面，5′-CATCCTGTTGTATGAGGCCCAT-3′；和探针，5′–CTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCA-3′已在前面描述(33).

DC刺激和细胞因子测定。

分选的脾脏DC在1×10⁶/mL，含或不含100 ng/mL LPS。无去甲肾上腺素或10⁻⁵向培养物中添加M去甲肾上腺素，并将其培养24小时。将细胞离心下来，收集上清液并根据制造商的规范通过ELISA（电子生物科学）分析IL-12p40。

β的RT-PCR₂-AR表达式。

通过使用RNesay迷你试剂盒（Qiagen）制备来自分选的脾脏DC群体的RNA。β₂-使用Taqman基因表达分析（应用生物系统）测量AR和GAPDH的表达。β₂-AR探针用FAM标记，GAPDH用VIC标记，以便对2种分析进行复用。

脾脏中的细胞因子测量。

感染后第1天、第2天、第3天、第5天和第7天采集脾脏，并将其置于1.5 mL PBS中，PBS中含有完整的、不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。将脾脏均质化，并旋转裂解液以收集上清液。根据制造商的规范，使用Bio-Plex细胞因子珠阵列分析（Bio-Rad）测量细胞因子。在Bio-Plex 200悬浮阵列系统（Bio-Rad）上读取分析结果，并使用Bio-Plecx管理软件（Bio-read）进行分析。

统计分析。

在适当的情况下，使用Prism 4软件（Graphpad软件），使用未配对的t吨测试（2组）或单因素方差分析（3组）。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

黛博拉·托卡奇克和格伦尼斯·雷诺索提供了出色的技术援助。我们感谢David Topham（纽约州罗切斯特市罗切斯特大学医学中心）为PR8-OVA慷慨捐赠WSN-OVA和Richard Webby（田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院）。我们还要感谢弗吉尼亚·桑德斯（Virginia Sanders）在建立6-OHDA模型方面的帮助，以及史蒂夫·科尔（Steve Cole）在SPG协议方面的帮助。这项工作得到了美国国家过敏和传染病研究所、美国国立卫生研究院、卫生与公众服务部室内研究司的慷慨支持。