《美国肾脏病杂志》。2009年4月；20(4): 765–776.
Wnt/β-连环蛋白信号转导促进肾间质纤维化
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何伟春
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
戴春荪
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
李英健
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
曾刚
*宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
萨塔珊·蒙加
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
刘友华
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院内科，南京，中国
*宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系；和†南京医科大学附属第二医院医学部，中国南京
通信：刘友华博士，匹兹堡大学病理学系，地址：宾夕法尼亚州匹兹堡市洛思罗普街200号S-405生物医学科学大厦，邮编：15261。电话：412-648-8253；传真：412-648-1916；电子邮件：ude.cmpu@yuil 收到日期：2008年6月4日；2008年10月28日接受。
- 补充资料
[补充数据]
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摘要
Wnts组成一个信号蛋白家族，在肾脏发育中发挥重要作用，但其在成人肾脏中的表达被认为是沉默的。在此，我们分析了梗阻性损伤后正常和纤维化肾脏中Wnts及其受体和拮抗剂的表达和调节。在正常小鼠肾脏中，19种不同Wnts和10种卷曲受体基因的绝大多数在不同水平上表达。单侧输尿管梗阻后，除Wnt5b、Wnt8b和Wnt9b外，Wnt家族的所有成员在纤维化肾中均上调，具有明显的动力学特征。此外，还诱导了大多数Fzd受体和Wnt拮抗剂的表达。梗阻性损伤导致β-catenin在肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核中大量积聚，表明Wnt信号的典型通路被激活。大量Wnt/β-catenin靶基因（c-Myc、Twist、淋巴增强因子结合因子1和纤维连接蛋白）被诱导，其表达与肾脏β-catentin丰度密切相关。Wnt拮抗剂Dickkopf-1基因的传递显著减少肾脏β-catenin的积累，并抑制Wnt/β-catentin靶基因的表达。此外，Dickkopf-1基因治疗抑制肌成纤维细胞活化；抑制成纤维细胞特异性蛋白1、I型胶原和纤维连接蛋白的表达；梗阻性肾病模型中总胶原蛋白含量降低。总之，这些结果确立了Wnt/β-catenin信号通路在肾纤维化发病机制中的作用，并将此途径确定为潜在的治疗靶点。
分泌信号蛋白Wnt家族在器官发生、组织稳态和肿瘤形成中起着重要作用。1–4Wnt信号的异常调节与多种组织中人类疾病的发病机制有关。三,4Wnt蛋白通过与蛇纹石受体、Fzzled（Fzd）蛋白家族以及LDL受体相关蛋白（LRP5/6）的共同受体相互作用，在质膜上传递信号。Wnt蛋白与受体结合后，诱导一系列下游信号事件，包括Disheveled（Dvl）、axin、大肠腺瘤病-息肉病和糖原合成酶激酶3β，导致β-catenin去磷酸化。这导致β-catenin的稳定，使其易位到细胞核中，在那里与T细胞因子/淋巴增强因子结合以刺激Wnt靶基因的转录。5–7除了这一典型途径外，Wnt蛋白还可以通过许多β-连环蛋白非依赖的非经典细胞内信号途径发挥其活性。8
Wnts和Fzd受体都由多个不同的基因编码，形成了一个具有巨大多样性和冗余性的复杂信号系统网络。在小鼠中已鉴定出至少19种不同的Wnt蛋白和10种不同的Fzd受体9,10（请参阅Wnt主页网址：http://www.stanford.edu/～rnusse/wntwindow.html).毫不奇怪，Wnt信号通过多种方式受到严格监管。Wnt信号传导的分泌性拮抗剂有几种，包括可溶性Frizzled相关蛋白（sFRP）、Wnt抑制因子和Dickkopf（DKK）蛋白家族。1,5其中，DKK蛋白的独特之处在于，它们通过与受体复合物的LRP5/6成分结合，特异性抑制典型Wnt信号通路。11,12
Wnt/β-catenin信号传导已被证明在肾脏发育和疾病中发挥作用。Wnt4和Wnt9b在肾脏发育早期高表达，对肾单位形成具有重要功能。13,14然而，在成人肾脏中，Wnt信号似乎被沉默了。14–16Wnt/β-catenin信号调节障碍发生在某些类型的肾脏疾病中，包括梗阻性肾病。17,18这些观察结果清楚地表明，Wnt信号在哺乳动物肾脏发生、组织稳态和肾脏疾病发病机制中的潜在作用；然而，成人肾脏中19个Wnts和10个Fzd受体的表达尚待确定。此外，它们在慢性肾脏疾病演变中的调节和功能尚不清楚。
在本研究中，我们对梗阻性损伤后正常和纤维化肾脏中Wnts及其受体和拮抗剂的表达和调节进行了全面分析。我们的数据表明，大多数Wnts和Fzd受体在病肾中上调，从而导致β-catenin的大量积累，导致Wnt/β-catentin靶基因的诱导。此外，我们发现Wnt拮抗剂DKK1基因的传递可减少梗阻性肾病小鼠模型中β-catenin的积累并减轻肾间质纤维化。这些研究确立了过度活跃的Wnt/β-catenin信号在肾纤维化发病机制中的关键作用，并为纤维化肾脏疾病的治疗干预提供了一个新的靶点。
结果
Wnt基因在正常和纤维化肾脏中的表达
我们首先通过逆转录酶-PCR（RT-PCR）方法对正常小鼠肾脏中所有Wnt基因的mRNA表达进行了系统分析。如所示除Wnt3a、Wnt8a和Wnt10b外，绝大多数19个Wnts在小鼠成体肾脏中均有不同水平的表达。在没有RT的情况下，未检测到PCR产物，表明Wnt表达的特异性。接下来我们研究了单侧输尿管梗阻（UUO）诱导肾间质纤维化过程中Wnt表达的调节。如所示UUO后不同时间点大多数Wnt基因的稳态mRNA水平升高。补充表1列出了各种Wnts肾脏mRNA水平的实际值。根据Wnt调节的特点，可以将Wnt在肾纤维化过程中的动态表达模式分为四种。如所示只有三种Wnts，包括Wnt5b、Wnt8b和Wnt9b，其表达在UUO后肾纤维化的整个过程中没有改变。Wnt1、Wnt7a和Wnt7b表现出类似的表达模式，梗阻性损伤后第7天出现峰值诱导，随后mRNA水平下降。其他五种Wnts的表达，包括Wnt2b、Wnt3、Wnt5a、Wnt9a和Wnt16，最初增加到7天，随后持续表达。Wnt家族的其余八个成员具有相似的诱导动力学，在整个实验期间mRNA表达持续增加。有趣的是，在UUO后纤维化肾脏中没有一种Wnt的表达受到抑制。
Wnt基因在正常和纤维化小鼠肾脏中的表达。（A） 典型的RT-PCR结果显示不同Wnt基因在正常小鼠肾脏中的表达。在没有RT的情况下，未检测到PCR产物，表明其特异性。（B） 典型的RT-PCR结果显示，UUO后不同时间点肾脏Wnt mRNA的稳态水平如图所示。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（C） 图示显示了纤维化肾脏中Wnt调节的独特动态模式。将损伤后动态模式相似的不同Wnts进行分组。相对mRNA水平的实际值（假对照组的折叠诱导）见补充表1。
Wnt蛋白在纤维化肾脏中也上调。显示了UUO后不同时间点Wnt4和Wnt7a的蛋白质水平。与mRNA类似，肾脏Wnt4和Wnt7a蛋白丰度明显增加，且呈时间依赖性。值得注意的是，Wnt4和Wnt7a蛋白也表现出不同的诱导动力学模式(). 为了探讨Wnt诱导是否是肾纤维化形成中的普遍现象，我们还检测了阿霉素肾病小鼠模型中Wnt的表达。如补充图1所示，注射阿霉素后5周，许多Wnts在病肾中的表达也上调，此时肾小球和间质纤维化明显。19
梗阻性损伤后肾Wnt4和Wnt7a蛋白表达的诱导。在UUO后的不同时间点制备全肾匀浆，并分别用Wnt4、Wnt7a和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体进行免疫印迹。数字（1和2）表示给定组中的每只动物。
Wnt受体和拮抗剂的调节
接下来我们检查了Fzd受体基因在小鼠肾脏中的表达。如所示除Fzd10外，所有Fzd基因（Fzd1-9）的mRNA均可通过RT-PCR方法在小鼠成年肾脏中检测到，尽管数量不同。显示了UUO后不同时间点肾脏Fzd mRNA水平的代表性RT-PCR结果。Fzd mRNA相对水平的实际值见补充表2。如所示在整个实验期间，Fzd4和Fzd5的表达没有改变。然而，Fzd1、Fzd2、Fzd_6、Fzd 7、Fzd-8和Fzd9受到中度诱导，而Fzd3和Fzd 10基因的表达显著上调(). 再一次，梗阻性损伤后纤维化肾脏中的Fzd基因没有受到抑制。Wnt拮抗剂sFRP（或Frzb）在整个实验过程中没有显著变化().
正常和纤维化肾脏中Fzd受体基因的调节。（A） 代表性的RT-PCR结果显示不同Fzd受体基因在小鼠肾脏中的表达。在没有RT的情况下，未检测到PCR产物，表明其特异性。（B） 典型的RT-PCR结果显示，UUO后不同时间点肾脏Fzd mRNA的稳态水平如图所示。数字（1、2和3）表示每只动物。（C） 图示为纤维化肾脏Fzd调节的动态模式。对损伤后表达模式相似的不同Fzd受体进行分组。相对mRNA水平的实际值（假对照组的折叠诱导）见补充表2。
我们进一步研究了Wnt拮抗剂DKK基因家族在正常和纤维化肾脏中的表达。显示了UUO后不同时间点不同DKK mRNA稳态水平的代表性RT-PCR结果。DKK家族的所有四个成员在正常小鼠肾脏中均表达，其mRNA水平在输尿管梗阻后中度升高(). 表达动力学分析表明，DKK1和DKK2的表达在UUO后第7天达到峰值，随后下降，而DKK3和DKK4 mRNA的丰度在整个实验过程中受到轻微的逐渐诱导().
Wnt拮抗剂在梗阻性肾病中的表达。（A） 典型的RT-PCR结果显示了UUO后不同时间点Dickkopf（DKK1至4）mRNA的稳态水平。数字（1、2和3）表示每只动物。（B） 图示为纤维化肾脏中DKK调节的动态模式。将损伤后表达模式相似的DKK进行分组。
Wnt/β-儿茶酚胺经典通路在梗阻性肾病中的激活
为了研究Wnt调节在肾纤维化中的功能性后果，我们接下来试图研究β-catenin的激活，β-catentin是Wnt信号传导典型途径的主要介导者。在UUO后7天，A和B显示了正常和梗阻肾脏中β-catenin蛋白的表达和定位。免疫组织化学染色显示，与假手术对照组相比，β-catenin蛋白明显上调，主要在梗阻肾的肾小管中。β-catenin除了在细胞-细胞粘附部位外，还定位于肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核中(，装箱区）。值得注意的是，在间质中也观察到β-连环蛋白阳性细胞(，箭头）。从细胞核的形状和大小来看，这些间质β-连环蛋白阳性细胞很可能是疏离的管状细胞。Western blot分析也显示梗阻性损伤后肾脏β-catenin丰度显著增加(). UUO后14天，相对β-catenin水平比假对照组增加了约四倍()这表明Wnt表达的诱导将导致β-catenin在纤维化肾脏中积聚。
梗阻性肾病中Wnt/β-catenin典型通路的激活。（A和B）典型的显微照片显示β-catenin在纤维化肾脏中的积聚和定位。对假手术组（A）和UUO组（B）的肾脏进行β-catenin蛋白免疫组化染色。棒材=40μm。箭头表示间质中β-catenin阳性细胞。放大的方框区域中的箭头表示核染色阳性。（C和D）Western blot分析显示梗阻性损伤后肾脏β-catenin丰度显著增加。提供了代表性的蛋白质印迹（C）和定量数据（D）。在GAPDH正常化后，报告了相对β-catenin水平（假对照组的折叠诱导）。数据是每组五只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01对假对照。
我们进一步研究了梗阻性肾病中Wnt/β-catenin信号传导的几个可能靶基因的表达。如所示，许多广为人知的Wnt/β-catenin靶基因，包括Twist、LEF1和纤维连接蛋白，在梗阻肾中以时间依赖性方式上调。在整个实验中，这些基因的稳态mRNA水平与肾脏β-catenin的丰度密切相关(，B到D）。此外，梗阻性损伤后肾脏中的c-Myc和Twist蛋白显著增加(，E到H）。
梗阻性肾病中Wnt/β-catenin靶基因的表达。（A） RT-PCR分析显示，UUO后不同时间点梗阻肾脏中可能存在Wnt/β-catenin靶基因的诱导。（B到D）线性回归显示肾扭转（B）、LEF1（C）和纤维连接蛋白（D）mRNA水平与β-连环蛋白丰度（任意单位）之间密切相关。相关系数(R（右）2)如图所示。（E到H）Western blot分析显示梗阻性损伤后肾脏c-Myc和Twist蛋白丰度显著增加。提供了代表性的蛋白质印迹（E和G）和定量数据（F和H）。GAPDH正常化后，报告相对c-Myc和Twist蛋白水平（假对照组的折叠诱导）。数据是每组五只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01对假对照。
DKK1基因治疗阻断Wnt/β-连环蛋白信号
为了阻断Wnt信号，我们使用了一种基于流体动力学的基因传递方法20,21通过静脉注射编码DKK1的裸质粒载体，DKK1是一种分泌型Wnt拮抗剂，可特异性阻断Wnt/β-catenin信号的典型途径。如所示人特异性引物RT-PCR分析显示，通过这种方法传递DKK1基因，导致外源性DKK1转基因在肝脏和肾脏中大量表达。检测人和内源性小鼠DKK1的定量ELISA也显示质粒注射后肝脏和肾脏中的DKK1蛋白增加(、C和D）。类似地，在肾脏中可以用特异性抗体检测到人类标记DKK1蛋白（图E）。由于它是一种分泌蛋白，注射质粒后循环中DKK1水平也显著升高().
基因治疗后外源性DKK1的表达。（A和B）RT-PCR分析显示外源性DKK1基因在质粒注射后的肝脏（A）和肾脏（B）中表达。注射DKK1质粒后16 h，从肝脏和肾脏中制备总RNA，并进行RT-PCR分析，以检测人DKK1的表达。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（C和D）ELISA分析显示，基因传递后，肝脏（C）和肾脏（D）中的DKK1蛋白增加。肝和肾匀浆中的DKK1蛋白水平表示为ng/mg总蛋白*P（P）< 0.05对pcDNA3控件(n个=4至5）。（E） Western blot分析显示肾脏表达外源性DKK1蛋白。肾匀浆分别用抗Flag和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。（F） ELISA分析显示，基因传递后循环中DKK1蛋白增加。注射DKK1质粒后16 h从小鼠中采集血浆样本，DKK1蛋白水平以ng/ml表示*P（P）< 0.05对pcDNA3控件(n个= 3).
我们发现DKK1基因的传递显著抑制了梗阻肾脏中β-catenin的稳定和积累(，A到C）。与空矢量控制相比()免疫组织化学染色显示，外源性DKK1表达后，肾脏β-catenin蛋白减少(). 与β-连环蛋白水平下降一致，β-连环素细胞质和细胞核染色阳性的细胞数量也减少。Western blot分析也表明，DKK1基因的传递降低了梗阻性损伤后肾脏β-连环蛋白的丰度(、D和E）。此外，DKK1的异位表达显著抑制了几个Wnt/β-catenin靶基因的表达，如c-Myc和Twist(). 因此，DKK1基因治疗有效地阻碍了病变肾脏中Wnt/β-catenin信号传导的经典途径。
DKK1基因传递阻断梗阻性肾病Wnt/β-catenin信号传导。（A至C）典型的显微照片显示了假小鼠（A）、接受UUO并注射pcDNA3（B）的小鼠和接受UUU并注射pFlag-DKK1质粒（C）的小鼠的肾脏β-catenin的表达和定位。棒材=40μm。（D至F）典型的Western blots（D）和定量数据（E和F）表明，DKK1基因的传递降低了梗阻性损伤后肾脏β-catenin和c-Myc的丰度**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。（G至I）DKK1基因治疗抑制梗阻肾中Twist mRNA（G和H）和蛋白（I）的表达。给出了具有代表性的RT-PCR（G）和Western blot（I）结果和定量数据（H）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
阻断Wnt信号通路抑制梗阻性损伤后肾α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞特异性蛋白1的表达
接下来，我们研究了阻断Wnt信号对阻塞性损伤后间质纤维化演变过程中肌成纤维细胞活化的影响。如所示UUO引起α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达的显著诱导，α-SMA是肌成纤维细胞的分子标志；然而，DKK1基因的递送显著抑制了损伤后肾脏α-SMA mRNA的表达。DKK1的异位表达也抑制梗阻肾α-SMA蛋白的表达(、C和D）。当肾切片用抗α-SMA抗体进行免疫染色时，也得到了类似的结果().
DKK1阻断Wnt信号传导抑制梗阻肾中α-SMA和FSP-1的表达。（A和B）代表性RT-PCR分析（A）和定量数据（B）显示，DKK1基因的递送抑制了梗阻性损伤后肾脏α-SMA mRNA的表达。（C和D）典型的Western blot（C）和定量数据（D）表明DKK1抑制梗阻性损伤后肾脏α-SMA蛋白的表达。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。在GAPDH正常化后，分别报告相对α-SMA mRNA（B）或蛋白质（D）水平（假对照组的折叠诱导）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。（E） 如图所示，典型的显微照片显示不同组的α-SMA蛋白通过免疫荧光染色定位，FSP-1蛋白通过免疫组织化学染色定位。棒材=40μm。（F） 如图所示，定量测定不同组中FSP-1的表达**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
我们还研究了成纤维细胞特异性蛋白1（FSP-1）的表达，也称为S100A4蛋白，通常在成纤维细胞中表达，但在上皮细胞中不表达。22如所示免疫组化染色显示，正常肾脏间质中很少检测到FSP-1阳性细胞。梗阻性损伤明显诱导FSP-1表达，间质和肾小管上皮细胞数量增加，FSP-1染色呈阳性；然而，DKK1基因的传递不仅减少了肾FSP-1阳性细胞的总数()而且还特别抑制FSP-1的管状表达().
阻断Wnt信号传导减少肾纤维化并抑制间质基质生成
显示DKK1对Wnt信号传导的抑制减弱了UUO后的肾间质纤维化。Picrosius红和Masson三色染色显示外源性DKK1异位表达后阻塞肾的间质损伤和胶原沉积减少(，A至F）。胶原蛋白沉积的减少与外源性DKK1表达后阻塞肾的肾间质体积减少有关(). 组织羟脯氨酸含量的生化分析表明，与对照组相比，DKK1对Wnt信号的阻断减弱了梗阻肾中的总胶原蛋白().
DKK1抑制Wnt信号可减少UUO后肾间质损伤和总胶原沉积。（A至F）肾切片用Picrosius红色（A至C）和Masson三色（D至F）染色，以评估胶原蛋白沉积。所示为不同组的代表性显微照片。（A和D）Sham控件。（B和E）接受UUO并注射pcDNA3的小鼠。（C和F）接受UUO并注射pFlag-DKK1的小鼠。棒材=40μm。（G） 图示显示不同组的肾间质体积，如图所示。（H） DKK1治疗降低了梗阻肾组织中羟脯氨酸的含量。组织羟脯氨酸表达为μg/mg干肾重**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
然后我们研究了间质基质的两个主要成分I型胶原和纤连蛋白的表达从A到D，梗阻性损伤导致I型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平显著增加，DKK1基因的传递显著抑制了这些基质成分的表达。免疫荧光染色也获得了I型胶原和纤维连接蛋白表达的类似结果。显然，阻断Wnt/β-catenin信号的典型途径会抑制间质基质基因的表达并减轻肾纤维化病变。
DKK1阻断Wnt信号传导抑制梗阻性肾病中I型胶原和纤维连接蛋白的表达。（A和C）如图所示，对不同治疗组的I型胶原（A）和纤维连接蛋白（C）的肾脏mRNA水平进行代表性RT-PCR分析。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（B和D）不同组I型胶原（B）和纤维连接蛋白（D）mRNA水平的图示。计算相对mRNA水平，并在β-肌动蛋白正常化后表示为假对照组的折叠诱导（值=1.0）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。（E） 如图所示，代表性显微照片通过免疫荧光染色显示了不同组中I型胶原和纤连蛋白的定位。巴=40μm。
讨论
本文报道的结果首次系统分析了Wnt家族所有成员及其Fzd受体基因在正常和纤维化肾脏中的表达和调节。我们证明慢性肾损伤后Wnt上调导致β-catenin的积累并诱导其下游靶基因的表达。此外，DKK1阻断Wnt信号的典型通路可抑制间质基质基因表达，减轻胶原沉积和组织瘢痕形成。我们的研究表明，Wnt/β-catenin信号在肾间质纤维化的发展过程中异常活跃且有害。这些发现对Wnt/β-catenin信号在肾纤维化形成中的作用和机制提供了重要的见解，并为开发治疗纤维化肾脏疾病的治疗方法提供了新的策略。
Wnt/β-catenin信号通常被认为在成人组织中沉默。1,5,16然而，很明显，Wnt和Fzd受体家族的绝大多数成员在小鼠成年肾脏中都有不同水平的表达。这一有点令人惊讶的发现表明，Wnt信号在正常生理条件下维持肾细胞和组织内环境稳定中很重要。除了特征鲜明的典型途径外，5,9其中β-catenin是主要介质，Wnt信号可以通过几个额外的细胞内β-catentin非依赖的非经典途径传递，其中Wnt/Ca2+和Wnt/平面电池极性（PCP）路线得到了最好的描述。8在Wnt/Ca中2+途径，Wnts结合Fzd受体激活Dvl；然而，这导致细胞内钙的增加2+蛋白激酶C和钙调蛋白激酶II的活化。23,24功能上，激活Wnt/Ca2+该通路可能拮抗Wnt/β-catenin信号传导，提供负反馈机制。25Wnt/PCP途径也使用Fzd和Dvl，但不会导致β-catenin稳定或Ca2+流入调节PCP的生成。26,27非经典途径通常是对不同组Wnt配体和Fzd受体（如Wnt4、Wnt5a、Wnt11和Fzd2-4）的反应而操作的10,23; 因此，尽管特异性Wnts和Fzd受体在正常肾脏中的作用尚待确定，但鉴于不同Wnts及Fzd感受器的表达模式，我们可以推测Wnt信号传导的经典和非经典途径都在起作用，确保正常情况下的功能多样性和信号输出动态平衡。越来越明显的是，成人肾脏中Wnt/β-catenin信号的相对沉默并不代表Wnt表达的缺乏，实际上可能是由于刺激性和抑制性Wnt和Fzd基因之间的表达平衡所致，28以及各种Wnt拮抗剂的组成表达。
本研究中的一个引人注目的观察结果是阻塞性损伤后纤维化肾脏中多个Wnt基因的同时诱导。事实上，除了Wnt5b、Wnt8b和Wnt9b外，Wnt家族的所有成员基因都上调，尽管诱导动力学不同(). 此外，许多Fzd受体基因的表达被诱导(). 也许出乎意料的是，在整个实验期间，Wnt和Fzd受体家族中没有一个基因的表达受到抑制。这表明Wnt家族大多数成员对UUO后的损伤性刺激有积极的反应。尽管损伤后胚胎基因的这种再表达或诱导并非没有先例，但19个Wnt基因中有16个是在特定的疾病环境中同时诱导的，这一观察结果令人惊讶。自然，Wnt和Fzd基因的诱导将导致β-catenin的稳定和积累，β-catentin是Wnt经典途径的介导者，29通过阻止其磷酸化和降解通过β-转导素重复序列蛋白介导的泛素化。1,5事实上，尽管Wnt蚂蚁激动剂DKK1至4被轻微诱导()β-catenin蛋白显著增加，主要定位于肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核()，表明患病肾脏中普遍存在Wnt/β-catenin信号。
应该指出的是，我们不知道Wnts的来源和本地化体内在本研究中，由于免疫组织化学研究中缺乏针对许多脊椎动物Wnt蛋白的特异性和有效抗体。A上一个就地杂交研究表明，Wnt4mRNA在各种损伤后的集合管上皮和活化的间质肌成纤维细胞中被诱导表达。18由于Wnt是一种分泌性蛋白，细胞可能会以自分泌或旁分泌的方式轻易接触细胞外Wnt并对其作出反应，而不管其来源如何。因为肾小管上皮细胞表达大多数Fzd受体在体外（数据未显示），可以假设它们可能是患病肾脏Wnt信号的主要靶点。观察到梗阻性损伤后，β-catenin主要在肾小管上皮中激活，这一观点得到了支持().
Wnt/β-catenin信号传导的最终反应应该反映在调节特定的基因表达上。在这方面，Wnt/β-catenin下游的许多靶基因在不同类型的细胞中具有特征性。根据其他生物系统的先前报告，30–33我们确定了纤维化肾脏中Wnt/β-catenin的几个假定靶基因，包括Twist、LEF1、fibronectin和c-Myc。这些基因的表达与β-catenin丰度密切相关体内()并在DKK1阻断Wnt信号后被特异性抑制(和). 在这些基因中，Twist是基本螺旋-环-螺旋类的转录因子，已被证明在不同情况下介导上皮-间充质转化（EMT）中发挥关键作用。30Twist不仅能够通过与启动子区的E-box结合来抑制E-cadherin基因转录，而且还诱导从头开始间充质标志物的表达。34,35鉴于肾小管EMT在肾纤维化发病机制中的重要性，36,37Twist可能是Wnt/β-catenin在促进EMT和肾纤维化形成中的关键介质。值得注意的是，Wnt/β-catenin信号可能在病肾中被放大，因为其靶点之一是LEF1，31与β-catenin相互作用的DNA结合转录因子，导致反式-激活蛋白复合物。作为Wnt/β-catenin的另一个直接靶点，33纤维连接蛋白表达增加在肾纤维化演变中的意义是显而易见的。值得注意的是，c-Myc的表达是Wnt/β-catenin的一个广为人知的靶点，与调节细胞增殖有关，1,三,32与β-连环蛋白水平不完全相关(). 这种差异背后的原因尚不清楚，但这可能表明，某些Wnts组，如Wnt1、Wnt7a和Wnt7b，在UUO后与c-Myc具有类似的表达模式，可能专门负责在患病肾脏中诱导c-Myc。值得注意的是，我们不能排除其他转录因子也参与纤维化肾脏Wnt靶基因调控的可能性体内显然需要在该领域进行更多研究。
我们的研究还表明，靶向Wnt/β-catenin信号可能是阻止肾间质纤维化进展的有效策略。外源性DKK1的输送通过裸质粒注射导致外源性DKK1在肾脏和肝脏中大量表达(). 因为它是一种分泌蛋白，外源性DKK1在肾脏中产生就地和/或来自肝脏通过循环可能进入并靶向病变肾脏中过度活跃的Wnt信号传导。这导致纤维化肾脏中β-catenin积累减少，Wnt/β-catentin靶基因受到抑制，导致肾基质沉积和纤维化减少。之前的一份报告也证实了这一结论，该报告表明，注射重组sFRP4蛋白能够改善肾纤维化病变。17值得强调的是，DKK蛋白作为Wnt拮抗剂是独特的，因为它们特异性地阻断与LRP5/6结合的Wnt配体，LRP5/6是传递Wnt/β-catenin信号经典途径所必需的共受体11,12; 因此，我们观察到DKK1抑制肾间质纤维化，这清楚地强调了Wnt/β-catenin信号通路在肾间质性纤维化发病机制中的典型作用。
简明方法
动物
体重约18-22g的雄性CD-1小鼠购自Harlan Sprague-Dawley（印第安纳州印第安纳波利斯）。如前所述，UUO是使用既定方案执行的。38假手术小鼠被用作正常对照。在手术后的不同时间点，各组小鼠(n个=5）处死，取肾进行各种分析。用于传递人类DKK1基因，裸DKK1表达质粒（pFlag-DKK1；由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Xi He博士提供）11在UUO前（第-1天），使用基于流体动力学的方法，以1 mg/kg体重静脉注射体内如前所述，基因转移方法。20,21对照UUO小鼠以相同的方式注射空载体pcDNA3质粒。按照上述方案建立阿霉素肾病小鼠模型。19简单地说，给雄性BALB/c小鼠（Harlan Sprague-Dawley）注射通过尾静脉注射阿霉素（盐酸阿霉素；西格玛，圣路易斯，MO），剂量为10 mg/kg体重。阿霉素注射后5周处死小鼠，收集肾组织进行各种分析。匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准了动物实验方案。
逆转录聚合酶链反应
根据制造商规定的方案，使用TRIzol试剂从肾组织中制备总RNA（Invitrogen，Carlsbad，CA）。RNA逆转录后，cDNA被用作PCR反应的模板，使用基因特异性引物对。在线性范围内使用了大约25到30个周期进行放大。一些实验是在不添加RT的情况下进行的。在使用密度计量化带强度后，在归一化为β-肌动蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶后，计算mRNA的相对稳态水平。补充表3给出了引物组的序列。
Western Blot分析
如前所述，采用常规程序进行肾组织匀浆的制备和蛋白质表达的Western blot分析。39主要抗体来自以下来源：Anti-Wnt4（AF475；明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）；抗Wnt7a（sc-26361）、抗c-Myc（sc-764）和抗Twist（sc-15393；圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯）；抗β-catenin（cat.no.610154；BD Transduction Laboratories，San Jose，CA）；抗Flag（M2；F3165）和抗α-SMA（克隆1A4）（Sigma）；和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Ambion，Austin，TX）。
免疫组织化学和免疫荧光染色
按照既定方案对肾脏切片进行免疫组织化学染色。40使用Vector M.O.M.免疫检测试剂盒，用多克隆兔抗β-连环蛋白抗体（ab-15180；马萨诸塞州剑桥Abcam）和多克隆兔抗血清S100A4（FSP-1）抗体（A5114；丹麦Glostrup DakoCytomation）对石蜡包埋切片进行染色，根据制造商规定的协议（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）。根据既定程序进行间接免疫荧光染色。39简单地说，肾脏冷冻切片分别与抗α-SMA、I型胶原（目录号1310-01；南部生物技术，伯明翰，阿拉巴马州）和纤维连接蛋白（目录号610078；BD转导实验室）的特异性一级抗体孵育，然后用花青素Cy3-结合二级抗体染色（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）。用装有数码相机的尼康Eclipse E600显微镜（纽约州梅尔维尔）观察载玻片。用非免疫正常对照IgG代替一抗作为阴性对照，无染色。如前所述，通过基于网格计数的计算机辅助形态分析对染色进行量化。41
DKK1蛋白水平的定量测定
使用特定的DKK1检测试剂盒（R&D Systems）通过ELISA定量测定血浆和组织中DKK1蛋白水平。该ELISA试剂盒检测人类（外源性）和小鼠内源性DKK1蛋白。从注射pFlag-DKK1表达载体或pcDNA3质粒的小鼠中收集血浆样品。如前所述，为了测定组织中DKK1的水平，小鼠的肝脏和肾脏在含有20 mM Tris HCl（pH 7.5）、2 M NaCl、0.1%吐温-80、1 mM EDTA和1 mM PMSF的提取缓冲液中均质。4219000×离心后克根据制造商规定的方案，在4°C下持续20分钟，回收上清液用于DKK1分析。总蛋白水平使用双氰尿酸蛋白检测试剂盒（Sigma）测定。
苦味酸红染色与形态分析
为了评估胶原蛋白沉积，将3μm石蜡包埋组织切片用苦味酸红染色。切片在55°C下烘烤1 h，脱水，用苦味素红溶液（饱和苦味酸中0.1%天狼星红）染色18 h，然后用0.01 N HCl处理2 min，脱水，和盖卡瓦支座。常规程序进行Masson三色染色。染色切片用配备数码相机的尼康Eclipse E600显微镜进行检查（纽约州梅尔维尔）。如前所述，为了估算间质体积，对苦味酸红染色切片进行了计算机辅助形态计量分析。40简单地说，一个包含117（13×9）个采样点的网格被叠加在皮层高功率场（×400）的图像上。计算间隙上的网格点数量（间隙体积指数），并将其表示为所有采样点的百分比。对于每个肾脏，以盲法分析10个随机选择的非重叠区域。
组织羟脯氨酸含量的定量测定
为了定量测量肾脏中的胶原蛋白沉积，通过对从肾脏样品中提取的水解物中的羟脯氨酸进行生化分析来估算组织总胶原蛋白。这项检测的依据是，动物组织中的羟脯氨酸基本上都存在于胶原蛋白中。简单地说，肾脏样品在110°C下干燥48小时，然后准确称重。在110°C下，在含有2 ml 6 N HCl的密封氧气吹扫玻璃安瓿中水解干肾24小时。根据前面描述的技术，对水解产物中的羟脯氨酸含量进行化学定量。38,43组织羟脯氨酸含量表示为μg/mg干肾重量。
统计分析
使用SigmaStat软件（加利福尼亚州圣拉斐尔Jandel Scientific）对数据进行统计分析。采用单因素方差分析和Student-Newman-Kuels检验对各组进行比较。P（P）<0.05被认为是显著的。
致谢
这项工作得到了国家卫生研究院拨款DK061408、DK064005和DK071040的支持。
工具书类
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