人类巨细胞病毒（HCMV）是一种普遍存在的机会性病原体，是疱疹病毒科病毒家族(1,44). HCMV感染通常无症状，但幼稚或免疫抑制的个体，如新生儿、艾滋病患者和移植受者，往往表现出严重的疾病(1,44). HCMV是一种混杂的病原体，能够进入并引发几乎所有被测脊椎动物细胞类型的感染。同样，疾病几乎可以发生在人体的每个器官系统和细胞类型中(1,44).
HCMV进入如此广泛的细胞类型的能力需要几个病毒编码的包膜糖蛋白与多个细胞表面受体的协同作用(15). 一般来说，疱疹病毒的进入是非常复杂的，也不是很清楚。对于HCMV，最初的附着步骤涉及糖蛋白M（gM）和gB，两者都与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）结合(17,33). 然后病毒迅速转移到与一个或多个细胞受体更稳定的对接作用(15). 最近发现，gB能够与特定整合素异二聚体相互作用，这一步骤大大增强了HCMV的进入(21). 也有报道称，gB与表皮生长因子受体相互作用，介导病毒进入(62,63)尽管我们的实验室(28)和其他(13)尚未证实这些发现。在病毒进入的最后阶段，病毒和细胞膜融合，将被膜蛋白和衣壳释放到细胞质中。这一融合事件被认为需要gB以及gH/gL复合物(6,35,46,58,59). gB与β1整合素的相互作用可能通过一些未知机制激活其融合活性(21; A.L.Feire和T.Compton，未发表的数据）。此外，αVβ3整合素最近也被鉴定为gH的细胞受体(62)并可能需要激活其融合活性。
gB，病毒包膜上丰富的糖蛋白(61)人类疱疹病毒中最保守的糖蛋白，在HCMV进入过程中起着关键作用，因为它被认为参与最初的病毒连接步骤和第二个更稳定的连接步骤，以及融合事件本身（参考文献综述15). 支持gB附着作用的证据包括可溶性gB（gB）结合肝素的能力，肝素是HSPG的可溶性模拟物(17,34). 此外，gB对细胞表现出两步结合动力学，即蛋白质最初与可溶性肝素分离，但很快对肝素洗液的去除产生抵抗。这表明gB在附着过程中从一个受体（可能是HSPG）移动到另一个受体，可能是细胞整合素(7). 支持细胞整合素在HCMV进入过程中作用的证据包括gB特异性结合β1整合素的去整合素样结构域（DLD）(21; Feire等人，未发表）。
HCMV gB抗体，包括DLD抗体和特异性整合素异二聚体抗体，能够有效中和附着后阶段的病毒进入，表明gB和整合素参与融合事件(23,48; Feire等人，未发表）。此外，与其他gB同源物相比，如单纯疱疹病毒1型（HSV-1）gB，其在病毒进入中具有明确的作用，HMCV gB很可能也充当病毒的融合介质。最后，gB包含一个七肽重复区，该重复区预计会形成一个α螺旋卷曲线圈，常见于许多I类病毒融合蛋白中(41). 模拟HCMV gB七肽重复区的合成肽可有效抑制病毒进入，而不会干扰病毒的附着，推测在病毒融合水平(19,41).
除了在病毒进入和融合中的作用外，gB还被认为是病毒在细胞间传播所必需的(23,46,48). 在斑块形成过程中，病毒粒子被认为直接通过细胞接触或细胞连接传播（参考文献综述30). gB在HCMV细胞间传播中作用的证据是间接的，包括gB中和抗体防止感染细胞中斑块形成的能力(23,46,48). 然而，来自其他疱疹病毒的gB蛋白，包括HSV-1和HSV-2、伪狂犬病病毒（PRV）、EB病毒（EBV）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），也需要用于细胞间传播(25,45,50,52,60).
来自各种疱疹病毒的gB蛋白也被认为是介导病毒粒子组装和从感染细胞中流出所必需的。疱疹病毒的流出被认为涉及内核膜的初始包膜步骤，然后是外核膜的去发育步骤，最后是高尔基体衍生膜的再发育步骤，然后含病毒的小泡与质膜融合，将病毒释放到细胞外(43). 据推测，病毒糖蛋白的融合活性是最初被包裹的颗粒与外核膜融合并释放到细胞质中所必需的（参考文献综述43). 据报道，PRV、EBV和KSHV都需要gB来进行病毒粒子出口(37,39,49). 然而，关于HSV-1的报告以及另一份相互矛盾的关于PRV的报告表明，尽管HSV-1存在轻微缺陷，但gB并不是离开感染细胞的绝对必要条件(11,20,52,53). 对于HSV-1，病毒粒子包膜上的gB或gH似乎足以介导病毒粒子的退出；然而，缺乏这两种糖蛋白的突变体无法释放到细胞质中(20).
除了HCMV gB的融合活性外，该蛋白还启动多种信号事件，即使没有其他病毒成分（参考文献中综述4). HCMV附着和进入诱导先天性免疫反应的激活，包括干扰素反应和炎症细胞因子诱导（参考文献综述4). gB已被证明与Toll样受体2结合，可能导致炎症细胞因子的诱导(5); 然而，干扰素应答的激活机制目前尚不清楚。此外，在进入过程中，可能通过gB与β1整合素结合，通过其DLD和/或gH与β3整合素的结合，诱导细胞骨架重排和激活黏着斑激酶(21,62; Feire等人，未出版）。
基因分析是确定病毒感染中功能作用的有力工具。细菌人工染色体（BAC）系统的最新发展已被证明是反向遗传学研究的巨大资产；然而，与所有诱变系统一样，它是有限的。除非突变能够得到有效的补充，否则基本基因突变就无法被分离和繁殖。到目前为止，所有补充gB缺失病毒或任何必要的HCMV糖蛋白敲除的尝试都没有成功。为了进一步明确gB在HCMV生命周期中的作用，我们构建了一个BAC质粒，该质粒包含一个半乳糖操纵子基因取代编码gB的UL55基因，高尔克（pAD/CreΔUL55）。将该ΔUL55 BAC转染到表达gB的正常人皮肤成纤维细胞（NHDF-gB）中，弥补了UL55基因的缺失，产生了病毒基因组中UL55基因缺失但病毒表面野生型gB假型的感染病毒（ΔUL55-gB HCMV）。当未完成的NHDF感染ΔUL55-gB HCMV时，检测到所有阶段的基因表达，并向上清液中释放大量的DNA酶抗性病毒基因组，这表明病毒在没有gB的情况下会流出。对这些ΔUL55 gB-null病毒粒子进行梯度纯化，并证明其含有其他病毒粒子结构蛋白，包括gH和被膜蛋白pp150、pp71和pp28。使用gB-null病毒，我们发现HCMV可以在没有gB的情况下附着到细胞上，也可以附着到含有野生型gB的病毒上，但该病毒是完全非感染性的，这证实了gB是病毒-细胞融合所必需的。然而，通过聚乙二醇（PEG）处理，这些gB-null病毒可能在化学上被迫与NHDF融合，PEG人工诱导邻近细胞膜融合，从而导致即时早期（IE）基因表达。此外，在NHDF斑块覆盖试验中，ΔUL55-gB病毒无法在细胞间传播，这表明gB也是病毒细胞间传播所必需的。这些遗传数据补充了先前的方法，并证明了gB介导进入，而非退出。此外，这是首次报道HCMV糖蛋白突变体的成功互补，并建立了使用互补系统在病毒感染背景下检测必需糖蛋白突触的能力。
材料和方法
细胞系和病毒。
NHDF从Clonetics（加利福尼亚州圣地亚哥）购买。NHDF和293T细胞在37°C和5%CO中生长2在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Invitrogen，Carlsbad，CA）中添加10%胎牛血清（FBS）（HyClone，Logan，UT），1%我-谷氨酰胺（Invitrogen）和1%青霉素-链霉素-安非他命B（马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker）。HCMV株AD169、AD169 BAC和pAD/Cre(66)，是Thomas Shenk（普林斯顿大学）的礼物，是pAD/CreΔUL55和pAD/CreΔUL55R的野生型亲本，如前所述，均在NHDF中繁殖(16).
抗体。
小鼠单克隆gB抗体27-78和58-15是William J.Britt（阿拉巴马-伯明翰大学）慷慨赠予的礼物，此前已有描述(三,9,56). 可识别HCMV IE基因（IE1-72和IE2-86）的小鼠单克隆抗体1203购自Rumbaugh-Goodwin癌症研究所（佛罗里达州种植园）。小鼠单克隆抗体UL44（ICP36）购自Virusys Corporation（马里兰州Sykesville）。先前描述了兔多克隆gH抗体6824(14). 小鼠抗pp71（2H10-9）、pp28（CMV 157）和pp150（CMV 127）的单克隆抗体是Robert F.Kalejta送给我们的一份礼物，之前已有描述(31,47). 山羊抗鼠和山羊抗兔辣根过氧化物酶二级抗体购自皮尔斯生物技术公司（伊利诺伊州罗克福德）。
逆转录病毒的产生和转导。
先前描述了gB逆转录病毒载体pCMMP-UL55-IRES-GFP(36). 编码小鼠白血病病毒Gag-Pol蛋白的载体pMD-gagpol和编码水泡性口炎病毒gG的载体pMD-G是Richard C.Mulligan（哈佛医学院）赠送的礼物。如前所述，产生了重组逆转录病毒(36). 简单地说，293T细胞是用磷酸钙法在100毫米的平板上转染的。在转染后48和72小时收集逆转录病毒，并通过45μm过滤器过滤，并在−80°C下冷冻储存。为了将UL55基因逆转录病毒递送到细胞中，将重组逆转录病毒与亚流畅低传代NHDF在8μg/ml聚布伦和含有10%FBS的最低量DMEM存在下孵育过夜。将逆转录病毒去除并用含有10%FBS的DMEM代替。达到汇合后，细胞传代后再进行第二轮转导。未通过耐药性、分选或克隆选择选择细胞，但在所有实验中使用了包含不同程度稳定gB表达的混合群体。在第20代之后未使用细胞，因此制备了新转导的低通细胞。
pAD/CreΔUL55和pAD/CreΔUL55R的施工。
pAD/Cre的UL55基因(66)已通过将其替换为删除高尔克使用红色如前所述的复合方法(64). pGalK是Neal Copeland（美国国家癌症研究所）的礼物，通过PCR引物扩增产生重组选择盒高尔克包含UL55基因同源臂（引物对A）（表). 在PCR之后，用DpnI（New England Biolabs，Ipswich，MA）消化重组盒并凝胶纯化。进行第二轮PCR，然后进行乙醇沉淀和水中再悬浮。重组盒被电穿孔成细菌菌株SW102，该菌株来自Neal Copeland，含有pAD/Cre，并在42°C下热休克20分钟以诱导红色重组蛋白。选择重组子是为了能够在最小培养基上使用半乳糖作为碳源，并通过在MacConkey半乳糖平板上划线进行验证。为了产生回复物，使用引物对B通过PCR产生野生型UL55重组盒（表). 将重组盒电穿孔到SW102细菌中，该细菌含有如上所述的热休克的pAD/CreΔUL55。在含有甘油作为碳源的最小培养基中，选择恢复到野生型的重组体，以抵抗2-脱氧半乳糖。
表1。
| 底漆对 | 引物名称 | 顺序一 | 生成的产品长度（bp）/片段 |
|---|
| 一 | gB51-100型高尔克F类 | 5′-CTGTCTGGGTGCTGGTTTCCTCCTAGTACTCCCATGCAATTCTTCCTGTTGACAATTATCCG公司-3′ | 1,331/高尔克复合盒 |
| gB2622-71型高尔克R（右） | 5′-TGCGATGTCGCAGCGCGTCATGCAGGTTAGGCTTTCTGTCCCTTGTCCTGCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT公司-3′ |
| B类 | gB1回收基金 | 5′-GGATCTCGGTGCCGTGGTAGTCTGC-3′ | 2701/UL55复合盒 |
| 全球B2RecR | 5′-TCTCTTCGTCGGAGTCTTTCAA-3′ |
| C类 | ul56英尺 | 5′-CTCCTCCTCGACTGTGTGTTCC-3′ | 2806/UL56-UL55或1526/UL56-高尔克-UL55碎片 |
| UL55R型 | 5′-TCTCTTCGTCGGAGTCTTTCAA-3′ |
| D类 | UL55SoF标准 | 5′-ACGCGACAAGTTTTC-3′ | 598/UL55南方探头 |
| UL55SoR标准 | 5′-CCGCGCAACGTGTCATAGGTG-3′ |
| E类 | 高尔克SoF公司 | 5′-GTTCTGCCGCGATTGATTAT-3′ | 599/高尔克南方探测器 |
| 高尔克SoR公司 | 5′-AGGCTCTGCTGCTGGAAGAAAC-3′ |
使用Spin Doctor BAC Prep Kit（俄亥俄州牛津Gerard Biotech）纯化重组BAC。为了验证重组的正确性，使用引物对C通过PCR扩增UL56-UL55基因（表). BAC用EcoRI（新英格兰生物实验室）消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。Southern印迹检测到UL55和高尔克重组BAC消化物中的基因。使用PCR引物对D和E产生Southern印迹探针（表)对于UL55和高尔克基因。使用从Mirus Bio Corporation（威斯康星州麦迪逊）购买的HybQUEST Complete（DNP）系统套件对探针进行标记，并根据制造商的说明进行Southern印迹。
BAC质粒的电穿孔和感染性ΔUL55-gB HCMV的传播。
为了从BAC质粒中产生病毒，将15μl纯化的pAD/Cre、pAD/CreΔUL55或pAD/CureΔUL55R与1μg HCMV pp71表达质粒（pCGN-HA-pp71）混合[31])和5×106无血清DMEM中总体积为265μl的NHDF或NHDF-gB，并在带有设置为260 V和960μF的4-mm-gap试管（Bio-Rad）的基因脉冲器中电穿孔。电穿孔后，将细胞接种在含有10%血清的培养基中，置于100 mm的培养板中，第二天提供新鲜的含血清培养基。当达到汇合点时，细胞以1:2传代。电穿孔后约3周，用结晶紫染色细胞，以观察斑块形成，或培养细胞，直到达到80%至100%的细胞病变效果。此时收集了含病毒的上清液。
增长曲线。
对于单步生长曲线，1.5×10512孔板中的NHDF或NHDF-gB/孔在5个PFU/细胞的多重感染（MOI）下被感染。每隔24小时收集感染细胞上清液6天。对于多步增长曲线，1.5×10512孔板中的每孔细胞以0.01 PFU/细胞的MOI感染病毒。每隔3天收集感染细胞上清液21天。细胞上清液在−80°C下储存，直到实验结束。通过离心去除细胞碎片，并通过斑块试验测定病毒滴度。除ΔUL55-gB生长曲线外，每个时间点的感染均为一式三份。
SDS-PAGE和免疫印迹。
在含有1%3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨]-1-丙磺酸（CHAPS）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中收集细胞（西格玛，圣路易斯，密苏里州）。以牛免疫球蛋白G为标准，使用Bio-Rad（Hercules，CA）蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。在十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶负载缓冲液中煮沸等量的总蛋白，并进行SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），然后进行Western免疫印迹。
实时PCR。
使用QIAamp Mini-Elute virus Spin Kit（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）从病毒上清液或感染细胞裂解液中提取DNA。DNA在50μl无核酸酶水中洗脱（Ambion，Austin，TX）。如前所述，使用引物对pp549s和pp812as以及UL83 6-羧基荧光素-6-羧基四甲基罗丹明探针对病毒基因组进行定量(22). 使用pCGN-HA-pp65根据已知UL83拷贝数的标准曲线确定未知样本值(2). PCR混合物含有5、2.5或1.25μl提取的DNA；50 nM引物和探针；12.5μl Taq-Man通用PCR主混合液（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）；以及总体积为25μl的无核水。在ABI 7900HT上运行实时PCR，并使用SDS 2.2.1程序分析数据。
免疫荧光。
为了检测转导后的gB，将12孔板盖玻片上的NHDF固定在PBS中的3%多聚甲醛（PFA）中，并使用抗体27-78进行免疫荧光分析。检测HCMV感染后IE基因的表达，1.5×105用HCMV感染12孔板中的细胞/孔，并在感染后24小时，将细胞固定在3%PFA中，并使用抗体1203通过免疫荧光分析IE基因表达。对于IE扩散分析，如上所述用HCMV BAC质粒电穿孔细胞。电穿孔7天后，将细胞传代并将其置于12孔板的盖玻片上。一周后，将细胞固定在3%PFA中，并使用抗体1203的间接免疫荧光分析IE基因的表达。Alexa Fluor山羊抗鼠594二级抗体和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）购自Molecular Probes（Eugene，OR）。
病毒出口分析。
NHDF感染AD169或ΔUL55-gB病毒，或NHDF-gB感染ΔUL55/gB病毒（MOI为1.0 PFU/ml）。感染后6天，收集受感染的细胞上清液，通过离心法去除细胞碎片，对于实时PCR，使用DNase I去除任何污染DNA（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）在37°C下消化30分钟。提取上清液中的DNA并进行分析，以通过上述实时PCR检测病毒基因组。为了纯化释放的病毒，将受感染细胞上清液在20%山梨醇缓冲垫上造粒浓缩，然后以20%-70%山梨醇梯度带状。通过SDS-PAGE和免疫印迹分离并分析病毒带，以检测上述gB（58-15）、gH、pp28、pp71和pp150。
附着分析。
AD169、ΔUL55-gB或ΔUL55 gB-null HCMV（含或不含可溶性肝素（100μg/ml；Sigma，St.Louis，Mo））与NHDF在12孔板中孵育，12孔板的基因组拷贝数与实时PCR在4°C下测得的相同。病毒在4°C下附着1小时，然后用无血清DMEM清洗三次。将细胞在PBS中的1%CHAPS中裂解，提取DNA并通过实时PCR进行分析，以检测病毒基因组，如前所述。
聚乙二醇分析。
允许AD169、ΔUL55-gB或gB-null病毒在37°C下结合并进入细胞1小时。病毒被清除，细胞在无血清DMEM中清洗三次，或在无血清DMAM中降低PEG 8000浓度（50%、25%和12.5%）。清洗细胞后，将含有2%FBS的DMEM添加到细胞中，并将细胞恢复到37°C。感染后24小时，细胞固定，如前所述，通过间接免疫荧光检测IE基因表达。
牙菌斑覆盖层。
在37°C条件下，用10倍稀释的ΔUL55-gB HCMV感染六孔板中的NHDF 2小时。用PBS清洗细胞，并在Eagle最低必需培养基中覆盖1%琼脂糖。感染后两天，向细胞中添加含有2%FBS的DMEM。每3天更换一次培养基，直到形成斑块，并用结晶紫固定试剂（0.07%结晶紫，5.55%甲醛，0.5×PBS）对细胞进行染色。
结果
pAD/CreΔUL55和pAD/CreΔUL55R的施工。
使用重组系统创建pAD/CreΔUL55 BAC(64)将UL55 gB基因约2.5kb的区域替换为1.2kb高尔克野生型HCMV AD169 BAC中的基因（pAD/Cre）(66)，如图。PCR引物对A（表)用于生成高尔克重组盒，包含与UL55 gB基因同源的5′端和3′端50 bp。重组盒的5′端对应UL55的核苷酸位置51至100，而3′端对应核苷酸位置2622至2671。因此，复合盒由高尔克该基因两侧各有50 bp的UL55基因序列（图。).
重组HCMV UL55 gB基因替换为高尔克以pAD/Cre为单位。（A） 高尔克使用引物对A对重组盒进行PCR扩增（表)，将50bp的侧翼gB序列添加到高尔克基因。pAD/Cre的～2.7-kb UL55 gB基因通过重组被～1.2-kb取代高尔克基因，产生pAD/CreΔUL55。用氯霉素在含有半乳糖的中小型平板上筛选重组子。（B） 为了还原pAD/CreΔUL55，将2.7 kb野生型UL55重组盒重组到pAD/CreΔUL五十五中，生成pAD/CerΔUL55R。用氯霉素在含有脱氧半乳糖的最小-中等平板上筛选重组子。通过PCR（C）、EcoRI消化（D）和Southern印迹（E和F）证实了所有BAC的正确重组。（C） PCR引物对C（表)对应于UL56和UL55的3′端，在重组过程中未被替换，分别在pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R或pAD/CreaΔUL55中生成2.8或1.5kb PCR片段。（D） 重组后UL55中EcoRI位点的丢失导致7.3kb片段（箭头）的消失，该片段在pAD/CreΔUL55R中恢复。UL55（E）或高尔克（F） 分别在pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R或pAD/CerΔUL55中检测到这些基因（箭头）。
为了生成pAD/CreΔUL55，大肠杆菌携带pAD/Cre的菌株SW102在42℃下进行热休克以表达噬菌体重组蛋白(64)然后是电穿孔高尔克复合盒。在32°C下回收并在半乳糖最小-中等平板上电镀后，通过在MacConkey-半乳糖最低-中等平板上将菌落电镀来筛选菌落。使用引物对C通过菌落直接PCR挑选和筛选亮红色菌落（表)确认UL55和UL56基因的正确插入高尔克pAD/CreΔUL55的基因和世代。野生型HCMV BAC模板产生2803bp的产物，而UL55被高尔克产生1517bp的产物（图。).
还通过重组产生了回复物pAD/CreΔUL55（pAD/CreΔUL55R）（图。). 首先，使用引物对a对野生型UL55重组盒进行PCR扩增，该盒的5′和3′端与pAD/CreΔUL55中剩余的UL55序列相对应（表). 这个重组盒被电穿孔成大肠杆菌SW102在42°C下热休克表达噬菌体重组蛋白(64)并含有pAD/CreΔUL55。在32°C下回收并在M63-2脱氧半乳糖最低培养基平板上电镀后，使用引物对D通过菌落直接PCR筛选菌落（表)UL55和UL56基因，以确认如上所述的正确插入（图。).
通过pAD/Cre、pAD/CreΔUL55和pAD/CreΔUL55R的EcoRI限制性消化证实了所有BAC的正确重组（图。)然后进行Southern blot分析（图。). UL55基因替换为高尔克导致失去EcoRI场地。野生型pAD/Cre的EcoRI消化产生7.3kb片段，当UL55基因被替换为高尔克基因，但该片段再次出现在回复BAC质粒中（图。). 当使用598-bp DNP标记的UL55探针探测EcoRI BAC消化物时，在pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R通道中检测到6.6-kb片段（图。). 当用599-bp的DNP-标记探针探测EcoRI BAC消化物时高尔克探针，仅在pAD/CreΔUL55通道中检测到12.6-kbp片段（图。).
从BAC质粒生成病毒。
为了从BAC质粒中产生病毒，NHDF用无血清DMEM（mock）、pAD/Cre、pAD/CreΔUL55或pAD/CreΔUL55R电穿孔。电穿孔后约7天，当细胞汇合时，传代细胞。为了检测感染细胞，电穿孔14天后通过间接免疫荧光观察IE基因的表达（图。). 结果表明，在没有gB的情况下，病毒基因组的转染可以表达IE，但与野生型或回复型BACs相比，感染不会传播。电穿孔后约3周，细胞用结晶紫固定试剂染色，以观察斑块形成（图。)pAD/CreΔUL55电穿孔后未出现斑块，这证实了其无法传播，并暗示未产生感染性颗粒。
BAC质粒电穿孔成纤维细胞产生HCMV及其生长动力学分析。NHDF在没有BAC质粒（Mock）或带有pAD/Cre、pAD/CreΔUL55或pAD/CureΔUL55R的情况下电穿孔。电穿孔后14天，通过间接免疫荧光检测IE基因表达（A），1周后，用结晶紫染色细胞以检测斑块形成（B）。在MOI为5（C）或0.01（D）的情况下，用pAD/Cre（⧫）或pAD/CreΔUL55R（○）电穿孔产生的病毒感染NHDF。去除含病毒的上清液，并用添加2%FBS的新鲜培养基替换。在感染后的零时间和不同时间，收集上清液并在NHDF上滴定。这些值表示一个实验中三种不同感染的平均值和标准偏差。
在所有实验中，回复子具有与野生型相同的表型，表明UL55的缺失是pADCreΔUL55非塑性表型的来源。为了确认野生型和回复子相似，单步（MOI，0.01 PFU/细胞）（图。)和多步（MOI，5.0 PFU/电池）（图。)在NHDF上进行生长曲线。通过电穿孔野生型pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R产生的感染性病毒以0.01或5.0 PFU/cell的MOI感染NHDF。在感染后的不同时间收集受感染的细胞上清液，并在NHDF上标记，以测定受感染细胞释放的病毒滴度。如图所示。，回复病毒显示出与野生型病毒相似的生长动力学，这表明pAD/CreΔUL55是野生型，除了UL55基因的缺失。
生成表达HCMV gB的NHDF株，以补充pAD/CreΔUL55。
如前所述，gB是HCMV生命周期中的一个重要基因产物，因为UL55基因的缺失会产生非感染性病毒(18,27,65)和图。因此，为了繁殖pAD/CreΔUL55并在病毒表面产生含有野生型gB的HCMVΔUL55-gB病毒，生成了组成性表达gB的允许HCMV的细胞。以前用于检测HCMV糖蛋白诱导的细胞-细胞融合的逆转录病毒转导和表达系统(36)用于生成gB表达细胞系。制备含有pCMMP-UL55-IRES-GFP表达载体的逆转录病毒，并用于转导NHDF，导致HCMV gB（NHDF-gB）的表达（图。). 还产生了含有空载体pCMMP-IRES-GFP的逆转录病毒，并将其用于转导NHDF（NHDF-GFP）作为对照。如图所示。，逆转录病毒转导可用于将gB表达到与HCMV感染细胞（lane HCMV裂解物）中所见水平相似的水平。此外，逆转录病毒转导可用于在大多数细胞中表达gB而无需选择，如通过间接免疫荧光检测gB所示（图。). 细胞转导两次，转导后1周检测表达水平。尽管细胞被稳定转导，但gB的表达随着时间的推移而降低；因此，大约20次传代后产生了新的NHDF-gB。
gB在NHDF中的表达和pAD/CreΔUL55的互补。（A） 用重组（-GFP或-gB）逆转录病毒转导NHDF后，收集细胞并用SDS-PAGE和HCMV AD169感染的细胞裂解物（HCMV裂解物）分析裂解物。将凝胶转移到硝化纤维素中，并使用抗体58-15进行免疫印迹以检测gB。（B） 将转导的细胞贴在盖玻片上，使用抗体27-78通过间接免疫荧光检测gB。（C） NHDF-GFP或NHDF-gB在没有BAC质粒或带有pAD/Cre或pAD/CreΔUL55的情况下电穿孔。电穿孔后约3周，细胞被结晶紫染色，以观察斑块形成。（D） 用BAC电穿孔上清液感染盖玻片上的NHDF，感染24 h后通过间接免疫荧光检测IE基因表达。（E） ΔUL55 gB病毒的单步生长曲线比较(▪) 在NHDF-gB上复制到HCMV回复病毒（•）。细胞以5.0的MOI感染。在感染后的不同时间，收集细胞和上清液，并用NHDF-gB或-GFP滴定。这些值表示一个实验中重复感染的平均值。
为了确定pAD/CreΔUL55是否可以被NHDF-gB补充，NHDF-GFP被模拟电穿孔或pAD/Cre或pAD/CreΔUL55-被电穿孔成NHDF-GFP或NHDF-bb。电穿孔后约10天，仅在pAD/Cre或pAD/CreΔUL55电穿孔到NHDF-gB后，很容易观察到病毒复制引起的细胞病变效应。电穿孔后3周，细胞被结晶紫染色，以便更容易看到斑块（图。). 电穿孔后约4周收集细胞上清液，用于感染新的NHDF。仅在可见斑块形成的电穿孔中检测到IE基因表达。这些数据表明产生了感染性病毒，pAD/CreΔUL55的补充成功（图。). 为了量化ΔUL55病毒的生长动力学，在补充NHDF-gB的过程中，将回复HCMV与ΔUL55-gB感染进行了一步生长曲线比较（图。). 由于ΔUL55病毒在没有gB的情况下不具有传染性，因此在未完成的条件下没有生长曲线。
HCMV基因表达和ΔUL55病毒产生病毒的特性。
将pAD/CreΔUL55电穿孔至NHDF-gB的含病毒上清液用于感染新的NHDF-bb，产生感染性ΔUL55-gB HCMV株。预计在第一轮复制中，ΔUL55-gB感染将导致基因表达的正常阶段，并且在第二轮复制之前，缺陷不会明显，因为在没有gB或gB-null病毒的情况下，病毒无法正确组装和/或流出，也无法感染新细胞。接下来，我们试图测量ΔUL55-gB感染进入未完成NHDF后的基因表达阶段。收集感染的细胞裂解物，通过SDS-PAGE进行分析，并进行免疫印迹检测IE（IE-1和IE-2）、早期（UL44）和晚期（pp28）基因表达。如图所示。，ΔUL55感染正常进行，即使是在非补体细胞中，正如ΔUL55-HCMV第一轮复制期间所预期的那样。然而，当允许感染继续进行时，在未完成NHDF中ΔUL55-gB感染后未发生斑块形成（见图。)类似于电穿孔后的情况。斑块形成不足可能是由于未能组装或释放病毒颗粒（出口缺陷）或释放非感染性病毒颗粒（入口缺陷）所致。
病毒粒子出口不需要HCMV gB。（A） 使用在NHDF-gB上传播产生并经山梨醇缓冲纯化的传染性AD169 HCMV或ΔUL55-gB病毒感染非补体NHDF。在感染后6天收集受感染的细胞裂解物，并通过免疫印迹分析，以检测单轮病毒复制期间IE、早期（UL44）和晚期（pp28）基因的表达。（B） NHDF-GFP或NHDF-gB被HCMV AD169或ΔUL55-gB模拟感染或感染，MOI为1 PFU/细胞。感染后6天，收集上清液并通过离心去除细胞碎片，上清液经过DNase I处理，HCMV DNA通过实时PCR定量，以确定感染后释放到上清液中的抗DNase基因组数量。误差条表示三个实验的标准偏差。（C） 将来自NHDF-GFP或NHDF-gBΔUL55-gB感染的受感染细胞上清液浓缩在20%山梨醇缓冲垫上，然后在20-70%山梨醇梯度中进行梯度纯化。提取病毒条带，并通过Western免疫印迹检测HCMV结构蛋白，包括gB、gH、pp150、pp71和pp28。
细胞间传播需要gB。NHDF-GFP或NHDF-gB感染HCMVΔUL55-gB病毒稀释液。取出病毒接种物，用plaquing培养基覆盖细胞。感染后约3周，细胞被结晶紫染色，以观察斑块形成。
由于已知病毒糖蛋白在这两个步骤中都是必需的，我们首先询问HCMV gB是否是病毒成熟、组装和/或在感染细胞中离开病毒所必需的。对于疱疹病毒，gB在病毒流出中的作用在不同亚家族之间似乎有所不同，需要更多的数据来完成这些研究。为了确定HCMV gB是否需要用于病毒粒子的组装和排出，我们询问是否可以在没有gB的情况下产生病毒粒子。NHDF-GFP或NHDF-gB感染ΔUL55-gB病毒或HCMV AD169，MOI为1.0 PFU/cell，收集感染细胞上清液，然后进行DNase I处理，去除病毒内未受保护的外源DNA，并使用实时PCR进行定量。如图所示。在非完整NHDF-GFP中发现ΔUL55-gB病毒感染产生的DNase-resistant基因组水平与NHDF-GFF中AD169感染或NHDF-gB中ΔUL55-gB感染的水平相似，表明gB在病毒从感染细胞中流出中没有明显作用。
为了证实这些结果，将来自NHDF-GFP或NHDF-gB中ΔUL55-gB感染的受感染细胞上清液浓缩在20%山梨醇缓冲垫上，然后在20%至70%山梨醇梯度中进行梯度纯化。收集病毒条带，通过SDS-PAGE分析，并进行免疫印迹以检测病毒体结构蛋白，包括gB和gH以及盖蛋白pp150、pp71和pp28。如图所示。，只有当ΔUL55病毒在补充NHDF-gB中传播时，gB才存在于病毒中。然而，当ΔUL55-gB病毒在未完成NHDF-GFP中传播一次时，可以生成gB-null病毒。这些病毒粒子缺乏gB，但含有其他病毒粒子结构蛋白（gH、pp150、pp71和pp28），这表明，在没有gB的情况下，产生的HCMV粒子在物理上与野生型没有任何区别，除了gB的存在。对gB-null病毒的更完整的蛋白质组学和电子显微镜分析将是未来研究的主题。
无gB情况下HCMV病毒粒子附着和融合的特征。
gB被认为在HCMV进入的多个阶段发挥作用，包括在最初与HSPG连接的第一个步骤中与细胞的连接，以及第二个更稳定的抗肝素连接步骤，可能通过结合一个或多个细胞受体(7,17,21,33,62). gB也可能是病毒融合所必需的(23,48). 其他疱疹病毒的gB同源物已被证明参与病毒粒子附着，尽管没有绝对必要(10,38,40)可能是因为其他糖蛋白包含多余的连接功能，足以在缺乏gB的情况下进行补偿。然而，gB的融合活性似乎对所有测试的疱疹病毒都是必需的，但EBV可能是例外，EBV只在病毒中加入少量gB(24). 为了确定gB-null HCMV感染细胞的能力是否是病毒粒子附着或融合水平上的缺陷，首先通过SDS-PAGE和免疫印迹分析相似数量的AD169和ΔUL55-gB病毒粒子，以确定gB并入病毒粒子的水平（图。). 将AD169、ΔUL55 gB或gB缺失病毒的相似基因组拷贝数与NHDF在4°C下孵育。在加入细胞之前，单独添加病毒或与可溶性肝素孵育，作为附着的阳性对照。无血清DMEM单独用作模拟治疗对照。附着后，收集细胞裂解物，并通过实时PCR测定HCMV DNA拷贝数，以确定附着在细胞上的含基因组颗粒的数量。如图所示。虽然与含有gB的病毒相比，gB-nullΔUL55病毒与细胞的粘附可能有轻微缺陷，但gB并非病毒粒子粘附的绝对必要条件。此外，如预期的那样，将gB-null和含有gB-的病毒与可溶性肝素孵育，可抑制约90%的病毒粒子附着。
gB-null HCMV可以附着在细胞上，并含有感染性HCMV DNA。（A） 通过免疫印迹法分析来自等量纯化HCMV AD169和ΔUL55 gB病毒的gB。（B） 用AD169、ΔUL55-gB或ΔUL55 gB-null病毒或用可溶性肝素在4°C下预处理的病毒处理NHDF 1 h。用无血清DMEM洗涤细胞三次，收集细胞裂解液，提取DNA，并通过实时PCR定量病毒基因组。该图代表了三个类似实验中的一个。误差条表示一次实验中三份样品的标准偏差。（C） NHDF感染HCMV AD169、ΔUL55-gB或ΔUL55 gB-null病毒。除去上清液，并用无血清DMEM或含有降低浓度的PEG（50%、25%和12.5%）的无血清DMEM洗涤细胞三次。将添加有2%FBS的DMEM添加回细胞，感染后24 h，用间接免疫荧光法检测IE基因的表达。
我们的数据表明，虽然生产性感染需要gB，但出口和依恋不需要。这意味着gB的主要作用可能是在融合过程中。为了确定如果人工强制gB-null病毒与细胞膜融合，是否可以将病毒基因组传递到细胞核，NHDF与HCMV AD169、ΔUL55-gB病毒或gB-null-virus孵育，然后用不含血清的DMEM或含PEG浓度（50、25和12.5%）降低的无血清DMEM洗涤，膜融合剂(32). 感染后24小时，通过间接免疫荧光检测IE基因的表达。如图所示。如前所述，仅在未经PEG处理的情况下检测到AD169或ΔUL55-gB病毒的基因表达，而未检测到gB-null病毒。然而，我们可以通过PEG治疗用gB-null病毒恢复IE基因表达，这表明如果可以人工强制融合，gB-nul病毒能够在没有gB的情况下介导基因表达。这也进一步证明了这些病毒能够在没有gB的情况下附着到细胞上。
丙型肝炎病毒感染的细胞间传播需要gB。
用gB中和抗体进行的菌斑分析表明，HCMV gB是病毒细胞间传播所必需的，与其他研究充分的疱疹病毒相似(46). 然而，细胞与细胞融合试验表明，gB本身不足以介导细胞与细胞的融合，也似乎不能增强由gH/gL介导的细胞与细胞之间的融合(36). 为了确定HCMV的细胞间传播是否需要gB，使用ΔUL55-gB病毒感染非完整NHDF-GFP或补充NHDF-gB。感染后，用琼脂糖覆盖细胞，大约在感染后2周，对细胞进行染色以观察斑块的形成。如图所示。ΔUL55-gB病毒只有在补充NHDF-gB感染时才会形成斑块，这表明gB是病毒细胞间传播所必需的。
讨论
gB是疱疹病毒家族中最保守的包膜蛋白，这表明它在这些病毒的生命周期中起着重要作用。α-、β-和γ-病毒的缺失突变体，包括HSV-1、HSV-2、PRV、马立克氏病病毒、HCMV、EBV和KSHV，证明了gB对病毒复制至关重要(12,18,26,27,37,42,52,54,55,57,65). 随着BAC系统的发展，疱疹病毒突变体可以非常有效地产生；然而，到目前为止，还缺乏对任何HCMV糖蛋白缺失突变体进行补体的能力，这大大限制了对病毒感染背景下致命gB突变体的研究。在这里，我们描述了gB互补系统的发展，该系统允许我们表征gB-null突变体的表型。它还将允许研究各种可能在病毒背景下难以检测的gB突变体。由于gB对病毒复制至关重要，因此当使用BAC系统时，UL55基因的突变通常会导致无斑表型。我们发现，ΔUL55 BAC质粒可以在表达gB的成纤维细胞中有效增殖，产生带有野生型gB（ΔUL55-gB）的假型ΔUL五十五病毒。
使用单步生长曲线比较了gB表达细胞中ΔUL55-gB复制和回复病毒复制（图。)，证明这两种病毒的复制相当相似。与回复病毒相比，感染后ΔUL55-gB病毒滴度似乎下降较晚；然而，由于NHDF gB代表一系列gB表达，从无表达到高水平表达不等，因此互补不是100%也就不足为奇了。进一步实验高表达与低表达NHDF-gB可能会增强互补性。
在ΔUL55-gB HCMV感染非补体成纤维细胞后，我们发现基因表达水平与野生型HCMV的感染水平相似，表明这些细胞至少最初受到感染。这并不奇怪，因为我们预计病毒复制中的阻塞会发生在感染后期，即在没有gB的情况下无法组装或释放病毒，或者在第二轮复制中，即生成了gB-null病毒，但无法重新进入细胞。
通过在未完成NHDF中传递ΔUL55-gB HCMV一次，我们能够生成gB-null病毒。我们使用实时PCR检测正常成纤维细胞感染ΔUL55-gB HCMV后释放到上清液中的DNase-resistant病毒基因组。据推测，这些DNA抗性基因组代表了完整的gB-null病毒。为了验证这一假设，梯度纯化了这些gB-null、DNase-resistant基因组颗粒，我们发现存在gB以外的病毒结构蛋白，包括gH和各种被膜蛋白。这些数据表明，HCMV gB并不是病毒流出的绝对必要条件，就像PRV和HSV-1等α疱疹病毒一样(11,52,53). 对于HSV-1，似乎gB和gH一起绝对是病毒退出所必需的，这表明它们具有冗余的角色，允许一方在另一方缺席时补偿另一方(20). 然而，对于其他疱疹病毒，如KSHV、EBV，以及第二份关于PRV的相互矛盾的报告，gB似乎确实是病毒粒子离开的绝对必要条件，因为无法分离出缺乏gB的包膜病毒(37,39,49). 因此，虽然gB是疱疹病毒家族中最保守的糖蛋白，但在不同亚家族之间，甚至在亚家族内部，确实存在功能差异。
与HSV-1等其他疱疹病毒相比，HCMV gB可能在病毒进入过程中发挥作用，包括粘附和融合事件。HCMV的支持数据包括gB和细胞表面HSPG之间的相互作用(17,33)表明gB在最初的病毒醚化步骤中发挥作用。gB通过其DLD与β1整合素相互作用的能力也表明gB也可能在二次连接和/或融合步骤中发挥作用(21; Feire等人，未发表）。生成gB-null病毒使我们能够直接测试HCMV附件中对gB的要求。使用基于定量实时PCR-的分析，我们证明HCMV gB不需要病毒附着，因为gB-null病毒能够与含有gB-的病毒一样结合到细胞表面，尽管在没有gB的情况下可能存在病毒结合的小缺陷。与野生型病毒一样，通过与可溶性肝素孵育，可以抑制gB-null病毒的这种初始附着，野生型病毒也会发生这种情况，这可能是因为gM也结合HSPG(17,33). 根据我们的结果，gM可能是参与HSPG初始病毒粒子附着的主要包膜蛋白，因为它也被证明具有显著的肝素结合能力(61); 然而，在生成gM-null病毒之前，尚不清楚gB是否能够补偿病毒附着期间gM的损失。有可能gB可能发挥非必要的辅助作用，在没有gM的情况下，它可能足以或不足以介导病毒粒子附着。对其他疱疹病毒也发现了类似的结果，这表明虽然所有gB同源物都具有一些初始附着能力，这种附着并不是病毒进入所必需的，因为其他糖蛋白可以补偿gB的损失(10,29,38,40). 对于所有疱疹病毒，各种糖蛋白可能都有多余的功能，并且能够在另一种病毒缺失时进行补偿；对于HCMV，gB和gM似乎都参与了病毒吸附。
此外，尽管生成的这些gB-null病毒不能感染NHDF，但可以使用聚乙二醇人工诱导它们融合，从而检测IE基因的表达。尽管这种检测效率低下，而且很难提高效率，因为PEG浓度或孵育时间的增加会导致显著的细胞死亡，但这些数据确实表明，gB-null病毒是完整的，能够附着在细胞上，并含有活性被膜蛋白以及感染性HCMV DNA。然而，它们并不是天生的融合基因。在病毒-细胞和细胞-细胞融合过程中，gB被认为在HCMV生命周期中起融合作用。这方面的证据包括抑制病毒进入而不影响病毒附着的gB中和抗体，即使在附着发生后使用(23,48). 此外，在gB中和抗体存在的情况下进行的斑块分析也表明，gB是病毒细胞间传播所必需的(6,8). 然而，这些抗体可能会干扰融合所需的另一种病毒分子，尽管这不太可能，因为gB在其他疱疹病毒进入病毒时的融合作用得到了很好的证明(24,51). HCMV gB胞质尾部的突变已被证明影响其融合活性；然而，这些实验通常在神经胶质母细胞瘤细胞中进行，其中非gB表达细胞的自发融合可能使解释变得困难(58,59). 最后，在无病毒系统中，gB不足以介导或增强成纤维细胞的细胞-细胞融合(36).
迄今为止，还缺乏gB在病毒-细胞和细胞-细胞融合中作用的直接证据。我们的数据表明，进入病毒细胞需要gB，因为我们可以用ΔUL55-gB HCMV感染正常的成纤维细胞，并且可以检测导致gB-null病毒释放到上清液中的所有阶段的基因表达。这些病毒粒子能够附着在细胞上，但在第二轮复制时，在病毒进入的水平上被阻断，这表明gB是病毒和细胞膜融合所必需的。此外，gB似乎也需要用于病毒的细胞间传播，因为正常成纤维细胞感染ΔUL55-gB HCMV不会导致最初感染的细胞传播和斑块形成，这支持了早期使用gB中和抗体的研究结论(23,48).
总之，我们的数据证实了gB在病毒进入和细胞间传播中的作用，但不在附着或流出中。产生的ΔUL55病毒可作为研究HCMV gB突变的工具，即使是在病毒感染的情况下具有致死表型的突变。希望这些研究也将为其他糖蛋白突变体（包括gM和gH）的互补系统的生成铺平道路。此外，能够生成粘附在细胞上的gB-null病毒将允许对HCMV和gB的信号方面进行各种研究，包括在感染早期诱导固有免疫反应和整合素信号事件。
